Bouw en evaluatie van een lymfkliertest Calvarial osteolyse Model door blootstelling aan CoCrMo deeltjes in aseptische losraken
17 februari 2018
Dit manuscript beschrijft een model lymfkliertest calvarial osteolyse door blootstelling aan CoCrMo deeltjes, die een ideale diermodel vormt voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes van slijtage en verschillende cellen in aseptische losraken.
Het algemene doel van deze procedure is het opzetten en evalueren van het murine calvariale osteolysemodel door blootstelling aan kobalt-chroom-molybdeen-nanodeeltjes. Door slijtagepartikels geïnduceerde osteolyse is een belangrijke oorzaak van aseptische loslating bij het falen van arthroplastiek, maar de onderliggende mechanismen hiervan zijn onduidelijk. Vanwege de lange follow-upduur en het sporadische voorkomen is het moeilijk om de pathogenese van aseptische loslating in klinische gevallen te onderzoeken.
Daarom is een slijtage-diermodel noodzakelijk voor verder onderzoek. In ons laboratorium is een muismodel voor calvariale osteolyse, opgebouwd met kobaltslegeringsdeeltjes, een effectief model om de pathogenese van aseptische loslating te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst nanoscopische kobalt-chroom-molybdeendeeltjes te genereren uit een kobaltslegeringsprothese en deze vervolgens te resuspenderen in phosphate buffer saline met een concentratie van 15 mg/mL.
De volgende stap is het bepalen van de incisiepositie op een lijn tussen de twee middenpunten tussen de ogen en de oren, respectievelijk. Verwijder vervolgens het craniële periosteum van het calvarium door middel van shockdissectie. Neem daarna 50 µL cobaltlegering-nanodeeltjes-stockoplossing en breng deze aan in de middennaad van de calvaria.
Offer na twee weken onderhoud enkele muizen en verzamel de calvaria voor de evaluatie van osteolyse. Osteolyse is duidelijk zichtbaar bij muizen die zijn behandeld met kobaltting-nanodeeltjes, zowel in micro-CT- als in H&E-kleuringsbeelden. Verkrijg kobalt-chroom-molybdeenlegering uit een kobaltlegeringprothese, waarbij kobalt-chroom-molybdeenpartikels uit de kobalt-chroom-molybdeenlegering worden verkregen middels een vervaardigde hoogvacuüm drie-elektrode gelijkstroom.
Om de gemiddelde diameter van de kobalt-chroom-molybdeen-deeltjes te kwantificeren, brengt u één milligram deeltjes aan in 1,5 milliliter watervrij ethanol en suspendeert u deze door middel van ultrasone agitatie. Breng één druppel, ongeveer 20 µL, van de suspensie aan op de objecttafel van de transmissie-elektronenmicroscoop en leg een reeks beelden vast. Gebruik de meegeleverde software om de gemiddelde diameter en de deeltjesgrootteverdeling in de TEM-beelden te berekenen.
Hier zijn representatieve TEM-beelden op het linkerpaneel; het rechterpaneel toont de distributie van de nanodeeltjesgrootte van de kobalt-chroom-molybdeenlegering, berekend door onze commerciële software. De gemiddelde diameter is ongeveer 50 nanometers. Autoclaveer de deeltjes gedurende 15 minuten om endotoxinen te verwijderen.
Resuspendeer ze vervolgens in fosfaatgebufferde zoutoplossing op een concentratie van 15 mg/mL als voorraadoplossing. Vervolgens volgt de constructie van het calvariale osteolysemodel. Selecteer en anestheseer zes weken oude muizen: zes muizen per groep.
Plaats de dieren in de primaire positie. Verwijder de vacht en desinfecteer de huid op het schedeldak met 75 procent ethanol. Voor de incisie identificeert u de twee middelpunten tussen de ogen en de oren, respectievelijk, en maakt u een incisie in de huid langs de lijn die deze verbindt.
Verwijder zorgvuldig en volledig het craniale periost van het schedeldak door middel van shock-dissectie. Een volledige dissectie van het periost versterkt de interacties tussen deeltjes in de schedeldakken. De hechting wordt zorgvuldig uitgevoerd aan beide uiteinden van de incisie met een enkelvoudige onderbroken hechting.
Normaal gesproken zijn er drie hechtingen nodig voor een volledige sutuur. Haal voor de laatste fase de hechtdraad zonder te knopen door de incisie, terwijl beide uiteinden van de hechtdraad worden vastgehouden. Neem 15 µL cobalt-legering stockoplossing nanodeeltjes en bed deze in de middelste hechting van het calvaria.
Knoop de laatste steek van de enkelvoudige onderbroken hechting vast. Houd de muizen nog twee weken aan. Offer het dier twee weken later op en oogst de calvaria.
