Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze methode is om de differentiatie van pluripotente stamcellen tot retinaal pigmentepitheelcellen in een homogene laag effectief te sturen. Deze methode helpt bij het beantwoorden van vragen in het veld van het onderzoek naar het netvlies en het oog, zoals hoe het netvlies zich ontwikkelt en hoe een stamcelmodel voor ziekten kan worden vastgesteld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze sneller en efficiënter is dan spontane methoden.

Deze methode maakt gebruik van een combinatie van groeifactoren en kleine moleculen om de differentiatie van stamcellen te sturen, zodat deze binnen 14 dagen onrijp RPE worden en na drie maanden rijp functioneel RPE. Delen van de procedure zullen worden gedemonstreerd door Cassidy Arnold, de associate director van het laboratorium voor stamcelbiologie en engineering aan UC Santa Barbara. Om deze procedure te starten, laat u stamcelkolonies groeien onder feeder-vrije en serum-vrije condities tot ongeveer 80% confluentie voordat u ze passageert.

Coat vervolgens een plaat met 12 putjes met hydrogel op basis van extracellulaire matrix volgens de aanbevelingen van de fabrikant en laat dit één uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius uitharden. Verdeel daarna de benodigde volumes retinaal differentiatiemedium en PBS zonder calcium of magnesium voor dag nul in aliquoten en warm deze op in een waterbad tot 37 graden Celsius. Voeg vervolgens de groeifactoren toe aan het opgewarmde RDM en laat EDTA op kamertemperatuur komen.

Verwijder indien nodig alle gedifferentieerde kolonies op basis van morfologie met een P10-pipetpunt uit de stamcellen die zullen worden overgezet voor differentiatie. Fibroblastachtige cellen tussen de kolonies en de ondoorzichtige cellen binnen de kolonies duiden op de gedifferentieerde cellen die verwijderd moeten worden. Het handmatig verwijderen van cellen is een van de meest kritieke stappen van het protocol, aangezien het starten met een volledig ongedifferentieerde stamcelpopulatie een efficiëntere verrijking mogelijk maakt.

Transfer vervolgens de cellen van één well van een zes-wells plaat naar vier wells van een 12-wells plaat door het medium van de stamcellen af te zuigen en de wells één keer te wassen met twee milliliter voorverwarmde PBS. Zuig daarna de PBS af en spoel elke well drie keer met één milliliter EDTA per well. Kantel vervolgens voorzichtig de plaat en zuig de EDTA af.

Schud de plaat op geen enkele wijze om te voorkomen dat de cellen voortijdig loslaten. Voeg na de derde wasbeurt opnieuw één milliliter EDTA toe en incubeer de plaat drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast. Verstoor de plaat niet tijdens deze incubatie.

Zuig vervolgens de EDTA af en voeg één milliliter RDM toe per putje dat beplant zal worden, plus 0,5 milliliter extra medium. Was bijvoorbeeld één putje van een six-well plaat met 4,5 milliliter RDM om vier putjes van een 12-well plaat te beplanten. Gebruik daarna een celschraper om de cellen voorzichtig los te maken.

Tritureer de cellen in RDM door vijf keer op en neer te pipetteren in de well en voltooi deze stap snel om heraanhechting aan de plaat te voorkomen. Plaats de cellen in een conische buis. Disсоcieer grote celklonters, maar tritureer niet tot een suspensie van enkelvoudige cellen.

Verdeel de cellen gelijkmatig in de pipette en voltooi deze stap snel om heraanhechting aan de plaat te voorkomen. Indien gewenst kan een lichtmicroscoop worden gebruikt om de grootte van de celklonters te observeren. Zaai de cellen vervolgens uit op met ECM gecoate 12-wells platen.

Kantel de plaat heen en weer om de cellen gelijkmatig over de wells te verdelen en plaats deze in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 tot de volgende mediumwissel. Coat in deze procedure een six-well plaat met groeifactor-gereduceerde ECM volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat dit één uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 °C uitharden.

