Name: Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Leer een snelle methode voor differentiatie van retinale pigmentepitheelcellen uit pluripotente stamcellen met groeifactoren en kleine moleculen. Deze techniek levert rijpe, functionele cellen op na drie maanden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door het initiatief van de slinger voor de visie, het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (CIRM; subsidies DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 en TG2-01151), The Vermont Gemeenschap Foundation, het Breaux Foundation, en de Stichting bestrijding van blindheid Wynn-Gund translationeel onderzoek versnelling programma.

1. bereiding van reagentia voor dag 0 tot en met dag 14 van het Protocol <ol><li>de volgende middellange onderdelen voor te bereiden: <ol><li>retinale differentiatie maken 100 mL medium (RDM) door toevoeging van 1 mL van 100 x N2 supplement, 2 mL 50 x B27 supplement, en 1 mL 100 x niet-essentiële aminozuur (NEAA) aan 96 mL Dulbecco &#39; s bewerkt essentiële medium/nutriënt mengsel F12 9 (DMEM/F12).</li>
		<li>Maken 10 mL van de 1 M nicotinamide (NIC) door oplossen 1.221 g van NIC in 8 mL steriel water, vortexing, en het volume tot 10 mL met steriel water brengen. Steriel Filtreer de oplossing.</li>
	</ol></li> <li>De volgende factoren die de groei en de kleine molecules voorbereiden: <ol><li>reconstrueren recombinante muis bekertje, menselijke dickkopf WNT-remmer met signalering traject 1 (DKK-1), en IGF-1 tot 100 µg/mL elke in 0,1% bovien serumalbumine (BSA) in fosfaatgebufferde oplossing (PBS). Aliquot desgewenst en winkel bij-20 ° C gedurende maximaal 3 maanden.</li>
		<li>Reconstrueren FGF-basic 10 µg/mL en recombinante menselijke/muis/rat Activin A tot 100 µg/mL elke in 0,1% BSA in PBS. Aliquot desgewenst en winkel bij-80 ° C gedurende maximaal 1 jaar.</li>
		<li>Reconstrueren SU 5402 (FGF specifieke receptor tyrosine kinase inhibitor) en CHIR99021 (glycogeen synthase kinase 3, GSK-3β, remmer) tot 10 mM in dimethylsulfoxide (DMSO). Aliquot en winkel bij-20 ° C gedurende maximaal 1 jaar of 6 maanden, respectievelijk.</li>
	</ol></li> <li>Verkrijgen van de volgende dag 0 en/of dag 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing (0.2 g EDTA per 1 liter van PBS), 1 X PBS- / - PBS (zonder calcium of magnesium, pH 7.4), 1 x trypsine-achtige dissociatie enzym (TDE), DPBS (Dulbecco &#39; s PBS), RPE ondersteuning van medium (RSM), en Y-27632 dihydrochloride (gebruik op 10 µM).</li>
</ol> 2. : 0 dag van pluripotente stamcel Passage voor differentiatie <ol><li>Grow stamcel kolonies in feeder-vrije, serumvrij voorwaarden tot ongeveer 80% samenkomst voordat passaging. 
	Opmerking: Zie bespreking voor meer informatie over het optimaliseren van deze stap.</li>
	<li>Jas een 12-well plaat met extracellulaire matrix gebaseerde hydrogel (ECMH) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat opstijven gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Aliquot de hoeveelheid RDM en PBS- / - nodig voor dag 0 en warm in een waterbad 37 ° c alvorens groeifactoren toe te voegen. Breng EDTA op kamertemperatuur.</li>
	<li>Toevoegen de groeifactoren die nodig zijn voor dag 0 tot de verwarmde RDM met 10 mM NIC, 50 ng/mL bekertje, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 100 µL van NIC, 5 µl van bekertje, 1 µL van DKK-1 en 1 µL van IGF-1 tot 10 mL van RDM.</li>
	<li>Kiezen voor het verwijderen van alle gedifferentieerde kolonies op basis van morfologie van de cellen van de stam dat zal worden gepasseerd voor differentiatie. Gebruik een P10 Pipetteer tip handmatig verwijderen van de gedifferentieerde cellen. 
	Opmerking: Fibroblastic cellen tussen de kolonies, alsmede de ondoorzichtige cellen binnen kolonies geven aan gedifferentieerde cellen worden verwijderd. Zie de beschrijving voor meer informatie over gedifferentieerde cellen.</li>
	<li>Passage van een enkel putje van een 6-well plaat in 4 putjes van de plaat van een 12-well (1:4). 
	Opmerking: Zie discussie voor meer informatie over het passaging van stamcellen in dit stadium.
	<ol><li>Het medium van de cel van de stam van de cellen van de stam gecombineerd en was de putjes goed eenmaal met voorverwarmde PBS- / - 2 mL.</li>
		<li>Gecombineerd PBS- /- en spoel elke goed driemaal met 1 mL EDTA per putje van de plaat van een 6-well.</li>
		<li>Voorzichtig kantelen van de plaat en de EDTA gecombineerd. De plaat op geen enkele manier om te voorkomen dat voortijdig het opheffen van de cellen niet doen doorroeren.</li>
		<li>Na de derde wash, voeg 1 mL EDTA en Incubeer bij kamertemperatuur in de kap voor 3-5 min. De plaat niet storen tijdens deze incubatie.</li>
