Name: Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer intravitale microscopie van monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese in een muizenmodel van perifere arteriële ziekte. Deze methode maakt real-time visualisatie van vasculaire remodellering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de ELSE-Kröner-Stiftung en de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Duits Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, samenwerkend onderzoekscentrum). Speciale dank aan Hans-Holger Gärtner Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke Universiteit Magdeburg, Magdeburg, Duitsland, voor technische ondersteuning.

onze studie werd uitgevoerd met toestemming van de deelstaat Saksen-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, overeenkomstig punt 8 van de Duitse wet voor de bescherming van dieren. (§ 8, lid 1 van de Duitse wet voor de bescherming van de dieren van 18.05.2016 - BGBI. Ik S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV van 13.08.2013).
 Opmerking: voor de experimenten hier, 8 tot 12 week oud mannelijke BALB/c muizen werden gebruikt, en menselijke monocyten van bloeddonoren werden gebruikt voor de visualisatie van monocyten via intravital microscopie.
 1. voorbereiding van de cel Opmerking: voor de isolatie van monocyten, zie onze eerdere gepubliceerde video op JoVE voor instructies: &#34; isolatie en intraveneuze injectie van lymfkliertest beenmerg afgeleid Monocyten &#34; door Wagner et al. 4 Opmerking: wanneer werken met de cellen van alle stappen moet steriel om verontreiniging te voorkomen.
<ol><li>Cel kleuring met 3,3 &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat <ol><li>resuspendeer de cellen in serum gratis kweekmedium met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen/mL. 
		Opmerking: Alleen serum gratis medium maakt een efficiënte kleuring, aangezien de lipofiele kleurstof zou anders reeds worden vastgelegd door lipofiele componenten van het serum.</li>
		<li>Toevoegen 5 µL van 1 mM 3,3 &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat in dimethylformamide tot 1 mL van de celsuspensie en resuspendeer zorgvuldig.</li>
		<li>Incubate de cell oplossing bij 37 ° C gedurende 20 minuten</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 37 ° C en 5 min. 500 x g</li>
		<li>Het verjagen van het supernatant en resuspendeer de cellen met 37 ° C warme foetale kalf serum aangevuld medium.</li>
		<li>Twee keer herhaalt u de stappen 1.1.4 en 1.1.5.</li>
		<li>Rekenen de cellen met de formule: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg" /></li> <li>resuspendeer de cellen met 150 µL steriele 0.9% NaCl-oplossing.</li>
		<li>Injecteren van de cellen in de staart ader.</li>
	</ol></li></ol> 2. Verdoving <ol><li>Inademing verdoving <ol><li>verdampen Isofluraan met behulp van een vaporizer met behulp van een concentratie van 5% in een gesloten bak onder de motorkap van een chemisch veiligheidsrapport.</li>
		<li>De muis voorzichtig en zet het in de opslaglocatie.</li>
		<li>Het dier te behandelen door de huid van het achterste nek nadat het is gestopt met het verplaatsen.</li>
	</ol></li> <li>Intraperitoneaal verdoving Opmerking: gebruik Isofluraan anesthesie, beschreven onder stap 2.1, uit te voeren een intraperitoneale injectie. Met de snelle herstel en korte-acteren verdovend effect van de narcose Isofluraan is het makkelijker te hanteren van de muis en injecteren intraperitoneaal anesthesie.
	<ol><li>Gebruik van een oplossing van 2,4 mL Ketamine (10%), 0,8 mL Xylazine (2%) en 6.8 mL NaCl (0,9%) voor de intraperitoneale injectie.</li>
		<li>Wegen het dier alvorens verdoving. 
		Opmerking: De formule voor de verdoving is: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg" /></li> <li>gebruiken een insuline spuit van 1 mL met een 30 G naald te injecteren de oplossing in de linker onderbuik.</li>
		<li>Plaats van de muis in de kooi en verdovend effect wacht. 
