Name: Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryos en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Leer RNA-detectie in Drosophila embryo's en weefsels met tyramide signaalversterking. Deze methode biedt hoge resolutie en gevoeligheid tegen lage kosten voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiering van de steun voor dit project werd verstrekt door een subsidie aan HMK door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen MOP 133473).

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilk%2C+R+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).</li>
<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Het beschreven protocol biedt een zeer reproduceerbaar, gevoelige en economische methode voor de detectie van de meeste RNAs in vaste Drosophila embryo's of weefsels. Hoewel iets ingewikkelder dan de meer traditioneel alkalische fosfatase methode voor de detectie van de sonde gebruikt, de resolutie verkregen door vis is veel groter en de gevoeligheid is vergelijkbare of betere 7,8. Met behulp van gehele of gedeeltelijke microtiterplaat platen, kunnen de protocollen worden gebruikt voor grootschalige of beperkte analyses van genen van belang. Opgemerkt moet worden dat de sondes gegenereerd kunnen alle gedetecteerd of meerdere transcript splice vormt tenzij sondes zijn meer specifiek ontworpen (dat wil zeggen, één exons). Hoewel we hebben getest sondes zo klein als 200 nucleotiden met redelijk succes, kleinere sondes zijn meestal minder effectief en kunnen wel minder specifiek zijn. Duidelijk, is dit protocol is niet geschikt voor het opsporen van kleine introns, exons, of microRNAs verwerkt.
Hoewel deze aanpak een enzymatische stap gebruikt voor het stimuleren van de sterkte van de signalen, lijkt signaalsterkte te zijn in verhouding tot doel genexpressie in een relatief lineaire en brede waaier van expressie niveaus. Op hogere vergroting, het signaal wordt gezien als puncta of spikkels binnen cellen en weefsels. Alleen een paar kleine puncta zijn relatief zeldzaam afschriften beschouwd. Zoals transcript overvloed toeneemt, groeien deze in aantal en de grootte. Zoals met enkel molecuul vis (smFISH), enkele kleine puncta mogelijk ook overeen met één RNAs en moet ook worden gemakkelijk gekwantificeerd aan de hand beeldvorming en informatica software. Vergelijkingen van gepubliceerde beelden verkregen met behulp van smFISH met beelden die we hebben samengesteld voor dezelfde doelstellingen suggereren dat de overall, de gevoeligheid en de resolutie van de twee methoden relatief vergelijkbaar, zijn maar dit moet worden getest door strengere vergelijkingen. Gezien de veel hogere kosten van smFISH, moet de methode die hier geven vergelijkbare resultaten tegen een fractie van de kosten. Maar als het doel is om het detecteren van kleine afschriften of afzonderlijke delen van afschriften, wordt smFISH aangeraden.
Vanwege de kleinere omvang van sommige vis sondes, kan deze methode ook worden beter op indringende weefsels die zijn grote of belangrijke belemmeringen. Echter, het gebruik van hogere niveaus van wasmiddel en weefsel fixatie en permeabilization tweaks lijken te hebben dit probleem opgelost. Tot slot, hoewel ontwikkeld voor Drosophila weefsels, de hoge wasmiddel buffers hier beschreven voor ontleed weefsels zou ook moeten werken voor Drosophila embryo's, evenals de meeste andere organismen en weefsels.

Nieuwe genoom-brede RNA detectiemethoden zoals RNA-seq hebben onze kennis van wanneer en waar de genen worden uitgedrukt, en op welke niveaus1sterk uitgebreid. Deze bieden echter relatief lage temporele en ruimtelijke resolutie. RNA in situ hybridisatie kunt de ruimtelijke spreiding van afschriften worden visueel waargenomen in vaste weefsels, aldus onthullen de details van cellulaire en subcellular localisatie2. Gebruikt Fluorescente kruising in situ (vissen), kunt zelfs meer ruimtelijke resolutie als daarmee het gebruik van krachtige microscopie technieken, zoals confocale en lichte blad microscopie3. Fluorescente markeringen zoals DAPI kunnen ook worden gebruikt om vast te stellen subcellular relaties4. VIS vergemakkelijkt ook de observatie van meerdere RNAs en eiwitten gelijktijdig met duidelijke aanwijzingen van overlap op het subcellular niveau. Unieke reagentia en stappen die nodig zijn voor het labelen van dubbele kunnen worden gevonden in de volgende verwijzingen3,5.