Deel vervolgens de benodigde hoeveelheid DPBS en één milliliter RDM per verrijkingsput uit in aliquoten en verwarm deze tot 37 graden Celsius in een waterbad. Laat het trypsine-achtig enzym op kamertemperatuur komen en verwarm de benodigde hoeveelheid RPE-ondersteunend medium tot 37 graden Celsius. Voeg daarna een antimicrobieel reagens en een ROCK-remmer toe aan het RSM om een eindconcentratie van 0,5x antimicrobieel reagens en 10 micromolair ROCK-remmer te verkrijgen.

Gebruik dit medium gedurende de eerste vier tot zeven dagen om de aanhechting te verbeteren. Aspireer vervolgens het verbruikte medium uit alle putjes en voeg één milliliter per putje voorverwarmd RDM zonder groeifactoren toe. Indien nodig kunnen alle niet-RPE-cellen worden weggesneden en weggekrabd met een P10-pipetpunt onder een dissectiemicroscoop.

Aspirer na dissectie het RDM en al het celresidu en was deze tweemaal met één milliliter voorverwarmd DPBS per putje. Voeg vervolgens 0,5 milliliter TDE toe per putje van een 12-well plaat en incubeer vijf minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik daarna een celscraper om de cellen voorzichtig van de plaat te verwijderen.

Tritureer de celenzymsuspensie voorzichtig door drie tot vier keer op en neer te pipetteren om een uniforme suspensie te creëren. Verdun vervolgens de celenzymsuspensie in een verhouding van één op 10 in het voorverwarmde RSM zonder ROCK-inhibitor. Centrifugeer de celsuspensie bij 173g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Zuig na vijf minuten het medium van de celpellet af en resuspendeer de cellen in RSM met 10 micromolair ROCK-remmer. Zeef vervolgens de cellen door een nylonmazige celzeef met poriën van 40 micrometer. Tel het aantal cellen met een hemocytometer en bereken de celconcentratie in de gezeefde oplossing.

Zaai vervolgens de cellen uit op de met ECM gecoate platen met verminderde groeifactoren in een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per vierkante centimeter in vier milliliter RSM met 10 µM ROCK-remmer. Vervang het RSM met 10 µM ROCK-remmer 48 uur na het uitzaaien van de cellen en blijf het medium elke drie tot vier dagen vervangen. Stop na vier tot zeven dagen met het toevoegen van de ROCK-remmer aan het RSM.

Laat de cellen 28 tot 35 dagen rijpen bij 37 °C en 5% CO2 en blijf het RSM elke drie tot vier dagen vervangen. Hier worden de geïnduceerde pluripotente stamcellen getoond vlak voor het passeren voor differentiatie. De stamcellen zijn klein en dicht opeengepakt binnen de kolonies, die geen gedifferentieerde cellen lijken te bevatten, zoals fibroblasten tussen de kolonies of opake passages binnen de kolonies.

Hier zijn de onrijpe RPE-cellen op dag twee. De cellen in dit stadium moeten nog subconfluent zijn en projecties uitstrekken in de lege ruimtes tussen de cellen. Deze cellen zijn nog niet geselecteerd om de verrijking op dag 14 te verwijderen.

Niet-RPE-cellen verschijnen als vlekken of ondoorzichtige linten. De ronde vlek bevat cellen met een fibroblastische morfologie, terwijl de ondoorzichtige vlekken waarschijnlijk neuraal retina zijn. Deze afbeeldingen tonen RPE bij passage nul, één en drie op dag 30.

Bij elke passage moeten de cellen confluent zijn en de kenmerken van de morfologie van het retinaal pigmentepitheel vertonen, waaronder fase-heldere randen en een polygonale vorm. Zodra de methode onder de knie is, kunnen de passage- en verrijkingstechnieken in één tot twee uur worden voltooid, afhankelijk van de schaal van de celkweek. Na deze procedure kunnen technieken zoals gen- of eiwitkwantificering en functionele assays worden gebruikt om vragen te beantwoorden over het vermogen van het RPE om groeifactoren uit te scheiden of buitenste segmenten te fagocyteren.

Artikelen gepubliceerd door Dave Buchholz in 2013 en Lindsay Leach in 2015 beschrijven in detail de ontwikkeling en optimalisatie van deze methode. Wij hebben een gedetailleerde en grondige demonstratie van elke stap in de procedure gegeven om deze gemakkelijk toegankelijk te maken voor onderzoekers in het vakgebied. Veel succes met de experimenten.