		<li>Gecombineerd de EDTA en voeg 1 mL RDM per putje dat zal worden ontpit met 0,5 mL van extra medium. Bijvoorbeeld, wassen 1 goed van een 6-well plaat met 4.5 mL van RDM plaat op 4 putjes van de plaat van een 12-well.</li>
		<li>Gebruiken een cel schraper voorzichtig los van de cellen. Verzamelen van alle cellen in een conische buis en triturate van de cellen in RDM door pipetteren op en neer 5 keer. Grote bosjes van cellen van elkaar gescheiden, maar doen niet triturate aan één celsuspensie. De cellen in de pipet gelijkmatig te verdelen. Voer deze stap snel om te voorkomen dat ingrepen aan de plaat.</li>
		<li>Zaad van cellen op de ECM-gecoate 12-Wells-platen (1 mL celsuspensie per putje).</li>
		<li>Tilt de plaat heen en weer om te verdelen de cellen gelijkmatig over de putten. Voorzichtig plaats in een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 tot de volgende middellange verandering.</li>
		<li>Opmerking het exacte tijdstip. Verandering medium op hetzelfde tijdstip elke dag.</li>
	</ol></li></ol> 3. Dag 1 tot en met 14: toevoeging van groeifactoren <ol><li>dag 1: het medium op alle putjes (1 mL per putje) wijzigen met behulp van RDM met de samenstelling van de groeifactor voor dag 0 (zie stap 2.4).</li>
	<li>Dag 2: het wijzigen van het medium gebruik RDM (1 mL per putje) met 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic 10 ng/mL bekertje, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 100 µL van NIC, 5 µL van FGF-basic 1 µL van bekertje, 1 µL van DKK1 en 1 µL van IGF1 tot 10 mL van RDM.</li>
	<li>Dag 4: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 10 µL van activin A, 1 µL van DKK1 en 1 µL van IGF-1 tot 10 mL van RDM. 
	Opmerking: Constateren dat cellen confluente in dit stadium.</li>
	<li>Dag 6: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A en 10 µM SU 5402. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 10 µL van activin A en 10 µL van SU RDM 5402 tot en met 10 mL.</li>
	<li>Dagen 8, 10 en 12: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A, 10 µM SU 5402 en 3 µM CHIR99021. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, meng 10 µL van activin A, 10 µL van SU 5402 en 3 µL van CHIR99021 10 mL RDM.</li>
</ol> 4. Dag van verrijking van Passage 0 van RPE <ol><li>jas een 6-well plaat met groeifactor verminderd ECMH volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat opstijven gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Aliquot de hoeveelheid DPBS nodig en RDM 1 mL per putje van verrijkings- en warm in een waterbad 37 ° C. Bring de onderzoekingen naar kamertemperatuur en warm nodig volume van RSM, antimicrobiële reagens en Y-27632 tot 37 ° C.</li>
	<li>Toevoegen antimicrobiële reagens en Y-27632 verkrijgen van 0,5 x en 10 µM composities respectievelijk aan RSM. Gebruik van dit medium voor de eerste 4-7 dagen om bijlage.</li>
	<li>Aspirate verbruikte medium uit alle wells en voeg 1 mL per putje van voorverwarmde RDM (geen groeifactoren vereist).</li>
	<li>Handmatig met behulp van een Microscoop ontleden, ontleden en schraap weg alle niet-RPE cellen met behulp van een P10 Pipetteer tip. 
	Opmerking: Zie de sectie van de representatieve resultaten voor voorbeelden.</li>
	<li>Na dissectie, gecombineerd RDM en alle celopmaak puin. Wassen tweemaal met voorverwarmde DPBS per putje 1 mL.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL per putje van de plaat van een 12-well onderzoekingen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten gebruik een cel schraper om voorzichtig de cellen van de plaat. Een P1000 Pipetteer kunt zachtjes triturate de cel/TDE opschorting door pipetteren omhoog en omlaag 3 - 4 keer te maken van een uniforme schorsing.</li>
	<li>Verdun de cel/TDE schorsing 1:10 in voorverwarmde RSM, zonder Y-27632. Centrifugeer celsuspensie bij 173 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het medium van de cel pellet gecombineerd en resuspendeer de cellen in de RSM met 10 µM Y-27632 (1 mL per verrijkt Nou).</li>
	<li>Stam de cellen met behulp van een nylon mesh cel zeef met 40 µm poriën. Tellen van het aantal cellen in een opgegeven volume met behulp van een hemocytometer en bereken de concentratie van cellen in de gespannen oplossing.</li>
	<li>Zaad cellen op de groeifactor verminderd ECM-gecoate platen op 1 x 10 5 cellen/cm 2 in 4 mL RSM met 10 µM Y-27632.</li>
	<li>De RSM vervangen door 10 µM Y-27632 48 h na de cel zaaien en blijven ter vervanging van media elke 3-4 dagen (bijvoorbeeld op maandag en donderdag). Vervang de 10 µM niet na 4-7 dagen Y-27632.</li>
	<li>De cellen om te rijpen voor 28 tot 35 dagen bij 37 ° C en 5% CO 2 toestaan. Blijven ter vervanging van de RSM-elke 3-4 dagen (bijvoorbeeld op maandag en donderdag).</li>
</ol> 5. Rijping: Passage 1 en 2 van RPE Opmerking: volumes zijn geïndiceerd voor 1 goed van een 6-well-plate of een kolf T75, zoals aangegeven door haakjes.