De hier beschreven procedures gebruiken 96-wells microtiterplaat platen voor alle maatregelen, met inbegrip van cDNA sjabloon productie (PCR van de kolonie), RNA sonde productie (met T7, T3 of SP6 polymerase-afhankelijke run-off transcriptie), in situ hybridisatie, en fluorescent signaal ontwikkeling. Voldoende aantal embryo's of weefsels worden toegevoegd aan elk van de 96-wells-plaat om evaluatie van de consistentie en veranderlijkheid. Nou dan ontvangt elk een verschillende sonde. Na signaal ontwikkeling, zijn embryo's of weefsels van elk putje gekleed op individuele Microscoop dia's voor microscopische analyse.
Het gebruik van tyramide signaal versterking (TSA) voor de detectie van de sonde produceert robuuste signalen met uitzonderlijke subcellular resolutie 5,,6,,7,8. De subcellular localisatie van RNAs is een belangrijke regelgevende mechanisme 9 die verschijnt optreden bij vrijwel alle RNAs 4,10,11. Deze analyses hebben ook aangetoond dat veel afschriften die niet worden gedetecteerd door RNA-seq gemakkelijk worden gedetecteerd door vis 8. De aanpassing van RNA in situ hybridisatie aan 96-wells-platen kunt analyse van maximaal 96 genen van belang op een moment (meer als extra platen worden gebruikt), analyse van grote datasets mogelijk te maken. Door het snijden van de platen in kleinere delen, is de methode ook gemakkelijk aangepast aan een paar monsters. Het protocol geboden is geschikt voor analyse van RNA distributies in de meeste soorten weefsels. Hoewel niet wordt weergegeven, is het aan te passen aan niet -Drosophila weefsels zo goed.

<table><tbody><tr><td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>Gecertificeerd DNase en RNase vrij</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix met kleurstof (Ambiogene)</td><td>Biomart (Canada)</td><td>141106-1K</td><td>Gecertificeerd DNase en RNase vrij</td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>Gecertificeerd DNase en RNase vrij</td></tr><tr><td>96-well filtratieplaat (1,2 um, hydrofiele PVDF membraan)</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Wordt gebruikt om vloeistof van de bodem van de plaat met zwevende weefsels te verwijderen</td></tr><tr><td>96-well PCR plaat (200 &mu;l)</td><td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc-spuitfilter (0,2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc-spuitfilter (0,45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN 96-well opslagplaten voor tests</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>Om bacteriële glycerol-voorraden op te slaan</td></tr><tr><td>AXYGEN Aluminium plaatverzegelingen</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>Om platen te verzegelen</td></tr><tr><td>AXYGEN Breed-uitlopende tips (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>Om monsters over te brengen</td></tr><tr><td>Biotin-SP (lange ruimte) IgG Fractie Monoklonaal Muis Anti-Digoxine</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>Primaire antilichaam voor in situ (voorraadconcentratie 1 mg/ml, werkconcentratie 2,5 &mu;g/ml of 1/400 verdunning.</td></tr><tr><td>BRAND 8-kanaals manifold (autoclaveerbaar)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>Om vloeistoffen van de bovenkant van 96-well PCR platen te verwijderen</td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Voorraadconcentratie 34 mg/ml opgelost en 0,2&mu;m gefilterd in 100 % EtOH (gebruik als 1/1000)</td></tr><tr><td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>Kan worden besteld bij Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octaan)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Antifade reagens in montagemedia</td></tr><tr><td>Digoxigenine-11-uridine-5&rsquo;-trifosfaat</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Embryo-verzamelkooi</td><td>Zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>Grootte: 75 cm X 75 cm X 75 cm gemaakt van Polymethylmethacrylaat</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5804</td><td>Centrifuge voor 96-well platen op A-Z-DWP rotor</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Voorraad: 50 mg/ml. Werkconcentratie 1 mg/ml in hybridisatieoplossing</td></tr><tr><td>Lab Armor Beads</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Vullen verwarmingseenheid</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Monstermixen</td></tr><tr><td>Gaas - 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>Voor het verzamelen van embryo's</td></tr><tr><td>Gaas - 800 microns</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>Voor het vangen van los weefsel / kan worden gebruikt voor speciale buis in figuur 4.