		Opmerking: Het verdovend effect wordt doorgaans binnen 5 min als de injectie succesvol was. De juiste diepte van de narcose kan worden bepaald door het ontbreken van de deksel reflex of reactie op Teen snuifje, evenals een regelmatige, gecontroleerde snelheid van de ademhaling.</li>
	</ol></li></ol> 3. Implantatie van kelder membraan-achtige Matrix Opmerking: deze methode wordt gebruikt door onze fractie om te studeren tumor angiogenese na monocyt injectie. Afhankelijk van de experimenten, kunnen factoren die de groei worden toegevoegd aan de matrix kelder membraan-achtige. Wij uitgevoerd de femorale slagader afbinding vóór het injecteren van de tumor in de flank van de muis. De matrix moet een temperatuur van 4 ° C voor de injectie. De matrix is bij deze temperatuur, vocht; de gel verhardt tot een solide op lichaamstemperatuur (37 ° C). Voor betere zichtbaarheid van de subcutane matrix plug, scheren van de huid van de muis op de injectieplaats.
 Opmerking: optioneel: Voeg 100 ng fundamentele fibroblast groeifactor, 300 ng vasculaire endotheliale groeifactor en 26 I.E. heparine onder steriele omstandigheden naar de kelder membraan-achtige matrix.
<ol><li>1 mL van matrix in een 30 G insuline spuit en winkel op ijs laden tot gebruik.</li>
	<li>Leg het dier op de tafel en houd de huid van de muis naast de injectieplaats op de flank.</li>
	<li>500 µL van de kelder membraan-achtige matrix subcutaan injecteren. 
	Opmerking: Om praktische redenen is het nodig te injecteren de kelder membraan-achtige matrix compact op één locatie op de verspreiding van het subcutane voorkomen. Het zal gemakkelijker worden om de kunstmatige tumor van het weefsel na het offeren van de muis aan het einde van het experiment verjagen.</li>
</ol> 4. Staart veneuze injectie Opmerking: de praktijk van de staart veneuze injectie met NaCl oplossing op proefdieren voor experimenten. Als de monocyten kunnen niet voldoende worden geïnjecteerd in de ader van de staart, zal er geen systemische effect op de zekerheidsstelling. In dit protocol geïnjecteerd wij 2,5 miljoen monocyten. Probeer te injecteren van niet meer dan 5 µL/g lichaamsgewicht.
<ol><li>Gebruiken de monocyt oplossing bereid onder stap met 2,5 miljoen monocyten 1.1.8.</li>
	<li>Gebruiken een 30 G naald en een spuit van 1 mL insuline voor de injectie.</li>
	<li>Zorgvuldig omgaan met de muis, het beperken van het dier in de afdekking en zorg ervoor dat de muis niet wordt aangetast en heeft voldoende ruimte om te ademen.</li>
	<li>De afdekking zetten met de verwarming pad, zodat de staart kunt contact opnemen met de plaat.</li>
	<li>Identificeren de aderen van de staart, die zich aan de laterale kant van de staart bevinden.</li>
	<li>Zet de staart 90 °, zodat de staart ader wordt weergegeven aan de bovenkant van de staart.</li>
	<li>De kant van de injectie te desinfecteren vóór het injecteren van de monocyten.</li>
	<li>Proberen te injecteren de monocyt-oplossing in een platte hoek met de schuine kant van de naald geconfronteerd met omhoog 
	Opmerking: Stop de injectie als een blaar wordt weergegeven, zoals dit een teken van een mislukte injectie is. De procedure opnieuw proberen meer proximally.</li>
	<li>Stoppen met bloeden op de injectieplaats door zachte druk uit te oefenen op de staart voor ongeveer 60s.</li>
	<li>Observeren het dier gedurende 30 minuten om te controleren voor systemische bijwerkingen en plaats van de muis in de kooi, nadat het dier is volledig hersteld.</li>
</ol> 5. Microscopie van intravital <ol><li>voorbereiding <ol><li>plaats van de narcose muis op de verwarming pad (37 ° C) te houden een constante temperatuur en het vaststellen van de poten in plaats met plakband.</li>
		<li>Desinfecteren van de huid op de site van het been of de flank die wordt gebruikt voor microscopie.</li>
		<li>De regio van belang voor betere behandeling en om te voorkomen dat interferentie met haar scheren.</li>
		<li>Accijnzen de huid met een steriel scalpel en fijne pincet in een vierkante ruimte van 0,5 x 0,5 cm. 