<ol><li>Tussen de dagen 28 tot en met 35 van passage 0, jas een 6-well plaat (T75 kolf) met ECMH volgens de aanbevelingen van de fabrikant.</li>
	<li>Aliquot de hoeveelheid DPBS en RSM nodig en warm in een waterbad 37 ° C. brengen TDE tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Aspirate doorgebracht medium uit putten en wassen elke goed tweemaal met 2 mL (10 mL) voorverwarmde DPBS. 
	Opmerking: Gebruik geen 10 µM Y-27632.</li>
	<li>Gecombineerd DPBS en voeg 1 mL (5 mL) onderzoekingen. Plaats in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 5 min. Na incubatie weergave cellen op een omgekeerde Microscoop te bevestigen de cellen zijn verdragsluitende en loskoppelen.</li>
	<li>Met behulp van een gepaste afmetingen cel schraper, zachtjes de cellen verwijderen vanaf de onderkant van het goed of de maatkolf.</li>
	<li>Een P1000 tip (10 mL serologische Pipetteer) kunt zachtjes triturate de cel/TDE schorsing op en neer 3 - 4 keer te maken van een uniforme schorsing.</li>
	<li>Verdund cel schorsing 1:10 in RSM. Reserveren van 2 mL (5 mL) van RSM spoel van de well/kolf en toevoegen aan de verdunde celsuspensie. 
	Opmerking: Laat niet enzym belichtingstijd maximaal 25 min.</li>
	<li>Centrifugeren van de celsuspensie bij 173 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het medium van de cel pellet gecombineerd en resuspendeer de cellen in 1 mL (5 mL) van RSM</li>
	<li>Stam de cellen met behulp van een nylon mesh cel zeef met 40 µm poriën. Tellen van het aantal cellen in een opgegeven volume met behulp van een hemocytometer en bereken de concentratie van cellen in de gespannen oplossing.</li>
	<li>Zaad van cellen op de ECMH-gecoate platen op 1 x 10 5 cellen/cm 2 in 4 mL (15 mL) van RSM.</li>
	<li>Kunnen de cellen om te rijpen voor 30 dagen. Blijven veranderen de RSM elke 3-4 dagen.</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande procedure (stap 5.2-5.11) op dag 30 tot de passage van de cellen van passage 1 tot 2.</li>
</ol> 6. Creëren van een Intermediate cel Bank: cryopreservatie van Passage 2 dag 3-5 RPE Opmerking: Cryopreserve van cellen, terwijl ze subconfluent (~ 50%) en geen pigment hebben herwonnen.
<ol><li>Op basis van het aantal cellen, het berekenen van het volume van cryopreservatie medium met 10% DMSO moest resuspendeer de cellen bij een concentratie van 3 x 10 6 cellen/mL.</li>
	<li>Volg de stappen 5.2 tot en met 5.8. Resuspendeer de pellet cel in het cryopreservatie medium met 10% DMSO tot 3 x 10 6 cellen/mL en 1 mL van de celsuspensie overbrengen in cryogene flesjes van 1,2 mL.</li>
	<li>Plaats cryogene flesjes in een bevriezing container ontworpen bij-1 ° C/min afkoelen en plaats bij-80 ° C's nachts. Overbrengen in vloeibare stikstof voor langetermijnopslag. 
	Opmerking: Deze cellen worden passage 3 bij het ontdooien. Cultuur van de cellen voor 30 meer dagen voor karakterisering. Zaad passage 3 RPE op 1.5 x 10 5 per cm 2 bij het ontdooien. 2 , 4 , 6 , 7</li></ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Making+Stem+Cells+Retinal%3A+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell-Based+Therapies+in+Combination+with+Substrate+for+the+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).</li>
<li>Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4020-8502-4_1">Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).</li>
<li>Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canonical%2F%CE%B2-catenin+Wnt+pathway+activation+improves+retinal+pigmented+epithelium+derivation+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+xeno-free+derivation+of+retinal+pigmented+epithelial+cells+on+a+novel%2C+synthetic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate.</a> Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).</li>
<li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium%3A+A+Comparative+Study+Between+Cell+Lines+and+Differentiation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).</li>
<li>Choudhary, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+Toward+Retinal+Pigment+Epithelium+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-directed%2C+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li>
<li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+efficient+retinal+pigment+epithelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), New York, N.Y. 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+spontaneous+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).</li>
<li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li>
<li>Croze, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibition+Extends+Passage+of+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).</li>
</ol>