</td></tr><tr><td>Micro dekglasjes</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Grootte: 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>Micro glijbanen, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Grootte: 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td><td>Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>Verwijder vloeistof van de bodem van 96-well filterplaat</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>Fixatie</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>Model: DNA Engine PTC-200</td><td>96-well plate PCR en sonde denaturatie</td></tr><tr><td>Picrinezuur oplossing</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>Voor weefselfixatie I oplossing</td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>PP deksel voor 96-well platen, 100/doos</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>Deksel voor het opslaan van platen</td></tr><tr><td>Progene wegwerpbare Reagens Reservoirs (50 ml, steriele)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>Vloeistofregeling</td></tr><tr><td>Progene Pierceable Aluminiumfolie</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Versiegel 96-well plaat, DNase en RNase vrij</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>Embryo permeabilisatie</td></tr><tr><td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Unit/ul</td></tr><tr><td>Ribonucleoside Trifosfaat (NTP) set</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td>RNA sonde synthese</td></tr><tr><td>RNase vrij water</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>RNA sonde synthese</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>Verwijder RNase besmetting</td></tr><tr><td>Single stranded DNA uit zalmtestikkels</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>Voor hybridisatieoplossing</td></tr><tr><td>Skim milk (volle melk poeder)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>Werkconcentratie is 1 % in 1 X PBT of PBTT als blokkeerreagens</td></tr><tr><td>Natriumacetaat (NaOAc) 3 M, pH=5,2 (RNase vrij)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>Werkconcentratie is 10 % (v/v) voor DNA of RNA precipitatie</td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>

hoge resolutie fluorescentie in situ hybridisatie in drosophila embryo's en weefsels met behulp van tyramide signaal versterking

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In onze inspanningen om de patronen van meningsuiting en subcellular localisatie van Drosophila RNAs op basis van de genoom-brede en in een verscheidenheid van weefsels, hebben we talloze aanpassingen en verbeteringen aan onze oorspronkelijke TL in situ protocol van hybridisatie (FISH). Ter vergemakkelijking van doorvoer en kosteneffectiviteit, zijn alle stappen, van sonde generatie op signaal detectie, uitgevoerd met behulp van de exon 96-wells microtiterplaat platen. Digoxygenin (DIG)-gelabelde antisense RNA sondes worden geproduceerd met behulp van cDNA klonen of genomic DNA als sjablonen. Na weefsel fixatie en permeabilization, sondes worden gekruist om afschriften van belang en vervolgens gevonden met behulp van een opeenvolging van anti-DIG antilichaam geconjugeerd met biotine, daar geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) en fluorescently geconjugeerd tyramide, die in het bijzijn van HRP, produceert een zeer reactief intermediair dat zich bindt aan elektron dichte regio's van de onmiddellijk aangrenzende eiwitten. Versterking en localisatie volgt produceren een robuust en sterk gelokaliseerde signaal dat beide transcript van cellulaire en subcellular localisatie wordt vergemakkelijkt. De protocollen die zijn geoptimaliseerd voor de productie van zeer specifieke signalen in een verscheidenheid van weefsels en ontwikkelingsstadia. Verwijzingen zijn ook voorzien van extra variaties waarmee de simultane detectie van meerdere afschriften, of afschriften en eiwitten, op hetzelfde moment.