		Opmerking: Het is belangrijk de regio van belang om vochtig te houden; anders, zal de kwaliteit van beelden en weefsel worden aangetast. NaCl oplossing kan worden gebruikt om het gebied bevochtigen.</li>
		<li>Plaats van de etappe tussen twee verstelbare stempels en de positie van een glas cover op de top van de stempels.</li>
		<li>Zorgen voor het weefsel NAT en in aanraking komt met het glas.</li>
		<li>Inject 50 µL rhodamine dextran retrobulbaire in het veneuze systeem voor betere zichtbaarheid van de vaartuigen.</li>
		<li>Start microscopie en pas de positie van het been desgewenst.</li>
	</ol></li> <li>Intravital microscopie instellingen <ol><li>inschakelen de Microscoop, computer, elektronische interfaces en lasers.</li>
		<li>Zet de verwarming eenheid van incubatie kamer en/of verwarming etappe (plaat/muismat), en de temperatuur ingesteld op 37 ° C.</li>
		<li>Start de acquisitie software. Als de Microscoop is uitgerust met een resonante scanner, selecteert u deze snel scanmodus.</li>
		<li>Wacht totdat de temperatuur een constant niveau (35-37 ° C bereikt) 
		Opmerking: Een stabiele temperatuur is belangrijk voor: (a) de muis, die onder verdoving kan geen controle over haar lichaamstemperatuur, en (b) te voorkomen of op zijn minst minimaliseren focal drift. Dit kan duren 1 uur tot enkele uren, afhankelijk van de omringende omstandigheden (bijvoorbeeld airconditioningsysteem en het aantal warmtebronnen in de kamer, met inbegrip van mensen). Als immersie doelstellingen worden gebruikt, is de contact zone tussen de lens en dekking glas (of weefsel) een typische bron van instabiliteit. Verwarming van de lens met een objectieve kachel kan helpen; u kunt ook een microscoop met een autofocussysteem is een aanrader.</li>
		<li>Selecteer een vergroting lens met een hoog cijfer diafragma dat voldoet aan de eisen van de resolutie van het experiment (zie opmerking aan het einde van dit gedeelte).</li>
		<li>Optimaliseer de instellingen van de microscoop met betrekking tot winst, montages van het kanaal, snelheid van de scan, pixelresolutie, diepte volume, stap-grootte en gemiddeld alvorens de proefdieren in het werkgebied.</li>
		<li>Scan bidirectionally om Acquisitietijd.</li>
		<li>Plaats van de narcose muis op de voorverwarmde Microscoop fase nadat de Microscoop heeft bereikt stabiele omstandigheden en de instellingen zijn getest met behulp van een dummy.</li>
		<li>Brengen de regio van belang binnen de kelder membraan-achtige matrix in beeld met behulp van fel licht verlichting en besteden de inspectie kort de haarvaten ultraviolet licht met voldoende filterinstellingen voor de toegepaste fluorophores.</li>
		<li>Overschakelen naar de scanmodus; start het scannen op lage resolutie 256 x 256 modus en verbeteren winst en laser van kracht totdat een signaal is waargenomen op de monitor.</li>
		<li>Focus op de structuur van belang. Zoom in totdat alle gegevens zichtbaar zijn.</li>
		<li>Definiëren &#34; start &#34; en &#34; einde &#34; posities in de axiale richting.</li>
		<li>Scannen stopzetten.</li>
		<li>Definiëren stap grootte (b.v., 0,5 µm) en aantal focal vliegtuigen (b.v. 10-20).</li>
		<li>Schakelaar naar de laatste pixelresolutie (512 x 512 of 1024 x 1024) afhankelijk van de snelheid van de bewegende subcellular structuren of cellen en selecteer de scan snelheid (scan/bClk frequentie) dat het beste aan de bewegingen past. Bidirectionele scannen wordt aanbevolen de verwerving van stapels vastmaken. 