Dr. Clegg is een mede-oprichter van regeneratieve Patch Technologies LLC.

Dit protocol wordt beschreven hoe de epitheliale cellen van de retinale pigment uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode is geoptimaliseerd door het gebruik van beide menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen van een feeder-vrije, serumvrij cultuur-methode. Sinds de eerste isolatie van menselijke embryonale stamcellen in 1998 en de afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) in 2007, een veelheid van cultuur van de cel van de stam methoden zijn ontwikkeld14,15,16, 17. Deze methoden moet voldoende zijn voor de productie van stamcellen kolonies die vatbaar voor deze differentiatie zijn. Er zijn geen bekende beperkingen aan de toepasbaarheid van deze methode goed afgeleide en onderhouden pluripotente stamcellen.
De meest kritische stappen zijn de passaging van stamcellen op dag 0 van differentiatie (stap 2.5) en de mogelijke noodzaak voor handmatige dissectie op dag 14 van het proces (stap 4.5). Bij het uitkiezen van gedifferentieerde cellen uit de koloniën van de cel van de stam verwijderen, verwijzen naar de afbeeldingen in Kent18. Zoals aangegeven, geven de fibroblastic cellen tussen de kolonies en de ondoorzichtige cellen binnen kolonies gedifferentieerde cellen die worden verwijderd moeten voordat u begint met dit protocol18. Alleen niet-gedifferentieerde, opeengepakte kolonies met gedefinieerde randen moeten worden gepasseerd voor differentiatie.
Het aantal zaadjes per putje (stap v2.6.7) de cellen van de stam wordt bemoeilijkt door het feit dat de stamcellen kan niet worden triturated in een enkele celsuspensie bij passage en kan niet nauwkeurig worden geteld met behulp van een hemocytometer. De onderlinge aanpassing van 80% confluente stamcellen is geïndiceerd voor passaging 1 goed van een 6-well plaat in 4 putjes van de plaat van een 12-well. Verschillen tussen stamcellijnen, zoals groei, kunnen invloed hebben op hoe snel de onrijpe RPE bereiken samenvloeiing tussen dagen 0 tot en met 4. De stamcellen zullen produceren RPE ongeacht de precieze samenvloeiing, maar de opbrengst van de cel will be negatively impacted als de cellen ook schaars in dit stadium zijn. De onrijpe cellen RPE moet ongeveer 40-50% heuvels op dag 1 en bijna 100% heuvels van dag 4. Als de cellen niet een confluente enkelgelaagde overdag 4 of 6 produceren, kan het protocol moet worden herhaald op een hogere seeding dichtheid op dag 0. Bijvoorbeeld, als 1 goed van een 6-well plaat was gepasseerd aan 4 putjes van de plaat van een 12-well op dag 0 en de onrijpe RPE zijn niet 100% heuvels op dag 4, verminderen het zaaien op een 1:3 of 1:2 passage op dag 0 of toestaan dat de stamcellen tot meer confluente vóór passaging. Het is essentieel om een consistente seeding dichtheid bij het vergelijken van meerdere cellijnen.
De stap van de handleiding dissectie op dag 14 is alleen nodig wanneer de niet-RPE cellen in cultuur (figuur 2C) aanwezig zijn. Sinds de toevoeging van CHIR99021 aan het protocol vereisen vele pluripotente stamcellijnen weinig tot geen handmatige dissectie. Sommige preparaten hebben een hogere incidentie van neurale patches en het is cruciaal voor het verwijderen van die cellen. Als de RPE niet rendabel bij passage 0 doorgang 3 zijn, is het mogelijk om te herhalen van het protocol van de differentiatie voldoende tijd om alle niet-RPE cellen verwijderen. Dit gebeurt niet vaak, maar hier wordt vermeld om op te merken dat de stap van de dissectie op dag 14 wanneer nodig kan worden geoptimaliseerd.
Er zijn een verscheidenheid van RPE differentiatie protocollen die in kosten, alsmede kweekmethoden, efficiëntie, kwantificering variëren en functionele beoordeling, de laatste geweest grondig herzien2. Wij verkiezen de 14-daagse methode gedetailleerde hier vanwege haar werkzaamheid, het aanpassingsvermogen en de toepasbaarheid op een breed scala van cel lijnen4,7,8. De cryopreservatie stap in dit protocol biedt ook een groot voordeel bij het creëren van een tussenliggende cel bank voor toekomstig gebruik, het vermijden van veel-op-veel variabiliteit in experimenten. Beginnend met slechts 4 putjes van de plaat van een 12-well, is het mogelijk om uit te breiden tot 6-Wells-platen bij passage 0 en T75 kolven bij passage 1 en 2. Bij passage 2 dag 3-5, wanneer de cellen nog steeds subconfluent zijn en niet pigment herwonnen hebben, is het mogelijk cryopreserve van tientallen miljoenen cellen en vervolgens ontdooien de volwassen RPE, aangewezen passage 3-daags 30, om te controleren van RNA expressie, eiwit expressie, groeifactor fagocytose secretie, enz. Ook hebben we de protocollen uit te breiden RPE voor maximaal 13 passages 19opgericht.
Vooruitblikkend, zal deze methode bijvoorbeeld gebruiken voor iPSC modelleren van oogbeschadigingen en/of ziekte en RPE generatie voor cellulaire therapie. Met betrekking tot de iPSC ziekte modelleren, is dit protocol momenteel gebruikt in het lab voor de productie van RPE uit CRISPR-gecorrigeerde lijnen met niet-gecorrigeerde besturingselementen uit de dezelfde patiënt. Dit protocol is verder aangepast aan synthetische substraten en xeno-vrij voorwaarden die handig zijn voor het naleven van de goede fabricagepraktijken die nodig is voor een cellulaire therapie.