Figuur 6 ziet u voorbeelden van de resultaten verkregen met behulp van deze procedure. De top 3 panelen tonen voorbeelden van vroege Drosophila embryo's (Figuur 6, panelen A-C), de volgende 3 panelen voorbeelden van late Drosophila embryo's met signalen in verschillende weefsels (amnioserosa, spieren en centrale zenuwstelsel, respectievelijk (Figuur 6, panelen D-F). Volgende zijn voorbeelden van 3de instar larvale weefsels (Figuur 6, panelen G-J). Panelen K en L Toon representatieve beelden uit volwassen gonaden (eierstokken en testis, respectievelijk). Honderden foto's zijn geüpload en geannoteerde in onze doorzoekbaar 'fluorescent in situ fruitvlieg database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Figuur 1. Overzicht van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) protocol en sleutel apparatuur. (A) PCR versterking van cDNA. (B) In vitro transcriptie voor het genereren van gen-specifieke antisense DIG - label RNA sondes in een 96-wells-plaat (foto van de plaat weergegeven in b). (C) en (D): volwassenen (vrouwelijke: mannelijke verhouding 2:1. 300-400 vliegen/fles) vliegen zijn toegestaan om te paren voor 3-4 dagen. Embryo's uit een overnachting collectie op standaard maïsmeel voedsel bij 25 ° C worden overgebracht naar een goed geventileerde plastic doos (1 L voor Maïsmeel food in een container formaat: 8 "X 8" X 3" LWH) of om nieuwe flessen houden van een goede larvale dichtheid. Voor weefsel collectie, moet actieve gist poeder worden bestrooid op de top van het voedsel op 24, 48 h na ei leggen (AEL). (E tot H): Fluorescent in situ hybridisatie experimenten uitgevoerd meer dan 3 opeenvolgende dagen. Voor embryo's of weefsels die doen niet zweven, door een 96-Wells PCR plaat te gebruiken zoals in de foto b met 8-kanaals aspirator (foto c). Voor weefsels die, zoals de meeste larvale weefsels zweven, gebruik van een filter-bodem plaat (foto in d) en vloeistof afzuigen van bodem met een spruitstuk aspirator met behulp van lage druk (foto in e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figuur 2. Bepaling van RNA sonde opbrengst. Nieuw gesynthetiseerd antisense RNA sondes waargenomen op een 1% agarose gel (5 µL/lane). De opbrengst kan worden gecategoriseerd (gebaseerd op de intensiteit van de band) als "laag rendement' in stegen 3 en 10, 'typische opbrengst' in rijstroken 1, 4, 5, 6 en 8 of 'high yield' in rijstroken 2, 7, 9, 11 en 12. Voor monsters met een 'typische opbrengst', gebruik 10-15 µL van sonde verdund in 100 µL van hybridisatie oplossing voor elk experiment in situ . Verdun monsters met 'hoge opbrengsten' van sonde met extra hybridisatie oplossing volgens de intensiteit van de band ten opzichte van een 'typische sonde' intensiteit. Willen hebben min of meer gelijk definitieve sonde concentraties in elk putje. De pijl wijst naar één van de sondes van RNA, de hogere band op elke baan is de oorspronkelijke DNA-sjabloon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figuur 3. Belangrijke stappen voor een grootschalige embryo's worden verzameld en fixatie. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figuur 4. Zelfgemaakte buis voor het verwijderen van de vloeistof uit de larvale of zwevende weefsels. Sommige larven en de volwassen weefsels zweven in oplossing tijdens fixatie. Deze eenvoudige tool bestaat uit een nylon gaas gehouden door een 200 µL wenk, gevolgd door een 1 mL tip als een adapter om verbinding met een aspirator te knippen. Vloeistof kan veilig worden verwijderd zonder het verliezen van een weefsel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figuur 5. Tyramide signaal amplificatie. (1) antisense RNA-sonde DIG-label hybridizes met endogene gevoel RNA. (2) Immuno-affiniteit binding tussen Biotine-geconjugeerde primair antilichaam en DIG-UTP. (3) HRP geconjugeerd streptavidine bindt biotine. (4) HRP katalyseert de cyanine 3-tyramide en waterstofperoxide reactie tot kortstondige cyanine 3-tyramide