G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Het algemene doel van deze procedure voor deep sequencing van DNA uit cellen die zijn gesorteerd volgens celcyclusfase is om regio's van het genoom te identificeren die extreem laat in de celcyclus repliceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van DNA-replicatie, zoals welke regio's van het genoom problemen hebben met het voltooien van DNA-replicatie en daarom bijzonder kwetsbaar zijn voor genoomherschikkingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, hoewel het vanuit experimenteel oogpunt heel eenvoudig is, het een verrassend rijk beeld geeft van de dynamiek van genomische replicatie.

Begin met het inoekuleren van 15 milliliter testbuisjes met acht milliliter YEPD met gistachtige cellen van belang. Synthetisch of rijk medium is acceptabel. Kweek de cellen een nacht gedurende ten minste 12 uur om ze te verzamelen tijdens hun echte log-faseverdeling.

De volgende dag wanneer de culturen een dichtheid hebben van vijf tot vijftien miljoen cellen per milliliter, centrifugeer de cellen en schud ze op in 1,5 milliliter 70% ethanol. Breng vervolgens de suspensie over naar een microcentrifugebuisje van 1,6 milliliter en laat de cellen een uur bij kamertemperatuur of minimaal drie uur op ijs incuberen. Na de inenting centrifugeer de cellen en schud ze op in één milliliter natriumcitraat.

Soniceer tenslotte de cellen kort twee keer. Herhaal vervolgens de centrifugatiecyclus en schud de gist op in één milliliter natriumcitraat met RNase. Laat de RNase een uur bij 50 graden Celsius of een nacht bij 37 graden Celsius in een hitteblok of waterbad met de gist reageren.

Na de RNase-behandeling voeg je 50 microliter proteïnase K-oplossing toe aan het mengsel en zet je de reactie door voor een uur bij 50 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de cellen en schud ze op in één milliliter natriumcitraat. Centrifugeer vervolgens de cellen en zuig het supernatant af met een vacuüm.

Schud de cellen vervolgens in schemerlicht op in één milliliter natriumcitraat met groen nucleïnezuurkleurmiddel. Incubeer de gist nu een uur in het donker bij kamertemperatuur. Tel vervolgens de cellen met behulp van een celsorteerder met behulp van 530 nanometer emissiegegevens.

Sorteer ze volgens hun DNA-gehalte in hun celcyclusfasen, G1 S, vroege G2 en late G2. Verzamel minimaal 1,6 miljoen haploïde cellen uit elke fase. Direct na het sorteren van de cellen, centrifugeer ze 20 minuten. Zuig het supernatant af en bevries het pellet op min 20 graden Celsius voor opslag.

We hebben gevonden dat de enige meest kritische stap voor deze procedure gewoon is om de cellen direct na het verzamelen snel te centrifugeren, maximaal een uur na het sorteren. Deze extractie is gebaseerd op een extractiekit voor gistachtig genoom-DNA. Begin met het toevoegen van 120 microliters verteringsbuffer en vijf microliters gistlytisch enzym.

Blend vervolgens de cellen in het reactiemengsel met behulp van een vortex en incubeer het mengsel gedurende 40 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 120 microliters lysisbuffer toe en vortex het mengsel gedurende 10 tot 20 seconden op hoge snelheid. Voeg vervolgens 250 microliters chloroform toe en meng de inhoud van de buis gedurende één minuut grondig.

Spin vervolgens de buis met maximale snelheid gedurende twee minuten. Breng vervolgens het supernatant over op de DNA-bindende kolom. Centrifugeer het supernatant door de kolom met behulp van een centrifugatiecyclus met maximale snelheid van één minuut.

Om het DNA op de kolommembranen te wassen, breng je de kolom over in een nieuwe opvangbuis en breng je 300 microliters DNA-wasbuffer aan. Herhaal vervolgens de centrifugatie bij maximale snelheid gedurende één minuut. Herhaal deze wasstap nog een keer.

Om het DNA te verzamelen, breng je de spinkolom over in een verse buis. Voeg 60 microliter water toe en wacht een tot drie minuten. Centrifugeer vervolgens de kolom gedurende 10 seconden met maximale snelheid om het water met het geëluteerde DNA te isoleren.

Voeg nu tussen vijf en 195 microliters dubbelstrengs DNA-buffer met hoge gevoeligheid toe, bevattende reagens in een verhouding van één tot 200. Meet vervolgens de fluorescentie van het monster om het rendement te berekenen. Verwacht tussen de 10 en 50 nanogram DNA te verzamelen.

Gebruik nu sonicatie om het DNA in fragmenten te breken die tussen de 250 en 350 basenparen zijn. Gebruik vervolgens een standaardkit om een DNA-bibliotheek voor te bereiden en sequence deze met minimaal 10 miljoen enkelstrengs reads van 50 basenparen. De beschreven procedure werd gebruikt om late replicatieplaatsen in knopgistachtige gisten te identificeren.

Normale cellen werden vergeleken met cellen zonder Sir2, een deacetylase-eiwit. De ruwe gegevens bevatten grote pieken, voornamelijk als gevolg van de aanwezigheid van TY-elementen. Deze pieken werden verwijderd door de leeftijdsdiepte tot 2,5 keer de mediane leeftijdsdiepte voor elk monster te beperken.

De ontdekte gegevens werden vervolgens gladgemaakt met een glijdend venster van 20 kb. Ten slotte werden de gegevens genormaliseerd en uitgezet als verhoudingen tot niveaus in G1. Een volledig niet-gereplicerende cel zou op 0,5 verschijnen en een volledig gerepliceerde cel zou op één verschijnen. In deze gegevens van chromosoom zeven was er bewijs van een bekende laat replicatiegebied in de Sir2-mutant.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u die regio's van het genoom kunt identificeren die als laatste DNA-replicatie voltooien en daarom bijzonder kwetsbaar zijn voor DNA-breuken en andere problemen die geassocieerd zijn met late replicatie.