De retinale pigment epitheel is een monolayer van gepigmenteerde cellen die cruciale ondersteuning bieden voor researchdieren. Retinale pigment epitheliale cellen (RPE) hebben talrijke functies in visie, inclusief lichte absorptie, voedingsstoffen en ion transport, retinoid fietsen, fotoreceptor buitenste segment fagocytose, en groei factor secretie1. Er zijn een verscheidenheid van retinale dystrophie die invloed hebben op de functie van RPE en leiden tot een verlies van visie, met inbegrip van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie en retinitis pigmentosa. Generatie RPE uit pluripotente stamcellen onderzoek te begrijpen deze oogziekten kan vergemakkelijken, en een onbeperkte bron van RPE kan voorzien in cel therapieën2. In feite, zijn meerdere klinische proeven gaande RPE afgeleid van pluripotente stamcellen3gebruikt.
Dit protocol differentiatie werd oorspronkelijk beschreven door Buchholz4 en was gebaseerd op de eerder gepubliceerde methode van Clegg5. De procedure bootst het normale in vivo developmental proces om directe ongedifferentieerde pluripotente stamcellen naar het lot van een RPE via manipulatie van de insuline-groeifactoren (IGF), fundamentele fibroblast groeifactor (FGF-2; FGF-basic), transformeren groeifactor bèta (TGF-β) en4,5van de trajecten van de WNT. Het protocol is aanzienlijk verbeterd door toevoeging van een agonist traject WNT laat in het protocol, dat leverde 97.77% ± 0,1% pre-melanosome proteïnen (PMEL) positieve cellen, en is aangepast aan de omstandigheden xeno-vrije6,7. De resulterende RPE hebben aangetoond dat RPE markeringen op de transcript en proteïne niveaus, bekende RPE groeifactoren met juiste polariteit afscheiden, en uitvoeren van fagocytose van fotoreceptor buitenste segmenten8express. Dit protocol is sneller en betrouwbaarder dan "spontane" protocollen van differentiatie, waarbij eenvoudige verwijdering van fundamentele fibroblast groeifactor8. Bovendien, RNA sequencing gegevens blijkt dat RPE verkregen met behulp van dit protocol zijn zeer gelijkaardig aan die verkregen met behulp van de gemeenschappelijkere spontane aanpak8. De 14-daagse methode genereert RPE die passen bij de "5 P's ' genoemd door Mazzoni9 (gepigmenteerde, gepolariseerde fagocytische, post mitotische, veelhoekige)9. Terwijl deze procedure heeft bewezen in verschillende laboratoria reproduceerbaar zijn, willen wij erkennen van verschillende methoden van de extra gestuurde differentiatie die zijn gepubliceerd in de afgelopen jaren10,11,12 , 13.

<table><tbody><tr><td>SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet</td><td>Baker</td><td>model: SG603A-HE, type: A2, class: 2</td><td>6' Baker laminar flow biosafety cabinet</td></tr><tr><td>Dissection Hood</td><td>Labconco</td><td>Model 3970405</td><td>laminar flow bench top</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td>heated stage</td></tr><tr><td>air-jacketed CO2 incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td>37 oC and 5% CO2</td></tr><tr><td>inverted phase contrast microscope</td><td>Olympus</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Media Componenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Groeifactoren en Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse noggin</td><td>R&amp;D systems</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human DKK-1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant IGF-1</td><td>R&amp;D systems</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human/mouse/rat Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 FGF inhibitor</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-204308</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Substraten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>growth factor reduced ECMH</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Andere reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (no calcium, no magnesium)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (RPE ondersteunend medium)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102</td><td>cryopreservation medium</td></tr><tr><td>1.2 mL Cryogenic Vial</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (freezing container)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>freezing container</td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td>antimicrobial reagent</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Andere apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>12-well culture plate</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td>Gebruikt tijdens differentiatie.</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Gebruikt tijdens RPE-rijping.</td></tr><tr><td>6-well culture plate</td><td>Corning</td><td>CLS3513</td><td>Gebruikt tijdens RPE-rijping.</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>Gebruikt tijdens passages.</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Gebruikt tijdens passages voor celtelling.</td></tr></tbody></table>

snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We beschrijven een robuuste methode om direct de differentiatie van pluripotente stamcellen in retinale pigment epitheliale cellen (RPE). Het doel van het verstrekken van een gedetailleerde en grondige protocol is duidelijk op elke stap en dit gemakkelijk beschikbaar maken voor onderzoekers in het veld. Dit protocol resultaten in een homogene laag van RPE met minimale of geen handmatige dissectie nodig. De methode die hier gepresenteerd is aangetoond dat het effectief zijn voor geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) en menselijke embryonale stamcellen. Daarnaast beschrijven we methoden voor cryopreservatie van tussenliggende celbanken waarmee langdurige opslag. RPE gegenereerd met behulp van dit protocol zou kunnen nuttig voor iPSC ziekte-in-a-schotel modeling of klinische toepassing zijn.