radicalen. (5) cyanine 3-tyramide radicalen binden aan tyrosine residuen op nabijgelegen eiwitten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Figuur 6. Vertegenwoordiger in situ hybridisatie beelden. Elk deelvenster ziet u een voorbeeld van een verschillende RNA (getoond in cyaan) en kernen gekleurd met DAPI (afgebeeld in het rood). (A-C) Voorbeelden van vroege Drosophila embryo's. (D, F) Voorbeelden van late Drosophila embryo's. (G-J) Voorbeelden van 3e instar Drosophila larvale weefsels (malphigian tubuli, middendarm, speekselklier en spier respectievelijk). (K) volwassen eierstok. (L) volwassen testis. Elk paneel bevat de naam van het gen dat de sonde is kwekers aan. Schaal bars = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van RNA-transcripten op hun oorspronkelijke plaats binnen cellen en weefsels. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de cel- en ontwikkelingsbiologie, zoals de exacte locatie van een RNA binnen een cel, een weefsel of een embryo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de ruimtelijke distributie van RNA detecteert met een hoge resolutie en gevoeligheid, tegen lage kosten in vergelijking met andere methoden.We hebben dit protocol oorspronkelijk ontwikkeld om de subcellulaire distributies van zoveel mogelijk Drosophila-RNA's te bestuderen. Dit was bedoeld om de omvang en diversiteit van de subcellulaire distributies te bepalen. We zijn met het project begonnen door met embryo's te werken, maar later hebben we het protocol aangepast en geoptimaliseerd zodat we op hoge doorvoersnelheid konden werken met weefsels die geprepareerd waren uit larven en vliegen.Het meest uitdagende aspect van de procedure is het aantal stappen en de daaruit voortvloeiende foutgevoeligheid, evenals de noodzaak om de afwezigheid van RNA's tijdens de productie van de probes te waarborgen. Om de doorvoersnelheid en kosteneffectiviteit te verhogen, maken de in deze video gedemonstreerde procedures gebruik van 96-well microtiterplaten voor alle stappen. Deze methode is bovendien eenvoudig aan te passen aan kleinere steekproeven door de platen in strips van acht of 12 wells te snijden.Begin met het verdunnen van 10 µL van een overnight bacteriële kweek in 90 µL geautoclaveerd dubbel gedestilleerd water in elke well van een nieuwe 96-well PCR-plaat. Denatureer het DNA bij 95 °C in een thermocycler gedurende vijf minuten. Plaats de plaat onmiddellijk gedurende ten minste vijf minuten op ijs.Stel de PCR-reacties op in een nieuwe 96-well PCR-plaat. Gebruik de juiste universele primers en verdeel 48 µL van de PCR-mastermix over elke well. Voeg per well twee µL van elk gedenatureerd plasmide-DNA-template toe.Voer de amplificatie uit in een PCR-apparaat met 96 wells. Wanneer de amplificatie is voltooid, wordt het PCR-product geprecipiteerd met een mengsel van ethanol en natriumacetaat. Bewaar de monsters gedurende 30 minuten bij minus 80 graden Celsius.Centrifugeer de 96-wells plaat bij 2.250 ×g bij vier graden Celsius gedurende 45 tot 60 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant met een achtkanals vacuümm manifold-pipet met een structuur die voorkomt dat de tips de bodem van de wells raken bij het opzuigen van de pellets. Was één keer met 160 µL koude 70% ethanol.Centrifugeer bij 2.250 ×g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Keer de 96-wellsplaat voorzichtig om op een papieren handdoek om de laatste druppels vloeistof uit elke well te verwijderen en laat de DNA-pellets een uur aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Resuspendeer het neergeslagen DNA in 25 µL RNase-vrij water.Controleer de grootte en opbrengst van de PCR-producten via agarosegelelektroforese. Stel de in vitro transcriptiereacties op door de juiste componenten aan elke put van een nieuwe 96-well PCR-plaat toe te voegen. Voeg 7.5 microliters DNA-template toe aan elke overeenkomstige put.Dek de plaat af met afdichtingsband. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 3,5 tot 4 uur. Voeg vervolgens aan elke put een mastermix toe bestaande uit DEPC-behandeld dubbel gedestilleerd water, 100% ethanol en 3 M natriumacetaat.Bewaar 30 minuten bij minus 80 graden Celsius. Centrifugeer de plaat en was de wells zoals eerder beschreven. Resuspendeer de geprecipiteerde probe in 25 microliters DEPC-behandeld dubbel gedestilleerd water.Pas gesynthetiseerde antisense RNA-probes werden geladen op een 1% agarosegel om de integriteit en opbrengst te controleren. Op basis van de intensiteit van de band kan de opbrengst worden gekarakteriseerd als een lage, typische of hoge opbrengst. Nadat er vijf microliters van elke probe is gebruikt voor agarosegelelektroforese, wordt de resterende 20 microliters gemengd met 100 microliters hybridisatieoplossing en bewaard bij min 80 graden Celsius tot gebruik.Om deze procedure te starten, plaatst u 20 tot 30 larven in een Petrischaal met koud PBS in fix one-oplossing en koelt u deze twee minuten op ijs om de beweeglijkheid van de larven te verminderen. Disseceer de larven onder de dissectiemicroscoop. Gebruik een scherp pincet om het anterieure deel voorzichtig te openen en knijp de weefsels van posterieur naar anterieur uit.Breng de gedissecteerde weefsels na maximaal 15 minuten over naar een buisje van 1,5 milliliter voor fixatie en plaats deze op ijs. Verwijder de PBS en voeg 800 microliters fix one-oplossing toe. Incubeer 30 minuten op een benchtop-mixer, samen met andere weefsels die eerder zijn verzameld voor fixatie.Spoel de weefsels één keer met 800 µL PBTT en bewaar de buis op ijs terwijl aanvullende weefsels worden verzameld en gefixeerd. Voeg alle gedissecteerde weefsels samen in één plastic buis van 15 mL met een gaasje in de dop. Aspireer het overtollige vloeistof door het gaasje in de dop.Was met 10 milliliters PBTT en spoel na met 10 milliliters PBS. Om de endogene mierikswortelperoxidase-activiteit te blokkeren, wordt vijf milliliters 0,3% waterstofperoxide in PBS toegevoegd en wordt dit 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Was twee keer met 10 milliliters PBTT.Permeabiliseer de weefsels door 10 milliliters vooraf gekoelde 80%acetone toe te voegen en 10 minuten te incuberen bij minus 20 degrees Celsius. Was tweemaal met 10 milliliters PBTT om de weefsels te rehydrateren. Bewaar de weefsels na het wassen, zoals beschreven in het tekstprotocol, in hybridisatieoplossing bij minus 20 degrees Celsius.Indien de filtereenheid de volgende dag niet wordt gebruikt, dient deze te worden vervangen door een gewone dop. Aliquoteer ongeveer 20 µL weefsel per put in een 96-well PCR-plaat op ijs. Verwijder de hybridisatieoplossing van de weefsels met een achtkanals manifoldpipet.Voeg 100 µL vers gedenatureerde hybridisatieoplossing toe aan elke put en dek deze af met sealing tape. Pre-hybridiseer de weefsels bij 56 °C met behulp van een dry-bath verwarmingstoestel met metalen kraaltjes gedurende minimaal 2,5 tot drie uur. Denatureer 100 µL van de bereide probe in een 96-well PCR-plaat bij 80 °C gedurende vijf minuten.Onmiddellijk vijf minuten op ijs koelen. Verwijder de prehybridisatielooplossing uit de weefsels en voeg gedenatureerde genspecifieke probes toe aan elk monster. Dek af met aluminium sealing tape en hybridiseer bij 56 °C onder metalen kralen in een dry bath heating unit gedurende 16 tot 18 uur overnacht.Voorafgaand aan het starten van de sonde-detectieprocedure moeten alle benodigde oplossingen worden voorverwarmd in de verwarmingseenheid van 56 °C. Breng de gehybridiseerde weefsels voorzichtig over naar een 96-wellplaat die geschikt is voor een vacuümmanifold voor multi-wellplaten. De wells van deze platen hebben membraanbodems waardoor de inhoud onder vacuüm kan worden verwijderd.Verwijder de probes uit de 96-well plaat en was de monsters met mengsels van hybridisatieoplossing en PBTT volgens de stappen die in deze tabel worden