Verwijder voorzichtig al het zachte weefsel van de calvaria-monsters met een pincet en fixeer het weefsel in vier procent paraformaldehyde bij vier graden Celsius. Voer voor de evaluatie van osteolyse in het model geïnduceerd door kobalt-chroom-molybdeen-nanodeeltjes een micro-CT met hoge resolutie uit 24 uur voor de micro-CT-scan. Overbreng de calvaria-monsters vanuit paraformaldehyde naar fosfaatgebufferde zoutoplossing.
Verzamel op de dag van de micro-CT-scan de calvaria-monsters uit de fosfaatgebufferde zoutoplossing en fixeer deze op een houder die bij het instrument hoort. Scan de calvaria met het micro-CT-instrument. Voer de driedimensionale reconstructie uit met diverse software.
H&E-kleuring is een ander instrument voor de evaluatie van osteolyse in een model geïnduceerd door nanodeeltjes. Decalcificeer calvaria-monsters gedurende drie weken bij vier graden Celsius in fosfaatgebufferde zoutoplossing, bevattende 15 procent ethylendiaminetetraazijnzuur. Bed de gedecalcificeerde calvaria in paraffine en snijd ze in secties van twee micrometer in het gebied van de deeltjesdepositie.
Kleur de coupes met hematoxyline en eosine. Observeer het algemene morfologische beeld via lichtmicroscopie en maak micrografieën. Hier zijn representatieve micro-CT-beelden.
Driedimensionale reconstructiebeelden van micro-CT-gegevens worden in het linkerpaneel weergegeven. Dwarsdoorsnedebeelden van controlemuizen, muizen met een schijnoperatie en muizen behandeld met nanodeeltjes worden in het rechterpaneel weergegeven. Osteolyse is duidelijk zichtbaar in de groep die behandeld is met nanodeeltjes.
Hier is een kwantitatieve analyse van micro-CT-foto's door de bijbehorende software van de instrumenten. De metingen omvatten de botmineraaldichtheid, het botvolume of de ratio van het totale volume, het percentage totale porositeit, het trabeculair aantal, de trabeculaire dikte en de trabeculaire scheiding of spatiëring. Muizen die behandeld zijn met kobaltelegerings-nanodeeltjes vertonen een significant lagere botmineraaldichtheid en een lager botvolume, met een hoger percentage totale porositeit in vergelijking met de controledieren.
Hier zijn representatieve H&E-kleuringsbeelden van schedelkapmonsters van controlemuizen, muizen na een sham-operatie en muizen behandeld met nanodeeltjes. Osteolyse is ook duidelijk zichtbaar in de groep die behandeld is met nanodeeltjes. Het muismodel voor schedelkaposteolyse, geconstrueerd met kobaltlegeringsnanodeeltjes, heeft een hoog succespercentage bij het modelleren van door slijtagepartikels geïnduceerde osteolyse.
Hieronder volgen enkele belangrijke factoren. Ten eerste versterken de kobaltlegering-nanodeeltjes de interactie tussen slijtagepartikels en calvaria. Ten tweede zorgt een adequate blootstelling van de calvaria en een duidelijke dissectie van het periosteum ervoor dat de interactie tussen de partikels en de calvaria intensiever wordt.
Ten derde maken kwantitatieve metingen van botverlies via micro-CT het eenvoudiger om verschillen in botverlies tussen diverse behandelingen vast te stellen, wat ons solide bewijs voor osteolyse levert in vergelijking met de traditionele bot-histomorfometrie. Een slijtage-osteolysemodel van de schedelkap, geconstrueerd met kobaltlegeringsdeeltjes, is een ideaal model om de interactie tussen slijtagepartikels en verschillende cellen bij aseptische loslating te onderzoeken, zoals macrofagen, fibroblasten, osteoclasten en osteoblasten.
We hopen dat ons model in de toekomst nuttig zal zijn voor het onderzoek naar aseptische loslating.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een muismodel voor calvariale osteolyse door blootstelling aan kobalt-chroom-molybdeen-nanodeeltjes, wat een ideaal diermodel vormt voor het beoordelen van de interacties tussen slijtagepartikels en diverse cellen bij aseptische loslating. Dit model is van cruciaal belang voor het begrijpen van de pathogenese van osteolyse gerelateerd aan het falen van arthroplastiek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Orthopedie
Achtergrond
- Slijtage-geïnduceerde osteolyse is een belangrijke oorzaak van aseptische loslating bij gewrichtsprothesen.
- De mechanica die ten grondslag liggen aan dit proces blijven onduidelijk.
- Klinische studies staan voor uitdagingen vanwege de lange follow-up perioden en sporadische incidentie.
