Name: Optische Screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes op Ex Vivo menselijke longweefsel door Confocale Laser Endomicroscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer optische screening van bacteriespecifieke sondes op ex vivo menselijk longweefsel met behulp van fibered confocal fluorescence microscopy. Deze methode identificeert kandidaat-probes voor klinische beeldvorming van infecties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zouden graag willen bedanken Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Verenigd Koninkrijk) interdisciplinaire samenwerking op onderzoeksgebied subsidie EP/K03197X/1, het ministerie van volksgezondheid en de Wellcome Trust via de gezondheid innovatie Challenge Fund (HICF) . Financiering referentienummer: 0510-069.

Alle menselijke longweefsel na de geïnformeerde toestemming werd verkregen en de studie werd goedgekeurd door de regionale ethische commissie.
1. bereiding van biologische monsters
<ol><li>
Voorbereiding van sondes
	<ol>
<li>Make-up van een stamoplossing van 1 mM van elke sonde (bijvoorbeeldcalceïne AM, UBI-3, UBI-10, etc.) in steriele dH2O, met behulp van een subtiel evenwicht te wegen de gevriesdroogde probe samengestelde11. Bereken het volume van de dH2O toe te voegen op basis van de gewogen massa en moleculair gewicht van de sonde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van bacteriële culturen Opmerking: Voor deze methode, Staphylococcus aureus werd gebruikt als de exemplar stam. Een juiste bacteriële stam kan worden geselecteerd. Elke commerciële kleurstof die bacteriën met een passende excitatie en emissie spectra etiketten kan worden geselecteerd om positief label de bacteriën.<ol>
<li>Selecteer een één kolonie van gewenste bacteriële stam in een verse lysogenie Bouillon (LB) agarplaat met behulp van een steriele lus. Beënt de kolonie in 10 mL LB in een tube van 50 mL centrifuge door het einde van de lus dompelen in de cultuur-media. Incubeer bij 37 ° C, 250 rpm voor 16 h (of 's nachts).</li>
		<li>De OD-595 van de overnachting cultuur bepalen door 100 µL van de overnachting cultuur aan 900 µL LB in een cuvet van 1 mL toe te voegen. Meten van de OD op 595 (met behulp van een cuvet met 1 mL LB als een leeg) nm in een spectrofotometer. Vermenigvuldig de verkregen OD met 10 tot het verkrijgen van de OD voor de overnachting cultuur.</li>
		<li>Subcultuur de overnachting cultuur. Dit doen door het aanpassen van de optische dichtheid bij 595 nm (OD595) tot 0.1 in 10 mL vers pond berekenen van het vereiste volume van overnachting cultuur moet worden toegevoegd aan de 10 mL verse LB aan te passen van de OD595 tot 0,1. Incubeer de cultuur bij 37 ° C, 250 rpm tot de cultuur bereikt halverwege log fase (OD595 van 0,6 - 0,8), ongeveer 4 uur.</li>
		<li>Meet de extinctie van de cultuur (stap 1.2.2) en oogst 1 x 108 kolonievormende eenheden (kve) (OD595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) van de bacteriecultuur in een 1,5 mL microtube (bijvoorbeeldals de bacteriecultuur OD595 is 0.6, verzamelen 1.67 mL). Centrifugeer de cultuur bij 10.000 x g bij kamertemperatuur voor 1 min aan de pellet van de bacteriën. Wash de pellet tweemaal in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door het resuspending (pipetteren omhoog en omlaag zorgvuldig) de pellet in 1 mL PBS, centrifugeren zoals hierboven, teruggooi het supernatant en herhalen. Wees voorzichtig niet te verjagen van de bacteriële pellet bij het verwijderen van de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de laatste pellet in 1 mL PBS. Opmerking: Bereiden zoveel monsters zoals vereist voor elke labeling procedure. Het protocol kan hier worden onderbroken voor maximaal 1 uur, gevolgd door de stap, 1.2.5.1, 1.2.5.2 of 1.2.5.3.</li>
		<li>Bacteriële kleuring<ol>
<li>Om de bacteriën met calceïne AM van een label, voegt u de kleurstof toe aan een eindconcentratie van 1 µM in de gewassen bacteriecultuur. Incubeer de cultuur gedurende 30 minuten bij 37 ° C met schudden bij 300 omwentelingen per minuut. De counterstained bacteriële suspensie in PBS 3 keer wassen door centrifugeren zoals in stap 1.2.4 te verwijderen overtollige kleurstof. Resuspendeer in 1 mL PBS, 100 µL 1:1 in PBS te verkrijgen van 200 µL van OD595 0.5 calceïne ben gebeitst bacteriën verdund. Het protocol kan hier voor maximaal 1 uur worden onderbroken.</li>
			<li>Om een label Verdun de bacteriën met test sondes (bijvoorbeeldUBI-3 of UBI-10), 100 µL van de bacteriecultuur 1:1 in PBS te verkrijgen OD595 0,5 in 200 µL PBS. Voeg dat een van de sondes naar een eindconcentratie van 10 µM. omkeren de microtube meerdere malen om homogenisatie van het mengsel van de bacteriën en de sonde. Opmerking: Imaging moet worden uitgevoerd onmiddellijk na de toevoeging van de sonde na te bootsen de klinische scenario.</li>
			<li>Ter voorbereiding van het besturingselement OD onbevlekt bacteriële monsters, verdunde 100 µL van de cultuur 1:1 met PBS te verkrijgen van 200 µL van onbevlekt595 0,5 monster.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van ex vivo menselijke longweefsel Opmerking: Menselijke longen weefselsteekproeven zijn verkregen van patiënten die een chirurgische resectie voor longcarcinoom. Alle weefsel gebruikt voor imaging is verkregen uit monsters van normaal longweefsel verwijderd van het kankergezwel. Monsters werden genomen vers van de operatiekamer en opgeslagen in slangen of centrifuge buizen bij-80 ° C tot gebruik.<ol>
<li>Onmiddellijk vóór imaging, de menselijke Long weefsel monster uit de vriezer op droog ijs te verwijderen. Bij kamertemperatuur, toestaan dat het weefsel te ontdooien iets; net genoeg om te worden gesneden met een scalpel in 1 x 4 mm2 secties. Opmerking: Het niveau van het ontdooien is belangrijk; ook bevroren en het weefsel zal niet snijd zonder chippen af, ook ontdooid en het weefsel is te zacht slice.</li>
		<li>Plaats de gesneden menselijke longweefsel met pincet in wells van een 96-Wells duidelijk flat-onderkant weefselkweek plaat. Retourneren ongebruikte menselijke longweefsel onmiddellijk aan de opslagcontainer en plaats op droog ijs voor vervoer terug naar de vriezer-80 ° C</li>
		<li>Voeg 100 µL PBS aan elke Long weefsel monster met een pipet. Gebruik de pipet tip om al het weefsel is bedekt met de PBS (en niet vast aan de wanden van de put). Het weefsel zal zwellen lichtjes en kan drijven. Laat de PBS op het monster gedurende een paar minuten zodat elke bloed naar het uitspoelen van het weefsel naar de oplossing. Verwijder zo veel van de PBS mogelijk. Het weefsel kan blokkeren het einde van de pipet tip; proberen om de hoek van de plaatsing van de plaat/tip om dit te voorkomen.</li>