Deze methode resulteert in de productie van een homogene, gepigmenteerde en cuboidal enkelgelaagde van RPE. De tijdlijn in Figuur 1 komt overeen met de foto's afgebeeld in Figuur 2. Zoals blijkt uit figuur 2A, zijn de stamcel kolonies zorgvuldig verpakt met gedefinieerde randen en geen fibroblastic cellen tussen de kolonies of ondoorzichtig cellen binnen kolonies. Figuur 2B biedt een weergave van onrijpe RPE die zijn subconfluent. Als de cellen nog confluente in dit stadium, uitbreiden niet zij prognoses die essentieel voor de differentiatie-proces zijn. Cellen die ernstig subconfluent zijn zal niet kunnen tot stand brengen van een enkelgelaagde en strakke kruispunten, karakteristiek van epitheel vormen. Details over hoe te optimaliseren deze samenloop worden beschreven in de sectie discussie. Figuur 2C toont de morfologie van de twee meest voorkomende vormen van niet-RPE die zich tijdens dit proces differentiatie voordoen kunnen: neurale of fibroblastic vlekken. Het is belangrijk op te merken dat deze neurale patches vooral ondoorzichtige op een ontleden Microscoop, verschijnen overwegende dat de gedefinieerde, fibroblastic-achtige patches bijna doorschijnend op een ontleden Microscoop worden. Het kan het nuttig zijn om deze gebieden op een plaat van weefselkweek Markeer met een pen ethanol-proof lab gemakkelijker om ze te identificeren op zowel een samengestelde lichte Microscoop en ontleden Microscoop. Cijfers 2D-F weergeven de kenmerkende lichte randen, geplaveide morfologie en pigmentatie die duiden op een gezonde, volwassen cultuur van RPE Figuur 3 is een hogere vergroting beeld te tonen van de verschillende weergave van volwassen RPE afgebeeld door fase contrast en heldere veld microscopie. Bij passage zijn 3-daags 30, de cellen klaar voor de karakterisering die is beschreven in eerdere publicaties, met inbegrip van RNA expressie, eiwit expressie groeifactor secretie en fagocytose2,4,6 ,7. Deze karakterisaties tonen dat de cellen die zijn vertegenwoordigd in deze beelden niet alleen gepigmenteerde cuboidal, maar ook fagocytische, post mitotische en gepolariseerde zijn.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
Figuur 1:. Tijdlijn voor de toevoeging van factoren die de groei en rijping van RPE. Groeifactoren zijn toegevoegd aan 12-Wells-platen van dag 0-14. Rijpen RPE worden gekweekt in 6-Wells-platen of T75 kolven vanaf dag van verrijking tot 30 dagen na dooi (doorgang 3-daags 30). Pijlen geven aan enzymatische cel passaging. (A-E) hieronder de tijdlijnen komen overeen met de afbeeldingen in Figuur 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
Figuur 2: vertegenwoordiger morfologie en samenvloeiing van rijping RPE. Geïnduceerde pluripotente stamcellen onmiddellijk vóór de passaging voor differentiatie (A). Onrijpe RPE cellen subconfluent op dag 2 (B) en vóór verrijking van de pick te verwijderen op dag 14; niet-RPE patches (aangegeven door witte pijlen) weergegeven als patches of ondoorzichtig "linten" (C). RPE bij passage 0, 1 en 3 op dag 30 (D, E, en F). Schaal bar = 200 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
Figuur 3: oudere RPE bij passage 3: dag 30 Cuboidal morfologie afgebeeld in fase contrast (A) en pigmentatie afgebeeld in helder-veld (B). Schaal bar = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Dit protocol wordt beschreven hoe retinale pigment epitheliale cellen (RPE) uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode gebruikt een combinatie van factoren die de groei en de kleine molecules om direct de differentiatie van stamcellen in onvolwassen RPE in veertien dagen en volwassen, functionele RPE na drie maanden.