aangegeven in de verwarmingsunit op 56 °C. Na de derde wasbeurt met PBTT haalt u de 96-well plaat uit de verwarmingsunit, verwijdert u de PBTT-oplossing en blokkeert u de weefsels met PBTTB op een mengapparaat op het aanrecht bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg 100 µL antilichaamoplossing per well toe en incubeer dit gedurende twee uur op de monster-mengunit.Na het spoelen met PBTTB zoals beschreven in het tekstprotocol, voegt u 100 µL Streptavidine-mierikswortelperoxidase-oplossing per well toe en incubeert u dit gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was tweemaal met PBTTB gedurende vijf minuten per wasbeurt. Incubeer de weefsels daarna met DAPI-oplossing zoals beschreven in het tekstprotocol.Begin deze procedure door de monsters te incuberen met Tyramide-oplossing en laat de monsters twee uur lang incuberen op de benchtop-mixer in het donker. Verwijder de Tyramide-oplossing uit de weefsels zodra de incubatie is voltooid. Na het wassen met PBT en PBS zoals beschreven in het tekstprotocol, voegt u 150 microliters antifade montage medium per put toe.Bewaar de monsters een nacht bij vier graden Celsius zodat de weefsels naar de bodem van het putje of de buis kunnen zinken. Monteer de monsters de volgende dag op een microscoopglas en verzegel deze met een dekglas. Maak tot slot beelden van de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop.Hier worden voorbeelden getoond van resultaten die zijn behaald met deze procedure voor vroege Drosophila-embryo's en late Drosophila-embryo's met signalen in de amnioserosa, spieren en het centrale zenuwstelsel. De naam van het gen waaraan de probe is gehybridiseerd, wordt in elk paneel weergegeven. Vervolgens volgen voorbeelden van weefsels van larven in het derde stadium, malpighische buisjes, middendarm, speekselklier en spieren.Ten slotte worden representatieve afbeeldingen van volwassen eierstokken en volwassen testikels getoond. Zodra men de methode beheerst en deze efficiënt uitvoert, kan deze techniek in slechts twee dagen worden voltooid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er gewerkt moet worden op een RNase-vrije werkbank met RNase-vrije tips, buisjes, platen en oplossingen, en dat handschoenen gedragen moeten worden.Als u met een groot aantal monsters of probes werkt, haast u zich dan niet door de procedure. Daarnaast is het raadzaam om manieren te bedenken om bij te houden in welke fase u zich bevindt. Wanneer u deze procedure volgt, kunt u deze ook combineren met andere methoden, zoals het detecteren van meerdere probes, probes met eiwitten of cellulaire markers.Hiermee kunt u aanvullende vragen beantwoorden, zoals relatieve expressiepatronen, identiteiten van cellen en subcellulaire compartimenten, en effecten in verschillende genetische achtergronden of ziekten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de meeste typen in situ hybridisatie uitvoert in elk type weefsel of embryo. Vergeet niet dat het werken met reagentia zoals formaldehyde, waterstofperoxide en formamide uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van de procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals een juiste hantering en afvoer.

high-resolution-fluorescent-situ-hybridization-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om hybridisatiekettingreactie fluorescerende in situ hybridisatie (HCR-FISH) uit te voeren in oogtische lobben van Drosophila melanogaster-larven . Procedures voor probe-ontwerp, hybridisatie, amplificatie en weefselmontage worden gedetailleerd om de visualisatie van de zich ontwikkelende optische kwab te vergemakkelijken.

Hybridisatiekettingreactie FISH in de zich ontwikkelende Drosophila optische lob

Leer RNA-detectie in Drosophila embryo's en weefsels met tyramide signaalversterking. Deze methode biedt hoge resolutie en gevoeligheid tegen lage kosten voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Meer video's verkennen