		Opmerking: Selecteer de hoogste scansnelheid van het scannen die voldoende beeldkwaliteit geeft. Typische punt-scanners beschikken over snelheden tussen 400 Hz en 1.4 kHz. Resonant-scanners beschikken over een extra 8 of 12 kHz. Door het verminderen van het aantal lijnen in de y-richting, de scanfrequentie kan verder worden verhoogd (typische waarden zijn 512 x 512, 512 x 256 of 512 x 200 pixel voornemen). Afhankelijk van de signaal-ruisverhouding, kan men proberen de beeldkwaliteit verbeteren door toevoeging van regel gemiddeld tussen 2 en 4. Typisch, een instelling van 512 x 200 met geen gemiddeld resulteert in een overname/tijdsbestek van 18 ms in de bidirectionele modus met een resonante scanner van 8 KHz; met 512 x 200 en 4 x gemiddeld, het vertraagt tot 56 ms per frame.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/.">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/.</a> (2017).</li>
<li>Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pluripotent+stem+cells+for+vascular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Development of pluripotent stem cells for vascular therapy.</a> Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).</li>
<li>Henry, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VIVA+trial%3A+Vascular+endothelial+growth+factor+in+Ischemia+for+Vascular+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis.</a> Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).</li>
<li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+intravenous+injection+of+murine+bone+marrow+derived+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).</li>
<li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+monocytes%3A+a+novel+strategy+for+in+vivo+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth.</a> Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).</li>
<li>Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+but+not+collateral+growth+is+associated+with+ischemia+after+femoral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion.</a> The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).</li>
<li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetanus+toxoid-pulsed+monocyte+vaccination+for+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611(2014).</li>
<li>Matrigel Matrix. , 
 <a target="_blank" href="https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html">https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html</a> (2017).</li>
<li>Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+induces+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+angiogenic+activity+from+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.+1950%29%22%5BJournal%5D)">M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).</li>
<li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li>
<li>Woodman, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+knockout+mice+show+an+impaired+angiogenic+response+to+exogenous+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli.</a> The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).</li>
<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
<li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven methode werpt licht op de ontwikkeling van collateral slagaders, het gedrag van monocyten in deze vaartuigen, en het proces van arteriogenesis. De stappen voor de toepassing van dit protocol zijn gemakkelijk te leren en kan worden gebruikt op andere terreinen van de wetenschap. Ondanks deze voordelen zijn er sommige nadelen. Bijvoorbeeld, is microscopische apparatuur vereist voor het uitvoeren van de beschreven technieken. Verkrijgen van apparatuur voor een experiment is onhoudbaar, dus is het belangri...

Cardiovasculaire ziekten, zoals hart-en vaatziekten of perifere arteriële ziekte, zijn de meest voorkomende doodsoorzaken wereldwijd1. Celtherapie is een veelbelovende aanpak voor de behandeling van hart-en vaatziekten, met name voor mensen die niet kunnen ondergaan chirurgische ingrepen. Er zijn verschillende benaderingen cellen of hun secreted stoffen wilt gebruiken als een therapeutisch instrument2,3, met het einddoel voor verbetering van de perfusie en onderhouden van de functie van ischemische en underperfused weefsel. Een poging om dit doel te bereiken is het verbeteren van de arteriogenesis, die de ontwikkeling van collateral slagaders verbetert. Monocyten zijn een belangrijke celtype zekerheidsstelling is gekoppeld. Onze fractie heeft zich gericht op het onderzoeken van de effecten van monocyten in gebieden van ontsteking4,5, met name met behulp van het stuk ischemie model voor het opwekken van ischemie en latere ontsteking6. Monocyten thuis naar gebieden van ontsteking en complexe systemische reacties, die tot de ontwikkeling van zekerheidsstelling7 leidenveroorzaken.
Met het gebruik van intravital microscopie, kunnen we bestuderen het gedrag van deze cellen in vivo en observeren de homing van ingespoten monocyten naar gebieden van ontsteking. Meeste voormalige studies beschrijven alleen post-mortem analyse, die in het bezit van nadelen met inbegrip van een inleiding histologische artefacten en grote aantallen dieren vereist voor preparaten. Met onze aanpak, we kunnen onderzoeken immunologische processen en bijkomende vorming via live beeldvorming op meerdere tijdstippen.