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Het algemene doel van deze methode is om de differentiatie van pluripotente stamcellen tot retinaal pigmentepitheelcellen in een homogene laag effectief te sturen. Deze methode helpt bij het beantwoorden van vragen in het veld van het onderzoek naar het netvlies en het oog, zoals hoe het netvlies zich ontwikkelt en hoe een stamcelmodel voor ziekten kan worden vastgesteld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze sneller en efficiënter is dan spontane methoden.Deze methode maakt gebruik van een combinatie van groeifactoren en kleine moleculen om de differentiatie van stamcellen te sturen, zodat deze binnen 14 dagen onrijp RPE worden en na drie maanden rijp functioneel RPE. Delen van de procedure zullen worden gedemonstreerd door Cassidy Arnold, de associate director van het laboratorium voor stamcelbiologie en engineering aan UC Santa Barbara. Om deze procedure te starten, laat u stamcelkolonies groeien onder feeder-vrije en serum-vrije condities tot ongeveer 80% confluentie voordat u ze passageert.Coat vervolgens een plaat met 12 putjes met hydrogel op basis van extracellulaire matrix volgens de aanbevelingen van de fabrikant en laat dit één uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius uitharden. Verdeel daarna de benodigde volumes retinaal differentiatiemedium en PBS zonder calcium of magnesium voor dag nul in aliquoten en warm deze op in een waterbad tot 37 graden Celsius. Voeg vervolgens de groeifactoren toe aan het opgewarmde RDM en laat EDTA op kamertemperatuur komen.Verwijder indien nodig alle gedifferentieerde kolonies op basis van morfologie met een P10-pipetpunt uit de stamcellen die zullen worden overgezet voor differentiatie. Fibroblastachtige cellen tussen de kolonies en de ondoorzichtige cellen binnen de kolonies duiden op de gedifferentieerde cellen die verwijderd moeten worden. Het handmatig verwijderen van cellen is een van de meest kritieke stappen van het protocol, aangezien het starten met een volledig ongedifferentieerde stamcelpopulatie een efficiëntere verrijking mogelijk maakt.Transfer vervolgens de cellen van één well van een zes-wells plaat naar vier wells van een 12-wells plaat door het medium van de stamcellen af te zuigen en de wells één keer te wassen met twee milliliter voorverwarmde PBS. Zuig daarna de PBS af en spoel elke well drie keer met één milliliter EDTA per well. Kantel vervolgens voorzichtig de plaat en zuig de EDTA af.Schud de plaat op geen enkele wijze om te voorkomen dat de cellen voortijdig loslaten. Voeg na de derde wasbeurt opnieuw één milliliter EDTA toe en incubeer de plaat drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast. Verstoor de plaat niet tijdens deze incubatie.Zuig vervolgens de EDTA af en voeg één milliliter RDM toe per putje dat beplant zal worden, plus 0,5 milliliter extra medium. Was bijvoorbeeld één putje van een six-well plaat met 4,5 milliliter RDM om vier putjes van een 12-well plaat te beplanten. Gebruik daarna een celschraper om de cellen voorzichtig los te maken.Tritureer de cellen in RDM door vijf keer op en neer te pipetteren in de well en voltooi deze stap snel om heraanhechting aan de plaat te voorkomen. Plaats de cellen in een conische buis. Disсоcieer grote celklonters, maar tritureer niet tot een suspensie van enkelvoudige cellen.Verdeel de cellen gelijkmatig in de pipette en voltooi deze stap snel om heraanhechting aan de plaat te voorkomen. Indien gewenst kan een lichtmicroscoop worden gebruikt om de grootte van de celklonters te observeren. Zaai de cellen vervolgens uit op met ECM gecoate 12-wells platen.Kantel de plaat heen en weer om de cellen gelijkmatig over de wells te verdelen en plaats deze in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 tot de volgende mediumwissel. Coat in deze procedure een six-well plaat met groeifactor-gereduceerde ECM volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat dit één uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 °C uitharden.Deel vervolgens de benodigde hoeveelheid DPBS en één milliliter RDM per verrijkingsput uit in aliquoten en verwarm deze tot 37 graden Celsius in een waterbad. Laat het trypsine-achtig enzym op kamertemperatuur komen en verwarm de benodigde hoeveelheid RPE-ondersteunend medium tot 37 graden Celsius. Voeg daarna een antimicrobieel reagens en een ROCK-remmer toe aan het RSM om een eindconcentratie van 0,5x antimicrobieel reagens en 10 micromolair ROCK-remmer te verkrijgen.Gebruik dit medium gedurende de eerste vier tot zeven dagen om de aanhechting te verbeteren. Aspireer vervolgens het verbruikte medium uit alle putjes en voeg één milliliter per putje voorverwarmd RDM zonder groeifactoren toe. Indien nodig kunnen alle niet-RPE-cellen worden weggesneden en weggekrabd met een P10-pipetpunt onder een dissectiemicroscoop.Aspirer na dissectie het RDM en al het celresidu en was deze tweemaal met één milliliter voorverwarmd DPBS per putje. Voeg vervolgens 0,5 milliliter TDE toe per putje van een 12-well plaat en incubeer vijf minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik daarna een celscraper om de cellen voorzichtig van de plaat te verwijderen.Tritureer de celenzymsuspensie voorzichtig door drie tot vier keer op en neer te pipetteren om een uniforme suspensie te creëren. Verdun vervolgens de celenzymsuspensie in een verhouding van één op 10 in het voorverwarmde RSM zonder ROCK-inhibitor. Centrifugeer de celsuspensie bij 173g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Zuig na vijf minuten het medium van de celpellet af en resuspendeer de cellen in RSM met 10 micromolair ROCK-remmer. Zeef vervolgens de cellen door een nylonmazige celzeef met poriën van 40 micrometer. Tel het aantal cellen met een hemocytometer en bereken de celconcentratie in de gezeefde oplossing.Zaai vervolgens de cellen uit op de met ECM gecoate platen met verminderde groeifactoren in een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per vierkante centimeter in vier milliliter RSM met 10 µM ROCK-remmer. Vervang het RSM met 10 µM ROCK-remmer 48 uur na het uitzaaien van de cellen en blijf het medium elke drie tot vier dagen vervangen. Stop na vier tot zeven dagen met het toevoegen van de ROCK-remmer aan het RSM.Laat de cellen 28 tot 35 dagen rijpen bij 37 °C en 5% CO2 en blijf het RSM elke drie tot vier dagen vervangen. Hier worden de geïnduceerde pluripotente stamcellen getoond vlak voor het passeren voor differentiatie. De stamcellen zijn klein en dicht opeengepakt binnen de kolonies, die geen gedifferentieerde cellen lijken te bevatten, zoals fibroblasten tussen de kolonies of opake passages binnen de kolonies.Hier zijn de onrijpe RPE-cellen op dag twee. De cellen in dit stadium moeten nog subconfluent zijn en projecties uitstrekken in de lege ruimtes tussen de cellen. Deze cellen zijn nog niet geselecteerd om de verrijking op dag 14 te verwijderen.Niet-RPE-cellen verschijnen als vlekken of ondoorzichtige linten. De ronde vlek bevat cellen met een fibroblastische morfologie, terwijl de ondoorzichtige vlekken waarschijnlijk neuraal retina zijn. Deze afbeeldingen tonen RPE bij passage nul, één en drie op dag 30.Bij elke passage moeten de cellen confluent zijn en de kenmerken van de morfologie van het retinaal pigmentepitheel vertonen, waaronder fase-heldere randen en een polygonale vorm. Zodra de methode onder de knie is, kunnen de passage- en verrijkingstechnieken in één tot twee uur worden voltooid, afhankelijk van de schaal van de celkweek. Na deze procedure kunnen technieken zoals gen- of eiwitkwantificering en functionele assays worden gebruikt om vragen te beantwoorden over het vermogen van het RPE om groeifactoren uit te scheiden of buitenste segmenten te fagocyteren.Artikelen gepubliceerd door Dave Buchholz in 2013 en Lindsay Leach in 2015 beschrijven in detail de ontwikkeling en optimalisatie van deze methode. Wij hebben een gedetailleerde en grondige demonstratie van elke stap in de procedure gegeven om deze gemakkelijk toegankelijk te maken voor onderzoekers in het vakgebied. Veel succes met de experimenten.