		<li>Pipetteer 100 µL van onbevlekt, calceïne ben label of testpunt label bacteriën aan elke goed met longweefsel. Ook instellen naar besturingselementen met longweefsel en 100 µL PBS. Deze controleputjes, kunnen sondes zonder bacteriën worden toegevoegd voor het meten van een eventuele verhoging in achtergrond fluorescentie en/of aspecifieke activatie van de sonde longweefsel alleen. Een goed met longweefsel en PBS moet ook worden opgenomen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. imaging met de CLE apparaat met FCFM
<ol><li>
Het instellen van CLE apparaat Opmerking: Bereid de CLE systeem 20 min vóór kalibratie aan het toestaan van de laser om op te warmen.<ol>
<li>Druk op de aan/uit-schakelaar op de achterkant van de transformator van het systeem en de aangewezen computer aanzet. Druk op de aan/uit-knop op de voorkant van de laser scanning unit (LSU). Bevestig het uiterlijk van het groene licht, die aangeeft dat het apparaat is ingeschakeld.</li>
		<li>Dubbelklik op het pictogram van de software CLE. Voer de login-gegevens en wacht op de LSU initialiseren (10-30-s).</li>
		<li>Voor gebruik van nieuwe FCFM imaging vezels, is de installatie met de meegeleverde CD nodig. Plaats de installatie-CD in de computer CD-station en volg de instructies op het scherm.</li>
		<li>Reinig de FCFM imaging glasvezel connector unit met een schonere vezel. Wrijf de connector op de schoonmaak lint in een voorwaartse beweging om elke stof/vuil te verwijderen. Verwijder de gele beschermkapje aan de voorkant van de GVE.</li>
		<li>Bereid de LSU-hub door zachtjes de zilveren hub linksom draaien totdat het stopt. Steek de FCFM imaging glasvezel connector in de hub met de platte kant van de verbindingslijn die naar boven zijn gericht. De vezel op zijn plaats houden en de zilveren hub rechtsom draaien totdat het tweemaal klikken. De verbinding voltooien door het draaien van de zilveren hub met de klok mee door een verdere 45°. Opmerking: Als de vezel wordt niet herkend, Controleer dat de FCFM vezel imaging is geïnstalleerd en in de juiste richting aangesloten.</li>
		<li>Volg de instructies die zal pop-up voor het voltooien van de FCFM imaging vezel kalibratie. Er zijn 3 stappen: (1) FCFM imaging vezel test (stappen 2.1.7 - 2.1.8), (2) achtergrond acquisitie (stap 2.1.9), (3) vezel detectie (stap 2.1.10).</li>
		<li>Druk op de knop 'start laser' op het scherm. De laser zal centrum.</li>
		<li>Selecteer verse flesjes (gele: kalibreren; rood: schoon; blauw: spoelen) uit de kalibratie kit en volg de instructies op het scherm: het distale uiteinde van de FCFM imaging vezel in de gele flacon plaatsen en kijken voor de verhoging in de fluorescentie op de monitor, dan plaatst u de de tip van de vezel in de rode flacon (zonder roeren). Wacht totdat de fluorescentie (zoals weergegeven op het computerscherm) te verdwijnen. Ten slotte spoel de fiber-tip in de blauwe flesje. Opmerking: Als de fluorescentie niet verdwijnt, schoon van de vezel FCFM imaging met 8% H2O2 en lens reinigen van weefsels en opnieuw beginnen. Herhaal de procedure tot bevredigende resultaten worden verkregen (de beeldkwaliteit is duidelijk, en geen merken tegen vuil zijn schijnbare).</li>
		<li>Plaats de FCFM imaging vezel in de blauwe flacon. Druk op 'start laser' gevolgd door 'berekenen' zodra dit een optie.</li>
		<li>Plaats de FCFM imaging vezel in de gele flacon. Druk op 'start laser' gevolgd door 'berekenen' zodra dit een optie.</li>
		<li>Tijdens de automatische kalibratie, schoon het distale einde van de vezel door te plaatsen in de rode flesje voor imaging FCFM > 10 s, gevolgd door de blauwe flacon voor > 4 s, zoals aangegeven door de software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gegevensverzameling met CLE
	<ol>
<li>Na de installatie, een venster Opslaglocatie en bestand voorvoegsel selecteren wordt geopend. Selecteer de gewenste map voor de opslag van gegevens en het voorvoegsel van de naam dienovereenkomstig.</li>
		<li>Plaats de voetpedalen zodat ze gemakkelijk bereikbaar door de exploitant. Linker pedaal: laser in/uit; centrum pedaal: onderbreken; rechts pedaal: opnemen/stoppen. Opmerking: De besturingselementen van de laser kunnen ook worden betreden via de regelaars.</li>
		<li>Klik op 'start' op het scherm of druk op de linker voet / pedaal inschakelen van de laser. Dit start verwerving en beelden met behulp van 100% laser macht en een framesnelheid van 12 frames per seconde (standaardinstellingen) te verkrijgen. Opmerking: Voor andere toepassingen, deze instellingen kunnen worden gewijzigd op het scherm indien nodig, afhankelijk van het type van de steekproef.</li>
		<li>Het imago van elk van de monsters van de bacteriële suspensie.<ol>
<li>Steek de distale uiteinde van de FCFM imaging vezel en verplaatsen van de vezel langzaam door de schorsing te ondervragen van het monster.</li>
			<li>Record video's van iedere lengte (maximaal 10 min) door het indrukken van de rechter voetpedaal of de record regelaars, selectie van de vezel beweegt langzaam rond het monster.</li>
			<li>Reinig het distale einde van de vezel FCFM imaging met 8% H2O2 en lens reinigen van weefsels tussen de monsters. Opmerking: De typische video lengtes van 10-30-s zijn voldoende voor in vitro imaging.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Het imago van elk van de Long weefselmonsters.<ol>
<li>Plaats de distale uiteinde van de FCFM imaging vezels in het monster, ervoor te zorgen dat rechtstreeks contact tussen het einde van de vezel en het weefsel wordt gemaakt. Voorzichtig verplaats ik de zinsnede van de beeldvorming vezel rond het monster te ondervragen. Opmerking: Opheffing van het einde van de vezel uit de buurt van het weefsel worden verwijderd het weefsel van het brandvlak; Nochtans, kan dit worden gebruikt om het imago van gelabelde bacteriën die het weefsel niet worden nageleefd.</li>
			<li>Record video's van iedere lengte (maximaal 10 min) door het indrukken van de rechter voetpedaal of de record regelaars, selectie van de vezel beweegt langzaam rond het monster. Opmerking: Doorgaans, video lengtes van 30 s volstaan voor ex vivo imaging op weefsel.</li>
			<li>Reinig het distale einde van de FCFM imaging vezel met lens reinigen van weefsels en 8% H2O2 tussen de monsters.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het uitschakelen van het systeem
	<ol>
<li>De laser uit te schakelen door op de linker voetpedaal te drukken of door te klikken op de knop op het scherm.</li>
		<li>De FCFM imaging vezel verbreken door de CLE-apparaat door de zilveren LSU hub linksom draaien totdat het stopt. Verwijder de FCFM imaging vezel van de LSU-hub door zachtjes trekken de fiber-connector van de GVE.</li>
