G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Het algemene doel van deze procedure voor diepe sequencing van DNA uit cellen die via flowsortering zijn gescheiden op basis van de cellcyclusfase, is het identificeren van regio's in het genoom die extreem laat in de celcyclus repliceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van DNA-replicatie, zoals welke regio's van het genoom problemen ervaren bij het voltooien van de DNA-replicatie en daarom bijzonder gevoelig zijn voor genomische herschikkingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, hoewel deze vanuit experimenteel oogpunt zeer eenvoudig is, deze een verrassend rijk inzicht biedt in de dynamiek van genomische replicatie.

Begin met het inoculeren van testbuizen van 15 milliliter met acht milliliter YEPD met de gistcellen van belang. Synthetisch of rijk medium is acceptabel. Kweek de cellen gedurende de nacht gedurende ten minste 12 uur om ze te kunnen oogsten tijdens hun werkelijke log-fasedistributie.

De volgende dag, wanneer de culturen een dichtheid van 5 tot 15 miljoen cellen per milliliter hebben, worden de cellen gecentrifugeerd en geresuspendeerd in 1,5 milliliters 70% ethanol. Draag de suspensie vervolgens over naar een microcentrifugebuis van 1,6 milliliter en laat de cellen een uur incuberen bij kamertemperatuur of ten minste drie uur op ijs. Na de inoculatie worden de cellen gecentrifugeerd en geresuspendeerd in één milliliter natriumcitraat.

Sonicate de cellen tot slot kortstondig twee keer. Herhaal vervolgens de centrifugatiecyclus en resuspendeer de gist in één milliliter natriumcitraat met RNase. Laat de RNase reageren met de gist gedurende een uur bij 50 °C of overnacht bij 37 °C in een heatblock of een waterbad.

Voeg na de RNase-behandeling 50 µL proteinase K-oplossing toe aan het mengsel en laat de reactie nog een uur voortduuren bij 50 °C. Centrifugeer vervolgens de cellen kort en resuspendeer ze in 1 mL natriumcitraat. Centrifugeer de cellen daarna en aspireer het supernatant met een vacuümpomp.

Resuspendeer de cellen vervolgens bij zwak licht in één milliliter natriumcitraat met groene nucleïnezuurkleurstof. Incubeer de gist nu gedurende een uur in het donker bij kamertemperatuur. Tel vervolgens de cellen met een cel sorter aan de hand van emissiegegevens bij 530 nanometer.

Sorteer ze op basis van hun DNA-gehalte in hun celcyclusfasen: G1 S, vroege G2 en late G2. Verzamel ten minste 1,6 miljoen haploïde cellen per fase. Centrifugeer de cellen direct na het sorteren gedurende 20 minuten. Aspireer het supernatant en vries de pellet in bij -20 °C voor opslag.

We hebben vastgesteld dat de meest kritieke stap voor deze procedure simpelweg het onmiddellijk centrifugeren van de cellen is na het verzamelen, uiterlijk één uur na het sorteren. Deze extractie is gebaseerd op een extractiekit voor gistgenomisch DNA. Begin met het toevoegen van 120 µL digestiebuffer en vijf µL gistlytisch enzym.

Meng de cellen vervolgens in het reactiemengsel met een vortex en incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 40 tot 60 minuten. Voeg daarna 120 µL lysisbuffer toe en vortex het mengsel op hoge snelheid gedurende 10 tot 20 seconden. Voeg vervolgens 250 µL chloroform toe en meng de inhoud van de buis gedurende één minuut grondig.

Centrifuge de buis vervolgens twee minuten lang op maximale snelheid. Breng daarna het supernatant over naar de DNA-bindingskolom. Centrifugeer het supernatant door de kolom met een cyclus van één minuut op maximale snelheid.

Om het DNA op het kolommembraan te wassen, plaatst u de kolom in een nieuwe opvangbuis en voegt u 300 microliters DNA-wasbuffer toe. Voer vervolgens de centrifugatie opnieuw uit op maximale snelheid gedurende één minuut. Herhaal deze wasstap nogmaals.

Om het DNA te verzamelen, brengt u de spincolumn over naar een nieuwe buis. Voeg 60 µL water toe en wacht één tot drie minuten. Centrifugeer de column vervolgens op maximale snelheid gedurende 10 seconden om het water met het geëlueerde DNA te isoleren.

Voeg nu tussen de 5 en 195 µL dubbelstrengs DNA high-sensitivity buffer toe, bevattend reagens in een concentratie van 1:200. Meet vervolgens de fluorescentie van het monster om de opbrengst te berekenen. Er wordt een opbrengst van tussen de 10 en 50 ng DNA verwacht.

Gebruik nu sonicatie om het DNA op te breken in fragmenten van tussen de 250 en 350 basenparen. Gebruik vervolgens een standaard kit om een DNA-bibliotheek voor te bereiden en sequence deze met ten minste 10 miljoen single-end reads van 50 basenparen. De beschreven procedure werd gebruikt om laat replicerende sites in bakkersgist te identificeren.

Normale cellen werden vergeleken met cellen waarin Sir2, een deacetylase-eiwit, ontbrak. De ruwe data bevatten grote pieken, voornamelijk veroorzaakt door de aanwezigheid van TY-elementen. Deze pieken werden verwijderd door de leesdieptes te begrenzen tot 2,5 keer de mediane leesdiepte per monster.

De gegevens na het verwijderen van uitschieters werden vervolgens gladgestreken met een schuivend venster van 20 kb. Ten slotte werden de gegevens genormaliseerd en uitgezet als ratio's ten opzichte van de niveaus in G1. Een volledig niet-gerepliceerde cel zou verschijnen bij 0,5 en een volledig gerepliceerde cel bij één. In deze gegevens van chromosoom zeven was er bewijs voor een bekend laat replicerend gebied in de Sir2-mutant.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u die regio's van het genoom kunt identificeren die als laatste de DNA-replicatie voltooien en die daarom bijzonder kwetsbaar zijn voor DNA-breuken en andere problemen die geassocieerd worden met late replicatie.