Naast de ontwikkeling van collateral slagaders in ischemische gebieden invloed monocyten ook op tumorgroei. Om te onderzoeken van deze processen, we een matrix van de kelder membraan-achtige gewonnen uit de Engelbreth-Holm-Swarm muis Sarcoom, een tumor die rijk is aan de extracellulaire matrix eiwitten8, injecteren en analyseren met intravital microscopie. Deze matrix wordt gebruikt voor screentest moleculen voor endothelial celvorming netwerk of anti-kanker therapieën door inhibitie van de angiogenic; in dit geval zullen wij beoordelen de tumor angiogenic potentieel van monocyten voor cel therapie9,10,11.
Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een gemakkelijke en efficiënte manier om immunologische processen veroorzaakt door ischemie in een in vivo -model te bestuderen. We kunnen genereren een meer realistische testomgeving t.o.v. histologische workup van post-mortem spierweefsel.

<table><tbody><tr><td>10% fetal calf serum (FCS)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% penicillin/streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL Omnifix -F insulinesyringe</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml syringe&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Duitsland</td><td></td><td>Injectomat- spuit 50 ml met canule</td></tr><tr><td>6-well-ultra-low-attachement-plates</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive tape</td><td>TESA SE, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition Software</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Duitsland</td><td></td><td>29G, 30G</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture medium</td><td>Gefabriceerd door onze groep met enkele componenten</td><td></td><td>Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Duitsland</td><td></td><td>Allegra X-15R centrifuge</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet, Mannheim, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen Eugene, Oregon, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disinfection agent</td><td>Sch&uuml;lke&amp;Mayr GmbH, Norderstedt, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpel No.10&nbsp;</td><td>Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask</td><td>GVB, Herzogenrath, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Rubis, Stabio, Zwitserland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>Katalognummer: D-1819</td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>R&ouml;sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, Göttingen, Duitsland&nbsp;</td><td></td><td>Hot Plate 062</td></tr><tr><td>Human macrophage-colony stimulating factor</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Duitsland</td><td>SRP3110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Humane leucocyte filters</td><td>Blood preservation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (10%)</td><td>Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlijn, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leukocyte separation tubes (tubes with filter)&nbsp;</td><td>Bio one GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light microscope&nbsp;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Duitsland</td><td></td><td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>Lymphocyte separation medium LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Oostenrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium M199&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Oostenrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbiological work bench</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Duitsland</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stand with incubator and heating unit</td><td>&nbsp;Leica DMI 6000, Pecon, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monocyte wash buffer</td><td>Gefabriceerd door onze groep met enkele componenten</td><td></td><td>PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA</td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-photon microscope&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent</td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>Berlin Chemie AG, Berlijn, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber&nbsp;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Duitsland</td><td></td><td>ph 7,4 steriele</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Gefabriceerd door onze groep met enkele componenten</td><td></td><td>90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, &rho;= 1,064 g cm-3</td></tr><tr><td>Percoll solution</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Zweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td>10&micro;L/100&micro;L/200&micro;L/1000&micro;L</td></tr><tr><td>Pipettes serological</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td></td><td>&nbsp;Cellstar2ml, 5ml, 10ml</td></tr><tr><td>Pipetting heads</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol tube</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suction unit</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Duitsland</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes with cap</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td></td><td>15ml, 50ml Cellstar</td></tr><tr><td>Xylazine (2 %)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Duitsland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopie van monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest model van perifere arteriële ziekte

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Het therapeutisch doel voor perifere arteriële ziekte en ischemische hartziekten is te verhogen van de bloedtoevoer naar ischemische gebieden veroorzaakt door hemodynamische stenose. Vasculaire chirurgie is een haalbare optie in bepaalde gevallen, maar voor patiënten zonder indicaties voor chirurgie zoals progressie te rusten pijn, kritische ledemaat ischemie of belangrijke verstoringen te leven of te werken, zijn er weinig mogelijkheden voor het beperken van hun ziekte. Celtherapie via monocyt-verbeterd door het stimuleren van de vorming van de collaterale perfusie behoort tot een paar niet-invasieve opties.