		<li>Reinig en Desinfecteer de vezel FCFM imaging met 8% H2O2 en lens reinigen van weefsels. De beschermende caps terugkomen op het proximale einde van de FCFM imaging vezel en de voorkant van de LSU-eenheid. Plaats de vezel zachtjes in de opbergdoos.</li>
		<li>Sluit de gegevens vastleggen software en alle opgeslagen bestanden kopiëren naar een externe USB-apparaat. De computer afsluiten en de LSU-apparaat uitschakelen door te drukken op het voorpaneel I/O voor 3 s totdat het groene licht verdwijnt.</li>
		<li>Beschikken over menselijke longweefsel en bacteriën volgens plaatselijke voorschriften.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de gegevensanalyse
<ol><li>Open de software en de bestanden voor analyse door het selecteren van de juiste directory op de computer via het pictogram 'Ga naar' op het dashboard software importeren. U kunt ook kunnen bestanden slepen en neerzetten in het dashboard van de software.</li>
	<li>Dubbelklik op elk videobestand om ze te openen. De video zal automatisch afspelen met geoptimaliseerde kleur opzoektabel (LUT) en kleurentabel aanpassen. Het uitschakelen van de automatische intensiteit schalen, door te klikken op de Toverstafknop boven de bar van de schaal van de intensiteit. De functie is uitgeschakeld als er geen zwarte schaduw rond de knop. Opmerking: Automatische intensiteit schaal moet worden uitgeschakeld om te voorkomen dat continu contrastverbetering gedurende elke video, waardoor het onmogelijk om te vergelijken en analyseren van video's van de dezelfde gegevensset.</li>
	<li>Selecteer de gewenste intensiteit schalen door het bewegen van de minimale en maximale balken geven de beste contrast. Het hulpprogramma histogram gebruikt wanneer de intensiteit schalen om ervoor te zorgen het breedste dynamisch bereik selecteren is gevangen. Opmerking: Zorg ervoor dat het dynamisch bereik is zodanig dat de beelden zijn niet verzadigd (d.w.z. beperken de witte gebieden van de afbeelding, die duiden op een verzadiging), zodat de lage intensiteit functies zijn niet gemist.</li>
	<li>Zodra de gewenste schaal is bereikt, klik met de rechtermuisknop op de dropdown menuknop vermeld als 'Default (groen)'. Selecteer de optie om op te slaan de LUT. De LUT op een gewenste locatie opslaan.</li>
	<li>Voor elkaar video binnen de gegevensset toepassen van de dezelfde LUT door rechts te klikken op de 'Default (groen)' drop-down menu en selecteer 'Load LUT'. Selecteer het juiste bestand toe te passen consistent intensiteit schalen naar alle video's binnen een dataset.</li>
	<li>Verwerkte video's exporteren door te klikken op de knop 'film reel'. Selecteer de gewenste videoformaat, b.v. 'voor presentatiedoeleinden', die een .mpg bestand zal opleveren. Druk op 'Exporteer' en koos voor de locatie van het bestand waarop het videobestand wilt opslaan. Momentopnamen van enkele frames kunnen worden geëxporteerd door te klikken op de cameraknop ''. Het is mogelijk een .png, .bmp of .jpg bestand op te slaan. Kies de bestemming van het bestand en druk op opslaan. Opmerking: Video's kunnen vervolgens worden geïmporteerd in ieder software voor bereiding van presentaties of verdere kwantificering. Gelabelde bacteriën worden gevisualiseerd als groene 'knippert' stippen in de video. Het Long weefsel structuur zal blijken als geordende fluorescerende strengen, met alveolaire ruimte wordt zwart weergegeven.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf">https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf</a> (2016).</li>
<li>Caliendo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+Tests%2C+Better+Care%3A+Improved+Diagnostics+for+Infectious+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases.</a> Clin. Infect. Dis. 57, (suppl_3) 139-170 (2013).</li>
<li>Zumla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point+of+care+diagnostic+tests+for+viral+and+bacterial+respiratory+tract+infections-needs%2C+advances%2C+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects.</a> Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).</li>
<li>Neumann, H., Kiesslich, R. <a target="_blank" href="NULL">Yamada's Textbook of Gastroent</a>. , John Wiley & Sons. Ltd. 2944-2949 (2015).</li>
<li>Chauhan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.giejournal.org/article/S0016-5107(14)01856-2/pdf">Confocal laser endomicroscopy.</a> Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).</li>
<li>Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+in+endoscopy%3A+endomicroscopy+and+endocytoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).</li>
<li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+endomicroscopy+for+non-invasive+head+and+neck+cancer+imaging%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review.</a> Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).</li>
<li>Thiberville, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+in+vivo+fluorescence+microimaging+of+the+alveolar+ducts+and+sacs+during+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy.</a> Eur Respir J. 33, (2009).</li>
<li>Thiberville, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescence+endomicroscopy+of+the+human+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways.</a> Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).</li>
<li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).</li>
<li>Akram, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/sc/c5sc00960j#!divAbstract">A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue.</a> Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).</li>
<li>Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+ecology+of+the+lung%3A+new+conceptual+models+of+pulmonary+microbiology+and+pneumonia+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis.</a> Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).</li>
<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li>
<li>Magiorakos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+carbapenem+resistance+in+Europe%3A+just+the+tip+of+the+iceberg%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6(2013).</li>
<li>Chastre, J., Fagon, J. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilator-associated+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Ventilator-associated Pneumonia.</a> Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).</li>
<li>Krstajić, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+widefield+fluorescence+microendoscopy+enables+multiplexed+molecular+imaging+in+the+alveolar+space+of+human+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue.</a> J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).</li>
</ol>

