Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-schade op te wekken in een subnucleair gebied van een cel met behulp van een confocale fluorescentiemicroscopielaser. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over DNA-reparatie, zoals hoe eiwitten worden gerekruteerd en vastgehouden op plaatsen van DNA-schade. Het grote voordeel van deze techniek is dat het real-time visualisatie van het eiwit van belang mogelijk maakt, zodat het profiel van rekrutering en retentie kan worden opgebouwd.

Begin deze procedure door een kamerslide met de betreffende cellen in een stage top incubator te plaatsen die op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide wordt gehouden. Registreer beeldvelden met behulp van een gecodeerde geautomatiseerde microscooptafel. Selecteer een herkenbaar kenmerk van het kweekvat, zoals de barrière tussen de putjes.

Verzamel een afbeelding en noteer de X-Y locatie. Dit maakt het mogelijk om de X-Y locaties van geselecteerde velden na monstervoorbereiding uit te lijnen en te registreren. Zodra de beeldafstemming is voltooid, selecteer een veld voor micro-irradiatie en focus op het monster.

Voor cellen die fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen, selecteer het brandpuntsvlak met de maximale nucleaire doorsnede in het fluorescentiekanaal van belang. Focus op de maximale doorsnede van de kern is cruciaal omdat het ervoor zorgt dat het brandpunt gecentreerd is op de kern voor het monitoren van de rekrutering van het eiwit van belang naar de plaats van geïnduceerde schade. Selecteer een duidelijk kenmerk binnen de kern, zoals een nucleolus, en beweeg het brandvlak op en neer terwijl u deze verandering in uiterlijk observeert.

Het ware brandvlak zal zich binnen de overgang van licht naar donker bevinden. Om het monster te focussen, selecteert u het brandvlak waarin het geselecteerde kenmerk de scherpste contrast heeft. De volgende stap is om de positie van het veld van belang te registreren.

Maak een regio van belang, of ROI, van drie bij drie pixels in de microscoopsoftware. Plaats deze ROI over de kern van een cel die beschadigd zal worden en stel deze ROI in als de beschadigde ROI. Verzamel een pre-schade afbeelding inclusief de positie van de schade-ROI.

Verkrijg een afbeelding met helder veld in het fluorescentiekanaal voor het eiwit van belang. De cellen zijn nu klaar voor laser micro-irradiatie. Voor deze demonstratie zal de 405-nanometer laser worden gebruikt met 100% vermogen.

De dosis van de 405-nanometer laser wordt geregeld door de scanfrequentie te moduleren en één scan van de geselecteerde schade-ROI uit te voeren. Gebruik in dit experiment acht en 0,5 frames per seconde voor micro-irradiatie bij 405 nanometer. Het selecteren van het juiste laservermogen voor het beschadigen van cellen is cruciaal voor het scheiden van verschillende DNA-reparatieroutes.

Voer time-lapse beeldacquisitie uit van helder veld en fluorescentiekanalen na schade. Pas de duur en frequentie van time-lapse aan om gegevensverzameling te optimaliseren, waarbij het ideaal is om de accumulatie van het fluorescente eiwit op de schade-ROI en zijn dissociatie gedurende de tijdsverloop van het experiment vast te leggen. Nadat het tijdsverloop is voltooid, selecteert u een nieuw veld cellen voor schade en gaat u door met micro-irradiatie en time-lapse beeldvorming totdat het gewenste aantal beschadigde cellen is bereikt.

10 tot 25 cellen per geselecteerde conditie wordt aanbevolen. Om het totale aantal cellen voor immunofluorescentieanalyse te verhogen, beschadig je extra velden binnen het kweekvat om een multi-veld tijdsverloop van de post-schade respons te genereren. Noteer de X-Y locatie van elk veld en het tijdstip waarop de schade is opgetreden.

Cellen kunnen direct na schade worden gefixeerd of worden toegestaan om gedurende geselecteerde tijdsintervallen te repareren voordat ze worden gefixeerd. Om deze analyse te beginnen, open de verkregen afbeeldingen in een beeldanalysetoepassing zoals NIS-Elements. Voor elke cel die wordt gemeten, genereer eerst een referentie-ROI die de kern vertegenwoordigt.

Gebruik een drempelalgoritme op het fluorescentiesignaal dat de pixels omvat die de kern vormen, en converteer vervolgens dit gebied naar een ROI. Maak vervolgens een ROI van zes bij zes pixels en plaats deze over de schade-ROI. Deze grotere ROI is nu de schade-ROI voor analyse.

Voor elke cel die wordt gemeten, noteer de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor de referentie- en schade-ROI's. Voor elke frame van het tijdsverloop, pas de referentie-ROI aan om ervoor te zorgen dat het nucleaire gebied nauwkeurig wordt bedekt door de ROI en pas de schade-ROI aan om ervoor te zorgen dat de beschadigde plek wordt bedekt. Noteer de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het fluorescente signaal binnen elke ROI voor elk frame van het tijdsverloop.

Voor elke cel, normaliseer de gemiddelde schade-ROI fluorescentie-intensiteit naar die van zijn corresponderende referentie-ROI in elk frame van de time-lapse. Hier wordt de gemiddelde nucleaire fluorescentie-intensiteit gebruikt als de referentie-ROI en wordt normalisatie uitgevoerd door de gemiddelde referentie-ROI fluorescentie-intensiteit van de gemiddelde schade-ROI fluorescentie-intensiteit af te trekken. Herhaal de normalisatie voor alle beschadigde cellen evenals voor ten minste twee onbeschadigde controlecellen.

Ten slotte, zet genormaliseerde intensiteitswaarden over tijd om om veranderingen in rekruteringsdynamiek als functie van experimentele behandeling te tonen. Cellen die stabiel XRCC1-GFP tot expressie brengen, werden bestraald en geïmagerd vóór en na schade-inductie. Rekrutering van XRCC1-GFP naar de schade-ROI werd waargenomen en de dynamiek van rekrutering werd gemeten.

De vorming van dubbelstrengsbreuken werd onderzocht met behulp van twee markers. Voor beide markers veroorzaakt de tweede lage dosis-stimulatie bij 355 nanometer geen reactie na vijf minuten en twintig minuten en een zwakke en variabele reactie na tien minuten na bestraling. De tien seconden hoge dosis micro-irradiatie bij 355 nanometer induceert een verhoogd fluorescent signaal binnen de schade-ROI na vijf, tien en twintig minuten na bestraling dat na veertig minuten wordt verminderd.