Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen
30 oktober 2017
Dit protocol wordt beschreven hoe retinale pigment epitheliale cellen (RPE) uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode gebruikt een combinatie van factoren die de groei en de kleine molecules om direct de differentiatie van stamcellen in onvolwassen RPE in veertien dagen en volwassen, functionele RPE na drie maanden.
Het algemene doel van deze methode is om de differentiatie van pluripotente stamcellen effectief te richten in retinale pigmentepitheelcellen in een homogene laag. Deze methode helpt vragen te beantwoorden op het gebied van retinale en oogonderzoek, zoals hoe de retina zich ontwikkelt en hoe een stamcelziektemodel kan worden vastgesteld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze sneller en efficiënter is dan spontane methoden.
Deze methode gebruikt een combinatie van groeifactoren en kleine moleculen om de differentiatie van stamcellen te richten om in 14 dagen onrijpe RPE te worden en na drie maanden volwassen functionele RPE. Demonstratie van delen van de procedure zal worden uitgevoerd door Cassidy Arnold, de associate director van het laboratorium voor stamcelbiologie en -techniek aan UC Santa Barbara. Om deze procedure te beginnen, laat stamcelkolonies groeien in feeder-vrije, serumvrije omstandigheden tot ongeveer 80%confluence voordat ze worden overgeheveld.
Bedek vervolgens een 12-well plate met extracellulaire matrix-gebaseerde hydrogel volgens de aanbevelingen van de fabrikant en laat het een uur op kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius staan. Daarna verdeel het volume van het retinale differentiatiemedium en PBS zonder calcium of magnesium dat nodig is voor dag nul en verwarm ze in een waterbad tot 37 graden Celsius. Voeg vervolgens de groeifactoren toe aan het verwarmde RDM en breng EDTA naar kamertemperatuur.
Verwijder indien nodig alle gedifferentieerde kolonies met behulp van een P10 pipettip op basis van morfologie van de stamcellen die zullen worden overgeheveld voor differentiatie. Fibroblastische cellen tussen kolonies en de ondoorzichtige cellen binnen kolonies geven de gedifferentieerde cellen aan die moeten worden verwijderd. Manuele verwijdering van cellen is een van de meest kritische stappen van het protocol omdat het starten met een volledig ongedifferentieerde stamcelpopulatie een efficiëntere verrijking mogelijk maakt.
Passeer vervolgens een enkele well van een zes-well plate in vier wells van een 12-well plate door het medium van de stamcellen af te zuigen en de wells eenmaal te wassen met twee milliliter voorverwarmde PBS. Aspiseer daarna de PBS en spoel elke well drie keer met één milliliter EDTA per well. Kantel vervolgens de plaat voorzichtig en zuig de EDTA af.
Agiteer de plaat op geen enkele manier om te voorkomen dat de cellen te vroeg worden opgeheven. Voeg na de derde wasbeurt opnieuw één milliliter EDTA toe en incubeer de plaat bij kamertemperatuur in de kap gedurende drie tot vijf minuten. Verstoor de plaat niet tijdens deze incubatie.
Zuig daarna de EDTA af en voeg één milliliter RDM per well die geplaatst zal worden plus 0,5 milliliter extra medium toe. Was bijvoorbeeld één well van een zes-well plate met 4,5 milliliter RDM om op vier wells van een 12-well plate te plateren. Gebruik vervolgens een cell scraper om de cellen voorzichtig los te maken.
Tritureer de cellen in RDM door vijf keer op en neer te pipetteren in de well en voltooi deze stap snel om heraanhechting aan de plaat te voorkomen. Plaats in een conische buis. Dissocieer grote cellenklontjes maar tritureer niet tot een enkele-cel suspensie.
Verdeel de cellen gelijkmatig in de pipette en voltooi deze stap snel om heraanhechting aan de plaat te voorkomen. Gebruik indien gewenst een lichte microscoop om de grootte van de cellenklontjes te observeren. Zaai vervolgens de cellen op ECM-gecoate, 12-well platen.
Til de plaat heen en weer om de cellen gelijkmatig over de wells te verdelen en plaats deze in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5%CO2 tot de volgende mediumverversing. Coat in deze procedure een zes-well plate met groeifactor-verminderd ECM volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat het een uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius staan.