KD: Oprichter directeur van Edinburgh moleculaire beeldvorming. Ontvangen adviesbureau van Mauna Kea technologieën als adviseur.
MB: Oprichter directeur van Edinburgh moleculaire beeldvorming.

Infecties van de lagere luchtwegen rekening voor de tweede hoogste ziektelast wereldwijd12,13, en een aanzienlijke stijging van het aantal van infecties toegeschreven aan antimicrobiële resistente bacteriën geweest gerapporteerde14. Longontsteking blijft een veel voorkomende oorzaak voor hospitalisatie. In de ICU, de ontwikkeling van een longontsteking wordt verergerd door diagnostische onzekerheid en wordt geassocieerd met een zeer hoge sterfte tarief15. Tijdens het begin van longontsteking vermenigvuldigen de bacteriën binnen de alveolaire ruimte van de distale Long, een gebied dat is relatief steriel, met minimale microbiota in gezondheid.
Deze methode beschrijft relatief late stadium ex vivo validatie van bacteriën-specifieke optische beeldvorming sondes11, maar het ontwerp, de synthese en evaluatie van de sonde voorafgaand aan het begin van deze stap van de validatie is absoluut noodzakelijk, als eerder is laten zien11 .
CLE is een opkomende klinische techniek voor het ondervragen van ziekte verklaart in situ in real-time. Het biedt vele voordelen ten opzichte van traditionele technieken voor het onderzoeken van verdachte pulmonaire pathologie, die een biopsie en de collectie van de lavage vloeistof kan veroorzaken. Biopsieën zijn invasief en morbiditeit en mortaliteit bij geventileerde patiënten kunnen veroorzaken, en verzamelde lavage vloeistof is vaak besmet met bacteriën uit de bovenste luchtwegen. Het gebruik van CLE in de opsporing van longontsteking is echter enigszins beperkt door de slechte beschikbaarheid van compatibele imaging sondes die functionele informatie van ziekte, ondanks veel gezamenlijke inspanningen10kan bieden. CLE combineren met optische agenten biedt het vooruitzicht van de diagnose longontsteking sneller en minder gebeurt vergeleken met de huidige standaard praktijk.
De kritische stappen bij dit protocol zijn in de bereiding van de monsters en de installatie van de CLE-platform. Verkrijgen van menselijke weefsels die relevant zijn voor het uiteindelijke klinische toepassing is ook belangrijk, zoals menselijke longweefsel zoals aangetoond in deze studie. Het is noodzakelijk om het gebruik van menselijk weefsel, omdat de omvang van weefsel autofluorescence grote variatie tussen soorten toont, en kan daarom het misleiden van de gevoeligheid van de bacteriën-sonde image wordt gemaakt. Bovendien, het verkrijgen van ethiek voor ophalen en het gebruik van menselijke longweefsel is essentieel. Bij een technische niveau, juiste reiniging is bevestiging van de beeldvorming vezel aan de beeldvorming LSU platform, en de kalibratie essentieel voor goede resolutie en consequente beeldvorming, zoals is het waarborgen van gelijke aantallen bacteriën worden toegevoegd aan elk monster Long weefsel. Om verdere uitbreiding van het nut van deze methode voor het screenen van de panelen van sondes, is het noodzakelijk het procédé met allerlei ziekteverwekkers, zoals die kunnen worden van de causatieve agenten van longontsteking.
De grootste beperking van deze techniek is dat het klinisch goedgekeurde CLE apparaat slechts één laser heeft (488 nm). Dus, de selectie van fluorophore voor sonde ontwerp is momenteel beperkt voor gebruik met dit systeem, hoewel klinisch goedgekeurd één kleur apparaten bestaan met excitatie golflengten van 660 nm en nabij-infrarood. Het is zeer wenselijk dat een tweede laser regel uitgevoerd binnen hetzelfde apparaat om een sonde met een spectraal verschillende fluorophore om de gevoeligheid van bacteriën-sonde over het niveau van weefsel autofluorescence worden ontwikkeld. Terwijl dual-kleur CLE apparaten onder ontwikkeling zijn, ze zijn ofwel niet klinisch goedgekeurd en/of hun kosten is aanzienlijke16.
Overbrugt de kloof tussen conventionele in vitro technieken zoals stroom cytometry en CLSM, en klinische nut CLE in vitro met behulp van pathogene bacteriën en ex vivo menselijke longweefsel te scherm potentiële sondes. Deze stap biedt vertrouwen bij het selecteren van veelbelovende verbindingen voort te zetten om te worden gecombineerd met klinisch CLE imaging; en geeft een indicatie of de geteste sonde onderhoudt doel specificiteit, toont af-target labelen, zoals binding rechtstreeks aan weefsel, of toont instabiliteit met host Proteolytische enzymen. Het zou ook relevant zijn voor elk van de gevechts sondes rechtstreeks toevoegen aan monsters van menselijke longweefsel plus bacteriën, de snelheid van de sonde bindende en activering in real-time volledig te karakteriseren.
Wij zijn van mening dat onze pijpleiding voor het snel screenen nieuwe bacteriën-specifieke sondes voor de beoordeling van hun potentieel voor imaging binnen de distale Long van patiënten in veel sneller vertaling naar de kliniek resulteren zal. Dit is grotendeels omdat de bacteriën-specifieke sonde kan lokaal worden afgeleverd binnen de longen via een katheter ingevoegd neer het kanaal van de werken van een bronchoscope, wat betekent dat microdose (< 100 µg) bedragen kunnen worden geleverd. Daarom, systemische leverings- en ook van de stof is niet een punt van zorg, zoals het geval is voor vele andere infectie doelen binnen het lichaam, of met nucleaire beeldvorming. Bovendien leveren de imaging sonde in zo'n een kleine dosis vermindert het risico van toxiciteit gerelateerde complicaties (hoewel toxiciteit screening voor vertaling nodig zijn zou). Na toediening van de sonde, de katheter kan vervolgens worden vervangen door de FCFM vezel en dezelfde regio van de Long ondervraagd door CLE, veel de zelfde manier wij hebben uitgevoerd binnen deze methode. Imaging moet snel na de installatie van de sonde voordat de sonde undetectable concentraties wegspoelt worden uitgevoerd.
Het is ook belangrijk op te merken dat screening van ziekte-identificerende sondes door deze techniek moet niet beperkt blijven tot bacteriële-imaging agenten, maar kan zich ook uitstrekken tot de validatie van sondes met alternatieve doelen, zoals ontsteking. Deze aanpak moet ook worden aangepast naar andere locaties van de ziekte in het lichaam waar imaging via FCFM toegestaan is.

Deze techniek beschrijft een snelle screening-proces voor de evaluatie van de bacteriën-specifieke optische beeldvorming agenten binnen ex vivo menselijke longweefsel door gebruik van FCFM voor de snelle identificatie van stoffen met mogelijke klinische nut voor het visualiseren van CLE bacteriën in de distale longkanker in situ.
Er is een dringende globale vereiste om rantsoen antimicrobiële voorschrijven in het tijdperk van stijgende antimicrobiële resistentie1. Te dien einde getracht de ontwikkeling van diagnostische methoden welke handeling voor de identificatie van bacteriële infectie met hoge specificiteit, gevoeligheid, en in real time zijn in hoge mate2. Huidige technieken ter bevestiging van een diagnose van longontsteking bij kritisch onwel patiënten, zoals die binnen de intensive care units (IC's), afhankelijk vaak van de interpretatie van de aspecifieke klinische en radiologische kenmerken naast bacteriecultuur technieken uit aanzuiging vloeistoffen/weefsels, die kan tot 3 dagen tot resultaten leidt. Bovendien bacteriecultuur aan de vloeistof die de distale Long ingeprent en opgehaald is gevoelig voor besmetting van meer proximale airways3 en vaak cultuur negatief is als gevolg van gelijktijdige antimicrobiële therapie of slechte bemonsteringstechnieken. Daarnaast zijn moleculaire technieken zoals polymerase-kettingreactie overdreven gevoelig wanneer gebruikt op aanzuiging vloeistoffen, riskeren overtreatment van patiënten. Een opkomende diagnostische aanpak is moleculaire optische beeldvorming, maken in situ moleculaire pathologie van weefsels een mogelijkheid; de ontwikkeling en validering van optische beeldvorming verbindingen is echter vereist. Toch directe visualisatie van bacteriën, via gevechts optische sondes is in potentie een zeer krachtige methode om de studie van de aanwezigheid en evolutie van longontsteking in de patiënt, en belangrijker, kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties in reactie op therapieën in real-time in situ.
CLE is een gevestigde investigative procedure in meerdere ziekten4, met inbegrip van binnen het gebied van gastro-enterologie5, oncologie6,7, en voor de raadpleging van de luchtwegen en alveolaire zakjes8, 9. het point-of-care structurele beeldvorming van zieke weefsel met behulp van een vezel imaging bundel, die op zijn beurt via het kanaal van de werken van een klinische endoscoop stelt en formulieren rechtstreeks contact met het oppervlak van het weefsel te worden beeld door confocale microscopie. Een beperking die blijft echter de noodzaak van generieke contrastmiddelen. Daarom kan het gebruik van ziekte specifieke sondes, zoals specifieke bacteriële agenten, enorm uitbreiden van het nut van deze modaliteit door direct visualiseren bacteriën op de site van vermoede infectie. Optische agenten bieden vele voordelen ten opzichte van andere technieken doordat real-time, hoge resolutie beeldvorming met diagnostische mogelijkheden. Bovendien is optische sondes bieden het vooruitzicht van multiplex voor de raadpleging van meerdere doelen, allemaal bereikt tegen een relatief lage prijs. Een aantal optische agenten zijn in ontwikkeling voor dergelijke doeleinden, maar geen nog met succes doorgevoerd binnen de kliniek10. Wij hebben een bibliotheek van klein molecuul chemische sondes gesynthetiseerd met specificiteit naar bacteriën en een snelle, effectieve pijpleiding voor evaluatie van de sonde functie voor het detecteren van bacteriële longontsteking in situ11ontwikkeld.
Ter identificatie van geschikte sonde kandidaten, moest de volgende vereisten worden voldaan vóór de ondervraging van de sonde op ex vivo menselijke longweefsel door FCFM: i) waterige oplosbaarheid, ii) specificiteit en selectiviteit voor het labelen van snel klinisch relevante bacteriën, iii) een hoge signaal-ruisverhouding, en iv) weerstand tegen afbraak binnen de omgeving van Long. De laatste werd beoordeeld door bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF) van patiënten met acute respiratory distress syndrome (ARDS), die is een aandoening die wordt gekenmerkt door Proteolytische en inflammatoire omgevingen in de longen in de ICU. Bovendien moest de sondes hebben een geschikte fluorophore voor detectie door een klinisch goedgekeurde optische CLE beeldapparaat binnen alveolaire menselijke longweefsel.
De pijpleiding naar het ondervragen van elk van deze voorwaarden was als volgt (in elke fase, alleen de sondes die doorgegeven werden overgedragen naar de volgende): (1) een bibliotheek van sondes worden onderzocht werd gesynthetiseerd; (2) elke sonde is toegevoegd aan een panel van levende bacteriën voor confocale laser scanning microscopie (CLSM) om ervoor te zorgen dat bacteriële etikettering; (3) selectiviteit van bacteriële labeling over zoogdiercellen in co culturen met primaire menselijke neutrofielen werd opgericht door CLSM; (4) stabiliteit en succesvolle labeling van bacteriën in aanwezigheid van de patiënt ARDS BALF werd bepaald door CLSM en Matrix bijgestaan Laser desorptie/ionisatie-tijd van de Spectrometrie van de massa van de vlucht (MALDI-TOF); (5) de optimale concentratie van kandidaten werd bepaald door CLSM, selectiviteit zorgen voor bacteriën over zoogdiercellen werd gehandhaafd; (6) kandidaten waren beeld door FCFM in suspensie en op ex vivo menselijke alveolaire longweefsel om stabiliteit en dat de signal-to-noise volstond voor detectie. Stap 6 is beschreven in detail binnen dit protocol. Methodologie voor stappen 1-5 al eerder gemeld11.

<table><tbody><tr><td>1-14 Microfuge</td><td>SciQuip</td><td>90616</td><td>Kleine tafelmicrocentrifuge</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>3370</td><td>Testplaat</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17783&nbsp;</td><td>Commerciële fluorescerende kleurstof</td></tr><tr><td>Cellvizio 488 nm Research CLE</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>LC-0001-488</td><td>Confocale laserendomicroscopie apparaat</td></tr><tr><td>Cletop-S</td><td>Cletop</td><td>14110601</td><td>Vezelreiniger</td></tr><tr><td>Eppendorf (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 mL microfugebuis</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11568663</td><td>Micropipetten</td></tr><tr><td>Falcon tube (50 mL)</td><td>Scientific Lab Supplies</td><td>352070</td><td>50 ml centrifugebuis</td></tr><tr><td>Gibco Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS - wasmedium</td></tr><tr><td>IC-Viewer</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>LW-0001</td><td>Software voor gegevensverzameling en -verwerking voor het CellVizio 488 nm onderzoekssysteem</td></tr><tr><td>Incu-Shake midi</td><td>Sciquip</td><td>SQ-4020</td><td>Op de grond staande schuddende incubator</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (Miller)</td><td>L3522</td><td>LB Groeimedia voor S. aureus</td></tr><tr><td>non-standard research AlveoFlex 488 nm</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>MP-0002-AF3</td><td>Fibred confocale fluorescentiemicroscopie vezel</td></tr><tr><td>Quanti Kit 488 nm</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>LQ-0005</td><td>Calibratieset voor het CellVizio 488 systeem</td></tr><tr><td>S. aureus ATCC 25923</td><td>ATCC</td><td>25923</td><td>Bacteriestammen gebruikt in dit onderzoek</td></tr><tr><td>Semi-micro spectrophotometry cuvette</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C5416-100EA</td><td>Voor spectrophotometrie&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>41102422</td><td>Tabeltop verwarmer met schudden</td></tr><tr><td>UV 1101 Biotech photometer</td><td>Biochrom WPA</td><td></td><td>Spectrofotometer</td></tr></tbody></table>

optische screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes op ex vivo menselijke longweefsel door confocale laser endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Verbetering van de snelheid en nauwkeurigheid van de detectie van bacteriële is belangrijk voor de patiënt stratificatie en om het juiste gebruik van antimicrobiële stoffen. Om dit te bereiken, de ontwikkeling van diagnostische technieken om te herkennen van de bacteriële aanwezigheid in real-time op de point-of-care is vereist. Optische beeldvorming voor directe identificatie van bacteriën binnen de host is een aantrekkelijke aanpak. Verschillende pogingen om chemische sonde ontwerp en validatie zijn onderzocht, echter geen zijn nog met succes vertaald in de kliniek. Hier beschrijven we een methode voor ex vivo validatie van bacteriën-specifieke sondes voor de identificatie van bacteriën in de distale Long, beeld door fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM). Ons model gebruikt ex vivo menselijke longweefsel en een klinisch goedgekeurde confocale laser endomicroscopy (CLE) platform scherm roman bacteriën-specifieke imaging verbindingen, nauw nabootsen imaging voorwaarden moeten worden geconfronteerd met patiënten. Daarom biedt screenen verbindingen door deze techniek vertrouwen van potentiële klinische werkwillig.

In deze studie hebben we een methode voor de snelle-screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes in een ex vivo menselijke alveolaire Long weefsel model van infectie met behulp van een klinisch goedgekeurde CLE stuurprogramma aangetoond.
CLE door FCFM is zeer geschikt voor het verkrijgen van structurele informatie binnen de distale Long, aangezien deze regio (als gevolg van een hoge overvloed van elastine en collageen) natuurlijk zeer fluorescerende is wanneer opgewekt met een 488 nm laser8. Omgekeerd, de alveolaire ruimte niet fluoresceren, en als zodanig kunt hoog contrast tussen weefsel structuur en het luchtruim worden gevisualiseerd (Figuur 1).
De toevoeging van ziekte gerelateerde sondes of contrastmiddelen, zoals bacteriën-specifieke sondes moeten inschakelen functionele informatie over ziekteprocessen in real time worden verkregen. Wij hebben eerder beschreven de synthese en eerste in vitro screening van een bibliotheek met bacteriën-specifieke sondes11; Waar bacterial-specificiteit, werd Proteolytische stabiliteit en het vasthouden van binnen het bacteriële membraan na verloop van tijd vastgesteld. Een veelbelovende bacteriën-specifieke sonde (UBI-10) werd geïdentificeerd binnen de studie, en ook dat bleek slechte retentie in de bacteriële cel membraan (UBI-3). Deze werden vergeleken met een controle van commerciële counterstaining (calceïne AM) die is gebruikt voor het label van S. aureus.
Onbevlekt, waren calceïne AM, UBI-3 en UBI-10 S. aureus met het label beeld in suspensie door FCFM met 100% 488 nm laser macht en een framesnelheid van 12 frames per seconde (Figuur 2). Waar labelloze bacteriën in PBS waren beeld, was geen fluorescent signaal aantoonbaar. Dit is in tegenstelling tot wanneer gelabelde bacteriën werden beeld. Waar bacteriële suspensies met UBI-3 of UBI-10 waren beeld door FCFM, was het duidelijk dat de fluorescentie van de algemene achtergrond van de oplossing werd verheven in vergelijking met PBS alleen besturingselementen, dit is omdat NBD (de sonde fluorophore) het uitstoten van een kleine hoeveelheid fluorescentie signaal in waterige oplossing, echter, bright dots punctate genoemd zijn duidelijk zichtbaar in de oplossing, zonder de noodzaak voor een wassen stap. Dit is te wijten aan een toename van de fluorescentie signaal in een polaire omgeving door de NDB uitgestoten d.w.z., het bacteriële membraan. Calceïne AM is niet een gevechts sonde, dus een wassen stap na de bacteriële kleuring hoefde te verwijderen van de hoge, fluorescerende achtergrond van niet-afhankelijke sonde in de oplossing. UBI-3 als UBI-10 werden gelabelde bacteriën, bacteriën aangeduid met calceïne AM ontdekt in oplossing door FCFM als heldere groene punctate stippen. Zoals de gegevens worden verzameld in video-formaat, lijken deze puntjes 'twinkle' als zij zich tussen de kernen en opgeven van focus, een karakteristiek kenmerk van imaging gelabelde bacteriën door deze methode verplaatsen.
De gelabelde bacteriën werden later toegevoegd aan kleine segmenten van ex vivo menselijke longweefsel en beeld weer door FCFM (Figuur 3). Waar alleen PBS of labelloze S. aureus is toegevoegd aan het longweefsel, is alleen de Long weefsel autofluorescent structuur aangetroffen (gezien als helder groene soorten collageen en elastine en donkere gebieden van de alveolaire ruimte). Geen punctate punten waren voor deze controlevoorwaarden ontdekt. Op dezelfde manier, alleen Long weefsel structuur (en geen punctate punten) werd gevisualiseerd voor de Long weefsel conditie met S. aureus plus UBI-3; die aangeeft dat deze sonde werd niet behouden blijft stabiel binnen de bacteriële cel membraan dat wil zeggen, het was weggespoeld en/of wordt gedegradeerd in aanwezigheid van inheemse Proteolytische enzymen in het longweefsel (zoals eerder bewezen11).
Bright dots punctate genoemd waren echter zichtbaar in zowel de calceïne AM positieve controlemonster S. aureus met het label, en met de meest veelbelovende bacteriën-specifieke sonde (UBI-10), S. aureus monster. De 'fonkelende' puntjes werden weergegeven ondanks de sterke weefsel autofluorescence (Figuur 3). Dus de resultaten verkregen door FCFM werden in overeenstemming met de in vitro pre-screening van het panel van bacteriën-specifieke sondes door CLSM, en aangetoond van een klinisch relevante detectiemethode voor imaging-infecties in real-time.
De hier gepresenteerde resultaten aantonen dat de Long een passende orgel systeem voor beeldvorming door FCFM als gevolg van haar kenmerkende autofluorescence is. De heldere kenmerkende structuren toestaan de CLE operator om te bepalen dat zij zich in de alveolaire ruimte. Deze regio's, in combinatie met de donkere alveolaire lucht zakjes vormen de perfecte achtergrond voor imaging fluorescently geëtiketteerde bacteriën met een hoog contrast.
Hoewel de opsporing van bacteriën binnen deze studie gepresenteerd wordt kwalitatief bepaald door het visualiseren van bright dots punctate genoemd, het mogelijk is te kwantificeren van het aantal punctate dots frame voor frame met behulp van een secundaire software om karakteriseren sonde bibliotheken.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig1.jpg"> Figuur 1: Statisch beeld van menselijke Long weefsel autofluorescence. Confocale laser endomicroscopy (CLE) afbeelding van ex vivo menselijke longweefsel met behulp van fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM), op 488 nm excitatie, 100% laser kracht en 12 frames/s. elastine en collageen zijn zeer TL (onwaar gekleurd groen), Overwegende dat de alveolaire ruimte is niet, en als zwarte gebieden weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Akram et al. 11 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig2.jpg"> Figuur 2: Confocale laser endomicroscopy (CLE) beeld van gelabelde S. aureus in suspensie. Fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM) werd gebruikt om het imago van vooraf gelabelde bacteriën, op 488 nm excitatie, 100% laser kracht en 12 frames/s. Labeled bacteriën Toon als zeer fluorescerende punctate stippen (valse gekleurde groen). Dit cijfer is gewijzigd van Akram et al. 11 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig3.jpg"> Figuur 3: Confocale laser endomicroscopy (CLE) afbeelding van ex vivo menselijke longweefsel met gelabelde S. aureus. Fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM) afbeelding ex vivo menselijke longweefsel gewend was en het label S. aureus, bij 488 nm excitatie, 100% laser kracht en 12 frames/s. Labeled bacteriën Toon als zeer fluorescerende punctate stippen (valse gekleurde groen) binnen het Long weefsel monster waarbij label met calceïne AM of UBI-10. De hoogste contrast wordt waargenomen waar bacteriën zijn beeld binnen de alveolaire ruimte. Dit cijfer is gewijzigd van Akram et al. 11 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Deze techniek beschrijft een efficiënte screeningsproces voor de evaluatie van de bacteriën-specifieke optische beeldvorming agenten binnen ex vivo menselijke longweefsel, door fibered confocal fluorescentie microscopie voor de snelle identificatie van klein molecuul chemische sonde-kandidaten met vertaalbare potentieel.

Optische Screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes op Ex Vivo menselijke longweefsel door Confocale Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Het algemene doel van deze optische beeldvormingstechniek is het bieden van een methode voor de snelle screening van nieuwe bacteriespecifieke optische probes die klinisch bruikbaar kunnen zijn voor het in beeld brengen van infecties in de menselijke long. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de moleculaire beeldvorming, zoals de vraag of nieuwe optische verbindingen specifiek zijn voor hun doelwit en of ze detecteerbaar zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze vertaalbaar is naar de kliniek.Het selecteren van veelbelovende imaging-probes met apparatuur die in de kliniek beschikbaar is, biedt de zekerheid dat de probes in die omgeving zullen werken. Verwijder vlak voor de beeldvorming het menselijke longweefselmonster op droogijs uit de vriezer. Laat het weefsel bij kamertemperatuur licht ontdooien, zodat het met een scalpel in secties van 1 bij 4 millimeter kan worden gesneden.Plaats met een pincet het gesneden menselijke longweefsel in de putjes van een 96-wells doorzichtige weefselkweekplaat met platte bodem. Breng ongebruikt menselijk longweefsel onmiddellijk terug naar de bewaarcontainer en plaats dit op droogijs voor transport terug naar de vriezer van -80 °C. Voeg vervolgens met een pipet 100 µL PBS toe aan elk longweefselmonster om het bloed uit het monster te wassen.Gebruik de pipetpunt om te controleren of al het weefsel bedekt is met de PBS en niet tegen de wanden van de well kleeft. Verwijder en gooi de PBS weg. Pipetteer vervolgens 100 µL niet-gekleurde Calcein AM-gelabelde of testprobe-gelabelde bacteriën in elke well die longweefsel bevat.Stel daarnaast controles op met longweefsel in 100 µL PBS. Maak eerst de connectorunit van de vezel voor confocale fluorescentiemicroscopie schoon met een vezelreiniger. Wrijf de connector in een voorwaartse beweging over het reinigingslint om stof en vuil te verwijderen.Verwijder de gele beschermkap aan de voorzijde van de laserscanunit. Bereid de LSU-hub voor door de zilveren hub voorzichtig tegen de klok in te draaien tot deze stopt. Plaats de FCFM-beeldvormingsvezelconnector met de opening naar boven.Houd de vezel op zijn plaats en draai de zilverkleurige hub met de klok mee tot deze twee keer klikt. Voltooi de verbinding door de zilverkleurige hub nog eens 45 graden met de klok mee te draaien. Volg vervolgens de instructies die verschijnen om de kalibratie van de FCFM-beeldgevingsvezel te voltooien.Voer eerst de FCFM-beeldgevingsvezeltest uit door op de knop voor het starten van de laser op het scherm te drukken. De laser zal centreren. Selecteer nieuwe vials uit de kalibratiekit en volg de instructies op het scherm.Plaats het distale uiteinde van de FCFM-beeldvezel in het gele vial en let op de toename van de fluorescentie op de monitor. Plaats vervolgens de vezelpunt in het rode vial zonder te roeren. Wacht tot de fluorescentie verdwijnt.Spoel tot slot de vezeltip af in het blauwe vials. Voer vervolgens de achtergrondacquisitie uit door de FCFM-beeldgevingsvezel in het blauwe vial te plaatsen. Druk op 'start laser' en daarna op 'calculate' zodra deze optie beschikbaar is.Voer tot slot de vezeldetectie uit door de FCFM-beeldgevingsvezel in het gele vial te plaatsen. Druk opnieuw op start laser en vervolgens op calculate. Reinig tijdens de automatische kalibratie het distale uiteinde van de FCFM-beeldgevingsvezel door deze, zoals aangegeven door de software, gedurende meer dan 10 seconden in het rode vial te plaatsen, gevolgd door ten minste vier seconden in het blauwe vial.Om de gegevensverzameling te starten, klikt u op start op het scherm of drukt u op het linker voetpedaal om de laser in te schakelen. Maak vervolgens beelden van elk van de bacteriële suspensie-monsters. Voer het distale uiteinde van de FCFM-beeldgevingsvezel in en beweeg de vezel langzaam door de suspensie om het monster te analyseren.Neem video's van elke gewenste lengte door het rechtervoetpedaal in te drukken of de record-bedieningselementen op het scherm te selecteren terwijl de vezel langzaam rond het monster beweegt. Reinig het distale uiteinde van de FCFM-beeldgevingsvezel tussen de monsters met 8% waterstofperoxide en lensreinigingsdoekjes. Om elk van de longweefselmonsters in beeld te brengen, steekt u het distale uiteinde van de FCFM-beeldgevingsvezel in het monster, waarbij u ervoor zorgt dat er direct contact is tussen het uiteinde van de vezel en het weefsel.Beweeg vervolgens voorzichtig het uiteinde van de beeldgevende vezel om het monster te onderzoeken. Door het uiteinde van de vezel van het weefsel weg te tillen, wordt het weefsel uit het brandpuntvlak verwijderd. Dit kan echter worden gebruikt om gelabelde bacteriën te beelden die niet aan het weefsel hechten.Neem video's van elke gewenste lengte door op het rechtervoetpedaal te drukken of door de ophet scherm getoonde opnamebediening te selecteren terwijl de vezel langzaam rond het monster beweegt. Reinig het distale uiteinde van de FCFM-beeldvezel tussen monsters door middel van lensreinigingsdoekjes en 8% waterstofperoxide. Om het systeem uit te schakelen, zet u de laser uit door op het linkervoetpedaal te drukken of door op de knop op het scherm te klikken.Koppel vervolgens de FCFM-beeldgevingsvezel los van het CLE-apparaat door de zilverkleurige LSU-hub tegen de klok in te draaien tot deze stopt. Verwijder daarna de FCFM-beeldgevingsvezel uit de LSU-hub door de vezelconnector voorzichtig uit de LSU te trekken. Plaats de beschermkappen terug op het proximale uiteinde van de FCFM-beeldgevingsvezel aan de voorzijde van de LSU-unit.Reinig en desinfecteer de FCFM-beeldgevingsvezel met 8% waterstofperoxide en lensreinigingsdoekjes. Plaats de vezel vervolgens voorzichtig in de opbergdoos. Open de software en importeer de bestanden voor analyse door via het 'ga naar'-icoon op het softwaredashboard de juiste map op de computer te selecteren.Dubbelklik op elk videobestand om deze te openen. De video's worden automatisch afgespeeld met de geoptimaliseerde kleurlookup-tabel en de kleurtabelaanpassing. Schakel de automatische intensiteitsdeling uit door op de knop met de toverstaf boven de intensiteitsschaalbalk te klikken.De functie is uitgeschakeld wanneer er geen zwarte schaduw rond de knop staat. Selecteer de gewenste intensiteitschaal door de minimum- en maximumbalken te verschuiven voor het beste contrast. Gebruik de histogramtool bij het selecteren van de intensiteitschaal om ervoor te zorgen dat het breedste dynamische bereik wordt vastgelegd.Zodra de gewenste schaling is bereikt, klikt u met de rechtermuisknop op de knop van het vervolgkeuzemenu die als standaardgroen is vermeld. Selecteer de optie om de opzoektabel op te slaan. Sla de opzoektabel op op een gewenste locatie.Pas voor elke andere video in de dataset dezelfde opzoektabel toe door met de rechtermuisknop op het standaard groene vervolgkeuzemenu te klikken en 'load lookup table' te selecteren. Selecteer het juiste bestand om een consistente intensiteitsschaal toe te passen op alle video's in de dataset. Exporteer de bewerkte video's door op de knop met de filmrol te klikken.Selecteer het gewenste videoformaat dat een MPG-bestand genereert. Druk vervolgens op exporteren en kies de bestandslocatie om het videobestand op te slaan. Gelabelde bacteriën zijn in de video zichtbaar als knipperende groene stippen.De structuur van het longweefsel zal zichtbaar zijn als geordende fluorescentiestrands, waarbij de alveolaire ruimte zwart verschijnt. Niet-gelabelde Staph aureus-bacteriën fluoresceren niet bij beeldvorming met FCFM, wat de noodzaak van optische beeldvormingsverbindingen aantoont. Staph aureus die succesvol zijn gelabeld door de fluorescerende verbindingen die worden gescreend, zijn zichtbaar bij beeldvorming met FCFM.De figuur toont succesvol gelabelde Staph aureus. Menselijk longweefsel vertoont autofluorescentie bij 488 nanometer. De video toont menselijk longweefsel dat is afgebeeld met FCFM.Niet-gelabelde Staph aureus werden aan het weefsel toegevoegd. Deze zijn niet zichtbaar. Echter, succesvol gelabelde bacteriën kunnen tegen een achtergrond van menselijk longweefsel worden waargenomen via FCFM-imaging als kleine, flikkerende punctate stipjes.Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in 10 minuten worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal monsters. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden de vezel grondig te reinigen bij het uitvoeren van kalibraties tijdens de installatie en tussen het imagen van monsters. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u het FCFM-apparaat instelt voor de beeldvorming van biologische monsters en hoe u de vastgelegde gegevens verwerkt.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals CFU-plating, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het bepalen van het aantal bacteriële cellen en de levensvatbaarheid na labelen. Vergeet niet dat het werken met menselijk weefsel en pathogene bacteriën gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