- Een betrouwbaar diermodel is essentieel voor verder onderzoek.
Doel van de studie
- Om een muismodel voor calvariale osteolyse te construeren en te evalueren.
- Om de interacties tussen kobalt-chroom-molybdeen-partikels en verschillende cellen te bestuderen.
- Om het begrip van de pathogenese van aseptische loslating te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Generatie van nanoschaal kobalt-chroom-molybdeen-deeltjes uit een kobaltlegering prothese.
- Resuspensie van deeltjes in fosfaatgebufferde zoutoplossing bij een concentratie van 15 mg/mL.
- Blootstelling van muis calvariaal weefsel aan de deeltjes.
- Evaluatie van cellulaire interacties en osteolytische responsen.
Belangrijkste resultaten
- Het muismodel bootst slijtageparticle-geïnduceerde osteolyse effectief na.
- Interacties tussen particles en cellen werden succesvol beoordeeld.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de mechanismen van aseptische loslating.
- Dit model kan worden gebruikt voor toekomstige studies naar het falen van arthroplastiek.
Conclusies
- Het muismodel voor calvariale osteolyse is een waardevol instrument voor onderzoek.
- Het biedt inzicht in de pathogenese van osteolyse.
- Dit model kan helpen bij het ontwikkelen van strategieën om aseptische loslating te beperken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Slijtageparticle-geïnduceerde osteolyse blijft een belangrijke oorzaak van aseptische loslating bij het falen van gewrichtsvervangingen, maar het mechanistische begrip wordt beperkt door de beperkingen van klinische studies. Het murine calvariale model biedt een snel, kwantificeerbaar systeem om interacties tussen particles en cellen te evalueren, waardoor preconclusieve risicoreductie van biomaterialen en implantaatontwerpen mogelijk wordt. Dit ondersteunt target-validatie en voorspellend vertrouwen in vroege stadia van orthopedische R&D-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot de interacties van slijtagepartikels met macrofagen, fibroblasten, osteoblasten en osteoclasten.
- Operationele waarde: Faciliteert biologische risicoreductie door kwantitatieve beoordeling van botverlies via micro-CT en histomorfometrie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door osteolytische responsen te modelleren ter informatie voor de selectie van implantaatmaterialen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Genereert gestandaardiseerde biologische resultaten (botmineraaldichtheid, trabeculaire parameters) voor de evaluatie van verbindingen of coatings.
- Reproduceerbaarheid: Een hoog succespercentage en een lage variabiliteit maken schaalbare screening van partikelmodificaties mogelijk.
- Nut van het platform: Compatibel met transgene/knock-out modellen om mechanistische paden bij osteolyse te ontleden.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert de pathogenese van aseptische loslating om de kloof tussen ontdekking en preklinische validatie te overbruggen.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt de cellulaire en moleculaire pathways die osteolyse aansturen voor de prioritering van targets.
- Translationele continuïteit: Biedt kwantitatieve eindpunten (botvolume, porositeit) die voorspellend zijn voor de in vivo prestaties van implantaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het model past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor hypothesetesten in de vroege ontdekkingsfase, assay-ontwikkeling voor screening en mechanistische evaluatie voorafgaand aan de identificatie van leadverbindingen mogelijk worden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van door deeltjes geïnduceerde inflammatoire en osteolytische pathways.
- Screening: Levert kwantitatieve, gestandaardiseerde resultaten (micro-CT botmetrieken) voor een betrouwbare beoordeling van verbindingen of biomaterialen.
- Analytiek: Genereert meetbare uitkomsten (botmineraaldichtheid, trabeculaire dikte, porositeit) om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt blootstelling aan deeltjes met osteolytische uitkomsten, wat bijdraagt aan beslissingen over preklinische voortgang.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van diverse slijtagepartikels en implantaatcoatings.
Operationele en ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit bij door deeltjes geïnduceerde osteolyse te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde protocollen voor deeltjesblootstelling en kwantitatieve evaluatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het bieden van een vroege biologische risicobeoordeling van implantaatmaterialen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van biomaterialen mogelijk op basis van het osteolytisch potentieel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in muischirurgie, de omgang met partikels en micro-CT-beeldvorming.
- Afhankelijk van instrumentatie voor partikelgeneratie (hoogvacuüm DC-elektrode), de bereiding van suspensies en de kwantificering van osteolyse.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor partikeldosering, chirurgische techniek en analyse-workflows.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten de geschiktheid van het model voor chronicity-beoordelingen en studies naar mechanische belasting.
- Praktische beperking: Effecten van mechanische kracht of langdurige chronische partikelexpositie kunnen volgens het bronmateriaal niet worden geëvalueerd.