Deel vervolgens de hoeveelheid DPBS die nodig is en één milliliter RDM per well van verrijking af en verwarm ze tot 37 graden Celsius in een waterbad. Breng het trypsine-achtige enzym naar kamertemperatuur en verwarm de vereiste hoeveelheid RPE ondersteunend medium tot 37 graden Celsius. Voeg daarna een antimicrobiële reagent en ROCK-remmer toe aan het RSM om een eindconcentratie van 0,5x antimicrobieel en 10 micromolar ROCK-remmer te bereiken.
Gebruik dit medium gedurende de eerste vier tot zeven dagen om de hechting te verbeteren. Aspiseer vervolgens het gebruikte medium uit alle wells en voeg één milliliter per well voorverwarmde RDM zonder groeifactoren toe. Als nodig, dissecteer en schraap alle niet-RPE cellen weg met behulp van een P10 pipettip onder een dissectiemicroscoop.
Aspiseer na de dissectie RDM en al het cellulaire puin en was ze twee keer met één milliliter voorverwarmde DPBS per well. Voeg vervolgens 0,5 milliliter TDE toe per well van een 12-well plate en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens een cell scraper om de cellen voorzichtig van de plaat te verwijderen.
Tritureer voorzichtig de cellenzymsuspensie door drie tot vier keer op en neer te pipetteren om een uniforme suspensie te creëren. Verdun vervolgens de cellenzymsuspensie in een verhouding van één op tien in de voorverwarmde RSM zonder ROCK-remmer. Centrifugeer de cellensuspensie gedurende vijf minuten bij 173g bij kamertemperatuur.
Aspiseer na vijf minuten het medium van de cellenpellet en resuspendeer de cellen in RSM met 10 micromolar ROCK-remmer. Zeef vervolgens de cellen met behulp van een nylon mesh cell strainer met 40 micrometer poriën. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en bereken de concentratie van cellen in de gezeefde oplossing.
Zaai vervolgens de cellen op de groeifactor-verminderde, ECM-gecoate platen bij één maal 10 tot de vijf cellen per vierkante centimeter in vier milliliter RSM met 10 micromolar ROCK-remmer. Vervang de RSM met 10 micromolar ROCK-remmer 48 uur na celzaaien en vervang het medium verder elke drie tot vier dagen. Stop met het toevoegen van ROCK-remmer aan de RSM na vier tot zeven dagen.
Laat de cellen 28 tot 35 dagen rijpen bij 37 graden Celsius
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om retinaal pigmentepitheelcellen (RPE) te produceren uit pluripotente stamcellen met behulp van groeifactoren en kleine moleculen. Het differentieproces levert onrijpe RPE op in 14 dagen en rijpe, functionele RPE na drie maanden.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Retinaonderzoek
- Celldifferentiatie
Achtergrond
- Het begrijpen van de ontwikkeling van het netvlies is essentieel voor onderzoek naar het oog.
- Het opzetten van ziektemodellen met stamcellen kan helpen bij het bestuderen van netvliesziekten.
- Deze methode is sneller en efficiënter dan methoden voor spontane differentiatie.
- Retinale pigmentepitheelcellen spelen een cruciale rol bij de gezondheid van het netvlies.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het genereren van RPE uit pluripotente stamcellen.
- Om de efficiëntie van celdifferentiatieprocessen te verbeteren.
- Om een kader te bieden voor toekomstige modellering van netvliesziekten.
Gebruikte methoden
- Groeifactoren en kleine moleculen worden gebruikt om de differentiatie te sturen.
- Stamcellen worden gekweekt onder feeder-vrije en serum-vrije condities.
- Hydrogels op basis van de extracellulaire matrix worden gebruikt voor celhechting.
- Cellen worden gepassaged en behandeld met specifieke media voor een optimale groei.
Belangrijkste resultaten
- Onrijpe RPE-cellen worden binnen 14 dagen verkregen.
- Rijpe, functionele RPE-cellen worden na drie maanden bereikt.
- Het protocol demonstreert een verbeterde efficiëntie ten opzichte van traditionele methoden.
- Celmorfologie en aanhechting zijn cruciaal voor een succesvolle differentiatie.
Conclusies
- Deze methode biedt een gestroomlijnde aanpak voor het genereren van RPE-cellen.
- Het biedt potentieel voor het bevorderen van onderzoek naar netvliesziekten.
- Het protocol kan worden aangepast aan verschillende experimentele behoeften in de stamcelbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt een snelle, gerichte differentiatie van pluripotente stamcellen naar homogene lagen retinaal pigmentepitheel (RPE) mogelijk, waarmee een belangrijk knelpunt in de modellering van retinaziekten en therapeutische ontwikkeling wordt weggenomen. Door de afhankelijkheid van spontane differentiatie en handmatige dissectie te verminderen, worden de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor preklinische toepassingen verbeterd. De methode ondersteunt zowel iPSC- als hESC-bronnen, wat disease-in-a-dish-modellen faciliteert en mechanistische risicoanalyse in vroege fasen van ophthalmologische pijplijnen mogelijk maakt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar retinalen ontwikkelingspaden en het testen van therapeutische hypothesen mogelijk in een gedefinieerd, mensrelevant systeem.
- Operationele waarde: Levert een consistente, homogene RPE-monolaag die de variabiliteit bij target-interactie en fenotypische screeningsassays vermindert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt vroege beoordeling van de effecten van verbindingen op de RPE-functie, zoals fagocytose en groeifactorsecretie, waardoor het vertrouwen in de identificatie van lead-verbindingen wordt vergroot.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een schaalbare, reproduceerbare bron van functionele RPE-cellen die geschikt zijn voor high-content imaging en assays op basis van biomarkers.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor handmatige dissectie- en verrijkingsstappen, waardoor de voorbereiding van de assay wordt gestroomlijnd en de actieve werktijd wordt verminderd.
- Translationele waarde: Cryopreservering van tussenliggende cellenbanken maakt langdurige opslag en gebruik op aanvraag mogelijk, wat screeningscampagnes op meerdere locaties en technologietransfer ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Produceert mature, gepolariseerde RPE met functionele kenmerken (fase-heldere randen, polygonale morfologie) na drie maanden, wat ziekterelevante fenotypische analyse mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Gedefinieerde mediumcondities en een passageprotocol ondersteunen GMP-aanpasbare productie voor celtherapie-toepassingen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert preklinische evaluatie van RPE-specifieke eindpunten, zoals fagocytose van het buitenste segment en VEGF-secretie, die cruciaal zijn voor het beoordelen van therapeutische veiligheid en effectiviteit.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinische fase, waardoor de productie van uit stamcellen afgeleide RPE mogelijk wordt voor doelwitvalidatie, assayontwikkeling en mechanische risicoreductie voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurde studies naar de functie van het retinaal pigmentepitheel en ziekteconcepten met behulp van genetisch gedefinieerde iPSC-lijnen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve cellulaire read-outs (bijv. celdichtheid, morfologie, functionele assays) voor compound-screening en target-validatie.
- Analytics: Maakt eiwit- en genkwantificering, fagocytose-assays en secretie-profiling mogelijk om experimentele condities te vergelijken en het werkingsmechanisme te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Biedt een continue toevoer van RPE-cellen voor longitudinale preklinische studies, waardoor in vitro bevindingen kunnen worden overbrugd naar in vivo ziektemodellen.
- Enterprise Reuse: Cryopreservatie van intermediaire banken maakt hergebruik over verschillende projecten mogelijk, waardoor redundante differentie-inspanningen worden verminderd en de efficiëntie van middelen wordt verbeterd.
Operationele impact en impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door een gedefinieerd, uit menselijke cellen afgeleid RPE-model te bieden dat essentiële retinale epitheliale functies recapituleert.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd protocol verbetert de reproduceerbaarheid tussen locaties en gebruikers, waardoor de batch-tot-batch variabiliteit in differentiatie-efficiëntie wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go beslissingen door vroege functionele beoordeling van RPE-gerichte verbindingen mogelijk te maken, wat het risico op uitval in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van oogheelkundige programma's via voorspellende, mens-relevante preklinische gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, passagerings technieken en steriele weefselkweekpraktijken.
- Afhankelijk van extracellulaire matrix hydrogelen, gedefinieerde mediumformuleringen en supplementatie met ROCK-inhibitor voor optimale hechting en overleving.
- Vereist gestandaardiseerde training voor handmatige dissectie en verrijkingsstappen om consistente verwijdering van niet-RPE populaties te garanderen.
- Aanpassing aan alternatieve stamcellijnen kan optimalisatie van de zaaidichtheid en passageringsfrequentie vereisen.
- De lange rijpingstijd (tot drie maanden) vereist continue mediumverversing en toegang tot een incubator, wat invloed heeft op de planning van de doorvoer.