rapid-directed-differentiation-retinal-pigment-epithelial-cells-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De microRNA (miRNA) profielen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen, retinale pigment epitheel (RPE) afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen (iPS-RPE), en foetale RPE, werden vergeleken.

MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel

Stamcellenafgeleide retinale pigmentepitheel (RPE) cellen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder cel-gebaseerde therapieën voor retinale degeneratie, ziektemodellering en geneesmiddelstudies. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van RPE uit stamcellen.

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Het doel van dit rapport is om de protocollen beschrijven aan de netvliespigmentepitheel (RPE) van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen met behulp van verschillende maten van embryoid lichamen af ​​te leiden.

Afleiden van retinale pigment epitheel (RPE) van induced pluripotent stem (iPS) cellen door verschillende maten van embryoiden Bodies

Hier presenteren we een protocol om te onderscheiden van de retinale pigment epitheel (RPE) cellen van menselijke pluripotente stamcellen rekening houdend met patiënt afkomstige mutaties. De mutant cellijnen kunnen worden gebruikt voor functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunofluorescentie, en patch klem. Deze aanpak van ziekte-in-a-schotel omzeilt de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van inheemse menselijke RPE cellen.

Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties

De productie van gespecialiseerde netvlies cellen uit pluripotente stamcellen is een keerpunt in de ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapie voor retinale ziekten. De huidige paper beschrijft een eenvoudige methode voor een efficiënte generatie van retinale organoids en retinale pigment epitheel voor fundamenteel, translationeel, en klinisch onderzoek.

Gedefinieerde Xeno-vrij en kweekomstandigheden Feeder-gratis voor de generatie van menselijke iPSC afkomstige Retinal cel modellen

Beschrijven we een methode om ingenieur een retinale weefsel samengesteld van retinale pigment epitheliale cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen gekweekt op de top van menselijke vruchtwater membranen en de voorbereiding voor de transplantatie in diermodellen.

Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Met behulp van een zelforganiserende methode ontwikkelen we met de toevoeging van COCO een protocol dat de generatie van fotoreceptoren aanzienlijk zou kunnen verhogen.

Gerichte inductie van retinale organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinale organoïde inductiesysteem, dat geschikt is voor verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren.

Retinale organoïde inductiesysteem voor afleiding van 3D retinale weefsels van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het differentiëren van hiPSC's in oogveldclusters en het genereren van neuro-retinale organoïden met behulp van vereenvoudigde kweekomstandigheden waarbij zowel adherente als suspensiecultuursystemen betrokken zijn. Andere oculaire celtypen, zoals de RPE en het hoornvliesepitheel, kunnen ook worden geïsoleerd uit volwassen oogvelden in retinale culturen.

Generatie van retinale organoïden uit gezonde en retinale ziekte-specifieke door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerd 3D neuraal retina-inductiesysteem dat de hechting en fusie van retinale organoïden vermindert met een hoge herhaalbaarheid en efficiëntie.

Neuraal netvlies genereren uit menselijke pluripotente stamcellen

Leer een snelle methode voor differentiatie van retinale pigmentepitheelcellen uit pluripotente stamcellen met groeifactoren en kleine moleculen. Deze techniek levert rijpe, functionele cellen op na drie maanden.

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen