Name: G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regios van het genoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer G2-seq om laat replicerende genoomregio's te identificeren met flowcytometrie en deep sequencing in gistcellen. Deze methode biedt inzicht in DNA-replicatiedynamiek en genomische stabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidie NIH GM117446 A.B.

1. bereiding van cellen voor stroom Cytometry sorteren
<ol><li>Inoculeer 15 mL reageerbuisjes met elk 8 mL YEPD Bouillon zodanig dat de culturen een dichtheid van 5 x 10,6 tot en met 1.5 x 107 cellen per mL na overnachting groei bereiken (zie discussie opmerking 1).</li>
	<li>Spin down gistcellen (1.400 x g, op kamertemperatuur of 4 ° C) in een centrifugebuis van 15 mL schroefdop voor 5 min, resuspendeer de cellen in 1,5 mL 70% ethanol, en overdracht aan een 1.6 mL microfuge buis, deze zitten voor 1 uur bij kamertemperatuur of ten minste 3 uur op ijs (verhuur kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij 4 ° C) (zie punt van discussie (2)).</li>
	<li>Spin down gistcellen in de microfuge (14.000 x g, 4 ° C) voor 1 min resuspendeer in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2, spin down (14.000 x g, 4 ° C) voor 1 min, gecombineerd supernatant, resuspendeer in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2 , met 0,25 mg/mL RNAse oplossing gedurende 1 uur bij 50 ° C, of 's nachts bij 37 ° C in de warmte blok of water bad.</li>
	<li>Voeg 50 µL proteïnase K oplossing (20 mg/mL geresuspendeerde in 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% gewicht aan volume glycerol) en incubeer gedurende 1 uur bij 50 ° C.</li>
	<li>Spin down cellen (14.000 x g, 4 ° C) resuspendeer de cellen in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2, spin down (14.000 x g, 4 ° C), gecombineerd met vacuüm supernatant, resuspendeer in 1 mL 1 µM groene nucleïnezuur stam geresuspendeerde in 50 mM Natriumcitraat , pH 7,2 en broeden in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, bewerk ultrasone trillingen ten 2 x voor 2 s elke (uitgangsvermogen 2 watt).</li>
</ol>2. de cel sorteren
<ol><li>Met behulp van een cel sorter, sorteren cellen volgens DNA inhoud in fasen G1, S, "vroege G2" en "late G2", het verzamelen van ten minste 1,6 miljoen haploïde cellen van elke fase van de celcyclus zoals in Figuur 1 (zie punt van discussie (3)).</li>
	<li>Cellen overbrengen microfuge buizen en spin down cellen gedurende 20 minuten bij 14.000 x g bij 4 ° C in de microfuge gecombineerd supernatant met vacuüm (de pellet kan worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C voor onbepaalde tijd; Zie discussie punt (4)).</li>
</ol>3. DNA-extractie en de voorbereiding van de Sequencing van bibliotheken
Opmerking: De volgende stappen zijn gebaseerd op "protocol I" in de gist Genomic DNA-extractie Kit (Zie Tabel van materialen).
<ol><li>Voeg 120 µL van "Spijsvertering Buffer," een eigen buffer waarmee de lytische enzym gist te verteren de celwand en 5 µL van gist lytische enzym, resuspendeer door vortexing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 40-60 minuten.</li>
	<li>Voeg 120 µL van "Lysis-buffermengsel," een eigen buffer die wasmiddel, en vortex hard voor 10-20 s bevat.</li>
	<li>Voeg toe 250 µL chloroform - Meng voor 1 min.</li>
	<li>Draaien op maximale snelheid in een microfuge gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Het laden van het supernatant op de DNA-bindende kolom en centrifuge op maximale snelheid in een microfuge voor 1 min.</li>
	<li>Voeg 300 µL van "DNA wassen Buffer," een eigen buffer dat ethanol en centrifuge voor 1 min op maximale snelheid in een microfuge bevat. Negeren van de stroom door, voeg 300 µL van DNA was Buffer, en herhaal het proces van wassen.</li>
	<li>De spin kolom overbrengen in een verse microfuge buis, voeg 60 µL van water (niet TE) - 1-3 min wachten en vervolgens Centrifugeer gedurende 10 s tot elueer de DNA.</li>
	<li>Meten van de concentratie door 5 µL van DNA toe te voegen aan 195 µL van dsDNA hoge gevoeligheid reagens dat al verdunde 1:200 in dsDNA hoge gevoeligheid buffer en vervolgens maatregel fluorescentie in een Fluorimeter, met 10 µL van meegeleverde normen voor kalibratie; tussen 10 en 50 ng van DNA totale opbrengst verwachten.</li>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten (piek Incident Power 450, plicht Factor 30%, cycli per barsten 200, behandeling tijd 60 s, waterniveau 6) te breken van DNA in 250-350 bp fragmenten.</li>
	<li>Bereiden van een bibliotheek met behulp van DNA monster voorbereiding kit en het volgnummer van het (minstens 10 miljoen 50 bp single-end leest) op het DNA sequencing instrument in de snelle modus (zienoot discussie (5)).</li>
</ol>4. analyse van het rangschikken van gegevens en generatie van replicatie profielen
<ol><li>Uitlijnen van sequenties aan Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genoom met behulp van Gsnap12 (zienoot discussie (6)).</li>
	<li>Vaststellen per-basenpaar Lees diepten met behulp van Bedtools' "genomeCoverageBed" software13.</li>
	<li>Verwijderen van artefactual spikes in Lees diepten, indien aanwezig (zienoot discussie (7)).</li>
	<li>Vloeiend lezen diepten door chromosoom medianen met een 20 kb glijden venster met "runMean"-functie in R pakket "caTools" (zienoot discussie (8)).</li>
	<li>Perceel Lees diepten in de S-fase, vroege G2 en laat G2 als een percentage van volledig gerepliceerde Lees diepten (zienoot discussie (9)).</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel deze techniek robuust is en relatief ongecompliceerd, bijzondere aandacht moet worden besteed aan het volgende:
(1) Wij raden dat culturen gedurende ten minste 12 uur groeien voordat ze log fase, bereiken aangezien de verschillen manifesteren in celcyclus distributies als culturen worden geoogst na het bereiken van de gewenste dichtheid slechts 4 h na inoculatie. Onze veronderstelling is dat een celcyclus distributie die een relatief stabiel evenwicht heeft bereikt beter een "echte" log...

Eukaryotische genoom replicatie wordt gestart op meerdere afzonderlijke locaties, oorsprong van replicatie, van welke replicatie vorken gaan in beide richtingen (herzien in Fragkos et al., 20151) genoemd. Oorsprong variëren in zowel hun timing en de efficiëntie van vuren, en verscheidene technieken zijn ontwikkeld om te controleren van de replicatie oorsprong activiteit en het ophelderen van de oorzaken van deze variatie. De activiteit van individuele oorsprong kan worden afgeleid uit de niveaus van single-stranded DNA2, welke vormen rond de oorsprong van het actief, of met behulp van 2D gelelektroforese volgen specifieke replicatie tussenproducten3, die beide kunnen worden opgespoord met radioactieve sondes. Beide technieken zijn gemakkelijker toegepast in S. cerevisiae dan bij zoogdiercellen omdat oorsprong beperkt tot specifieke bekende opeenvolgingen in de voormalige zijn. Met de komst van microarrays werd het mogelijk om te beoordelen van oorsprong afvuren wereldwijd. Eerst gebeurde dit door het labelen van DNA met zware isotopen, cellen van een blok van de G1 vrijgeven in medium met lichte isotopen en vervolgens toezicht op de vorming van zware-licht hybride DNA in het genoom4. De invoering van hoge-doorvoer sequencing toegestaan soortgelijke genoom-brede monitoring van oorsprong activiteit zonder de eis van dure isotopische labeling. Cellen werden gesorteerd in een stroom cytometer volgens DNA inhoud en hun DNA onderworpen aan diepe sequencing. Omdat de sequentie dekking opbrengst van 1 x tot 2 x in de loop van de S-fase, kan replicatie van de relatieve timing worden beoordeeld door vergelijking van Lees diepten van cellen in de S-fase aan die van de G1 of G25,6. Deze technieken, met name toegepast op gist, geleid tot een dieper begrip van hoe opeenvolging van DNA, chromatine structuur en DNA replicatie eiwitten oorsprong timing en efficiëntie reguleren.
Trouwe transmissie van genetische informatie tijdens cellulaire proliferatie vereist niet alleen succesvol inleiding van DNA-replicatie, die plaatsvindt op de oorsprong, maar ook de succesvolle voltooiing van de replicatie, die optreedt waar de replicatie vorken ontmoeten. Als inleiding van replicatie verschilt het tijdstip van voltooiing van de replicatie het genoom met bepaalde regio's resterende niet-gerepliceerde zelfs laat in de celcyclus. Dergelijke regio's mogelijk met name ver van actieve replicatie oorsprong of sequenties of chromatine structuren die de polymerase van DNA belemmeren kunnen bevatten. Laat het repliceren van regio's kan manifesteren zich als kwetsbare sites, die worden geassocieerd met een chromosomale breuk en een hogere mutatie, en zijn betrokken bij kanker en veroudering7,8,9. Ondanks het belang van goede voltooiing van DNA-replicatie voor handhaving van de stabiliteit van het genoom, heeft ons begrip van waar en hoe dit gebeurt echter bleef ver achter dat van replicatie inleiding. En terwijl afzonderlijke genen waarvan laat replicatie geassocieerd met de ziekte is zijn bestudeerd met, bijvoorbeeld, qPCR10, global studies gericht op het ophelderen van de locaties en de onderliggende oorzaken van een te late replicatie hebben ontbroken. Hier beschrijven we een techniek die we verwijzen naar het als "G2 seq" waarin we stroom cytometry combineren met hoge doorvoersnelheid sequencing licht te werpen op de voltooiing van de replicatie van het genoom in gist11. Met kleine wijzigingen, kan dit protocol worden aangepast aan alle cellen die stroom-gesorteerd op basis van DNA-inhoud worden kunnen.

<table><tbody><tr><td>YeaStar Genomic DNA kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro;M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>resuspend in 50 mM natriumcitraat, pH 7.2</td></tr><tr><td>50 mM natriumcitraat, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase oplossing (0,25 mg / mL)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0,25 mg / mL RNaseA gesuspendeerd in 50 mM natriumcitraat, pH 7.2, kook RNase oplossing voor de eerste keer 10 minuten en bewaar daarna bij -20&deg;</td></tr><tr><td>proteinase K oplossing (20 mg / mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III kolommen</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 instrument</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash;401&ndash;2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap uitlijnsoftware</td><td>open source software / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: een high throughput sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Vele technieken zijn ontwikkeld om de voortgang van DNA replicatie via de S-fase van de celcyclus. De meeste van deze technieken hebben gericht geweest op opheldering van de locatie en het tijdstip van de inleiding van het genoom dubbel in plaats van de voltooiing ervan. Het is echter van essentieel belang dat wij regio's van het genoom die laatste volledig repliceren begrijpen, omdat deze gebieden kampen met verhoogde niveaus van chromosomale breuk en mutatie, en ze geassocieerd met zowel ziekte en veroudering zijn. Hier beschrijven we hoe we een techniek die is gebruikt voor het controleren van replicatie inleiding om te identificeren die regio's van het genoom in plaats daarvan laatste volledige replicatie hebben uitgebreid. Deze aanpak is gebaseerd op een combinatie van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing. Hoewel dit verslag concentreert zich op de toepassing van deze techniek op gist, kan de aanpak worden gebruikt met alle cellen die kunnen worden gesorteerd in een stroom cytometer volgens DNA-inhoud.

We hebben de procedure die hierboven beschreven te identificeren laat replicerende sites in ontluikende gist gebruikt. Deze aanpak met behulp van een bekende laat replicerende regio op een kunstmatig chromosoom testen bleek de techniek nauwkeurig en betrouwbaar. Onze resultaten ook gebleken dat het biologische belang van tijdige afronding van replicatie door aan te tonen dat een late replicerende regio op chromosoom 7, die we geïdentificeerd als laat repliceren op basis van de resultaten ...

Beschrijven we een techniek voor het combineren van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing te identificeren laat replicerende regio's van het genoom.

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Het algemene doel van deze procedure voor diepe sequencing van DNA uit cellen die via flowsortering zijn gescheiden op basis van de cellcyclusfase, is het identificeren van regio's in het genoom die extreem laat in de celcyclus repliceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van DNA-replicatie, zoals welke regio's van het genoom problemen ervaren bij het voltooien van de DNA-replicatie en daarom bijzonder gevoelig zijn voor genomische herschikkingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, hoewel deze vanuit experimenteel oogpunt zeer eenvoudig is, deze een verrassend rijk inzicht biedt in de dynamiek van genomische replicatie.Begin met het inoculeren van testbuizen van 15 milliliter met acht milliliter YEPD met de gistcellen van belang. Synthetisch of rijk medium is acceptabel. Kweek de cellen gedurende de nacht gedurende ten minste 12 uur om ze te kunnen oogsten tijdens hun werkelijke log-fasedistributie.De volgende dag, wanneer de culturen een dichtheid van 5 tot 15 miljoen cellen per milliliter hebben, worden de cellen gecentrifugeerd en geresuspendeerd in 1,5 milliliters 70% ethanol. Draag de suspensie vervolgens over naar een microcentrifugebuis van 1,6 milliliter en laat de cellen een uur incuberen bij kamertemperatuur of ten minste drie uur op ijs. Na de inoculatie worden de cellen gecentrifugeerd en geresuspendeerd in één milliliter natriumcitraat.Sonicate de cellen tot slot kortstondig twee keer. Herhaal vervolgens de centrifugatiecyclus en resuspendeer de gist in één milliliter natriumcitraat met RNase. Laat de RNase reageren met de gist gedurende een uur bij 50 °C of overnacht bij 37 °C in een heatblock of een waterbad.Voeg na de RNase-behandeling 50 µL proteinase K-oplossing toe aan het mengsel en laat de reactie nog een uur voortduuren bij 50 °C. Centrifugeer vervolgens de cellen kort en resuspendeer ze in 1 mL natriumcitraat. Centrifugeer de cellen daarna en aspireer het supernatant met een vacuümpomp.Resuspendeer de cellen vervolgens bij zwak licht in één milliliter natriumcitraat met groene nucleïnezuurkleurstof. Incubeer de gist nu gedurende een uur in het donker bij kamertemperatuur. Tel vervolgens de cellen met een cel sorter aan de hand van emissiegegevens bij 530 nanometer.Sorteer ze op basis van hun DNA-gehalte in hun celcyclusfasen: G1 S, vroege G2 en late G2. Verzamel ten minste 1,6 miljoen haploïde cellen per fase. Centrifugeer de cellen direct na het sorteren gedurende 20 minuten. Aspireer het supernatant en vries de pellet in bij -20 °C voor opslag.We hebben vastgesteld dat de meest kritieke stap voor deze procedure simpelweg het onmiddellijk centrifugeren van de cellen is na het verzamelen, uiterlijk één uur na het sorteren. Deze extractie is gebaseerd op een extractiekit voor gistgenomisch DNA. Begin met het toevoegen van 120 µL digestiebuffer en vijf µL gistlytisch enzym.Meng de cellen vervolgens in het reactiemengsel met een vortex en incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 40 tot 60 minuten. Voeg daarna 120 µL lysisbuffer toe en vortex het mengsel op hoge snelheid gedurende 10 tot 20 seconden. Voeg vervolgens 250 µL chloroform toe en meng de inhoud van de buis gedurende één minuut grondig.Centrifuge de buis vervolgens twee minuten lang op maximale snelheid. Breng daarna het supernatant over naar de DNA-bindingskolom. Centrifugeer het supernatant door de kolom met een cyclus van één minuut op maximale snelheid.Om het DNA op het kolommembraan te wassen, plaatst u de kolom in een nieuwe opvangbuis en voegt u 300 microliters DNA-wasbuffer toe. Voer vervolgens de centrifugatie opnieuw uit op maximale snelheid gedurende één minuut. Herhaal deze wasstap nogmaals.Om het DNA te verzamelen, brengt u de spincolumn over naar een nieuwe buis. Voeg 60 µL water toe en wacht één tot drie minuten. Centrifugeer de column vervolgens op maximale snelheid gedurende 10 seconden om het water met het geëlueerde DNA te isoleren.Voeg nu tussen de 5 en 195 µL dubbelstrengs DNA high-sensitivity buffer toe, bevattend reagens in een concentratie van 1:200. Meet vervolgens de fluorescentie van het monster om de opbrengst te berekenen. Er wordt een opbrengst van tussen de 10 en 50 ng DNA verwacht.Gebruik nu sonicatie om het DNA op te breken in fragmenten van tussen de 250 en 350 basenparen. Gebruik vervolgens een standaard kit om een DNA-bibliotheek voor te bereiden en sequence deze met ten minste 10 miljoen single-end reads van 50 basenparen. De beschreven procedure werd gebruikt om laat replicerende sites in bakkersgist te identificeren.Normale cellen werden vergeleken met cellen waarin Sir2, een deacetylase-eiwit, ontbrak. De ruwe data bevatten grote pieken, voornamelijk veroorzaakt door de aanwezigheid van TY-elementen. Deze pieken werden verwijderd door de leesdieptes te begrenzen tot 2,5 keer de mediane leesdiepte per monster.De gegevens na het verwijderen van uitschieters werden vervolgens gladgestreken met een schuivend venster van 20 kb. Ten slotte werden de gegevens genormaliseerd en uitgezet als ratio's ten opzichte van de niveaus in G1. Een volledig niet-gerepliceerde cel zou verschijnen bij 0,5 en een volledig gerepliceerde cel bij één. In deze gegevens van chromosoom zeven was er bewijs voor een bekend laat replicerend gebied in de Sir2-mutant.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u die regio's van het genoom kunt identificeren die als laatste de DNA-replicatie voltooien en die daarom bijzonder kwetsbaar zijn voor DNA-breuken en andere problemen die geassocieerd worden met late replicatie.