optical-screening-novel-bacteria-specific-probes-on-ex-vivo-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In veel biologische en klinische situaties is het voordelig om cellulaire processen te bestuderen als ze zich ontwikkelen in hun eigen micro-omgeving. Hier beschrijven we de montage en het gebruik van een low-cost fiber-optische microscoop, die real-time beeldvorming kan bieden in celkweek, dierproeven en klinische studies de patiënt.

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

De complete bouw van een aangepaste, real-time confocale scanning imaging-systeem is beschreven. Dit systeem, dat gemakkelijk kan worden gebruikt voor video-rate microscopie en microendoscopy, zorgt voor een scala aan imaging-geometrieën en toepassingen die niet toegankelijk zijn met behulp van standaard commerciële confocale systemen, tegen een fractie van de kosten.

Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Probe-based confocale laser endomicroscopy maakt real-time microscopie van de menselijke urinewegen tijdens cystoscopie, het verstrekken van dynamische, intravitale beeldvorming van pathologische toestanden, zoals blaaskanker met cellulaire resolutie. Endomicroscopy kan vergroten de diagnostische nauwkeurigheid van standaard wit licht endoscopie en zorgen voor intraoperatieve beeld leidraad voor chirurgische resectie te verbeteren.

Probe-based Confocale Laser Endomicroscopy van de urinewegen: De Techniek

Source: Mills, B., et al., Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates real-time imaging of fluorescently labeled Staphylococcus aureus in suspension and lung tissue using fibered confocal fluorescence microscopy.

Imaging Bacterial Localization and Host Interaction in Human Lung Tissue

Beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende het tumorcel-stroma interacties binnen longmetastasen, gebruik fluorescente reporters in muizen. Gebruik draaiende schijf confocale microscopie Deze techniek maakt visualisatie van levende cellen gedurende ten minste 4 uur en kan worden aangepast om andere inflammatoire longaandoeningen bestuderen.

Ex vivo Live-Imaging van Lung metastase en hun Microenvironment

De assemblage en het gebruik van een multimodaal microendoscoop wordt beschreven, die oppervlakkige weefseldatagegevens kan co-registreren met fysiologische weefselparameters, waaronder hemoglobineconcentratie, melanineconcentratie en zuurstofverzadiging. Deze techniek kan nuttig zijn voor het evalueren van weefselstructuur en perfusie, en kan worden geoptimaliseerd voor individuele behoeften van de onderzoeker.

Multimodale beeldvorming en spectroscopie Fiber-bundel microendoscopy Platform voor niet-invasieve,<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Analyse

We beschrijven de optische beeldvorming van muizen besmet met Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) met behulp van verslaggever enzym fluorescentie (REF). Dit protocol vergemakkelijkt de gevoelige en specifieke detectie van M. tuberculosis in pre-klinische diermodellen voor pathogenese, therapeutics en vaccin onderzoek.

Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Dit protocol is voor de onbevooroordeelde detectie van weefsel-geassocieerde bacteriën in patiënten biopsieën door 16s rRNA in situ hybridisatie en confocale microscopie.

Detectie van weefsel-Resident bacteriën in blaas biopsies door 16S rRNA fluorescentie in situ hybridisatie

We beschrijven de methode voor kwantitatieve analyse van de verdeling van Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groot) in de luchtwegen van muizen. De methode kan ook worden gebruikt voor de analyse van microdeeltjes en nanodeeltjes agglomeraat distributie in de luchtwegen in verschillende pathologische conditiemodellen.

Confocale laserscanning microscopie-gebaseerde kwantitatieve analyse van Aspergillus fumigatus Conidia distributie in whole-mount optisch gewiste muislong

We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.

Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

Leer optische screening van bacteriespecifieke sondes op ex vivo menselijk longweefsel met behulp van fibered confocal fluorescence microscopy. Deze methode identificeert kandidaat-probes voor klinische beeldvorming van infecties.

Optische Screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes op Ex Vivo menselijke longweefsel door Confocale Laser Endomicroscopy

Meer video's verkennen