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

gDNA-verrijking voor NGS-sequencing is een eenvoudig en krachtig hulpmiddel voor de studie van constitutionele mutaties. In dit artikel presenteren we de procedure om eenvoudig de volledige sequentie van 11 genen te analyseren die betrokken zijn bij DNA-schadeherstel.

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

We beschrijven hier een relatief snelle en eenvoudige benadering voor het in kaart brengen van genoom-breed replicatietiming bij zoogdieren, van celisolatie tot de basisanalyse van de sequentieresultaten. Een genomische kaart van een representatief replicatieprogramma zal worden verstrekt volgens het protocol.

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

Hier presenteren we een protocol om endogene RNA binding sites of "Footprints" van RNA: proteïne (RNP) complexen uit zoogdiercellen te verrijken. Deze aanpak omvat twee immunoprecipitaties van RNP-subeenheden en wordt daarom nagesynchroniseerde RNA-immunoprecipitatie in tandem (RIPiT).

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

Hier schetsen we de procedure voor het analyseren van replicatieprogressie door pathogene, structuurgevoelige herhalingen met behulp van 2-dimensionale gelelektroforese.

Elektroforetische analyse van replicatie door middel van structuurgevoelige DNA-herhalingen binnen het op SV40 gebaseerde menselijke episoom

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Leer G2-seq om laat replicerende genoomregio's te identificeren met flowcytometrie en deep sequencing in gistcellen. Deze methode biedt inzicht in DNA-replicatiedynamiek en genomische stabiliteit.

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Meer video's verkennen