Onze fractie onderzoekt arteriogenesis na monocyt transplantatie in muizen met behulp van het stuk ischemie model. Eerder, hebben we verbetering in stuk perfusie met behulp van tetanus-gestimuleerd syngeneic monocyt transplantatie aangetoond. Naast de effecten op de bijkomende vorming, kan tumorgroei worden beïnvloed door deze therapie ook. Om te onderzoeken van deze effecten, gebruiken we een muismodel kelder membraan-achtige matrix door het injecteren van de extracellulaire matrix van de Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoom in de flank van de muis, na occlusie van de femorale slagader.
Na de studie van kunstmatige tumor, gebruiken we intravital microscopie in vivo tumor-angiogenese en monocyt homing binnen collateral slagaders te studeren. Eerdere studies hebben het histopathologisch onderzoek van diermodellen, hetgeen inhoudt latere analyse post mortem artefacten dat beschreven. Onze aanpak visualiseert monocyt homing naar gebieden van zekerheidsstelling in real-time sequenties, is gemakkelijk uit te voeren, en onderzoekt het proces van arteriogenesis en tumor angiogenese in vivo.

Intravital microscopie voor de behandeling van tumor en collateral vaartuig groei veroorzaakt door monocyten kan helpen onthullen nieuwe aspecten in de moleculaire mechanismen van tumor angiogenese en arteriogenesis. De cellen moeten worden voorbereid en geïnjecteerd zorgvuldig met behulp van de stappen van het protocol. Verschillen kunnen leiden tot variaties tussen één experimenten. De monocyten moeten worden geïnjecteerd in het veneuze systeem (Figuur 1) t...

Monocyten zijn belangrijke bemiddelaars/mediators van arteriogenesis in het kader van perifere arteriële ziekte. Met behulp van een kelder membraan-achtige matrix en intravital microscopie, onderzoekt dit protocol monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese na monocyt injectie in de femorale slagader afbinding lymfkliertest model.

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Hallo, mijn naam is Christian Deffge. Ik ben arts in het academisch ziekenhuis in Magdeburg en ik werk in de cardiovasculaire onderzoeksgroep van Dr. Herold en Professor Braun-Dullaeus. Wij onderzoeken de augmentatie van collaterale groei.Daarom maken we gebruik van beeldvorming. In deze video willen we onze methoden toelichten. Resuspendeer de cellen in serumvrij kweekmedium met een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen per milliliter.Voeg vijf µL van 1 mM DIO en dimethylformamide toe aan één mL van de celsuspensie en resuspendeer voorzichtig. Incubeer de celoplossing gedurende 20 minuten bij 37 °C. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 500 g.Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in medium aangevuld met FCS, voorverwarmd tot 37 °C. Herhaal deze stap tweemaal. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-telkamer en lichtmicroscopie.Resuspendeer de cellen met een natriumchlorideoplossing. Injecteer de cellen in de staartvene. Matrigel-matrix is een gereconstitueerd basaalmembraanpreparaat geëxtraheerd uit het plaveiselcelcarcinoom.Het wordt gebruikt om testmoleculen te screenen op zowel de vorming van endotheelcelnetwerken als op anticancertherapieën via angiogene inhibitie. Beoordeel het tumor-angiogene potentieel van monocyten die we beogen te gebruiken voor celtherapie opnieuw. Voeg onder steriele omstandigheden 100 nanogram BFGF, 300 nanogram VEGFA en 26 internationale eenheden heparine toe aan de Matrigel.Vul na het vortexen van de oplossing een insulinespuit van één milliliter en bewaar deze op ijs tot gebruik. Voor een betere zichtbaarheid van de subcutane Matrigel-plaque dient de huid van de muis op de injectieplaats te worden geschoren. Hiervoor kan een scherp scalpel of ontharingscrème worden gebruikt.Leg het dier op de tafel en houd de huid van de muis vast naast de injectieplaats op de flank. Injecteer 500 microliters Matrigel subcutaan. Om praktische redenen is het noodzakelijk om de Matrigel compact op één locatie te injecteren om subcutane verspreiding te voorkomen.Het zal eenvoudiger zijn om de Matrigel-matrix uit het weefsel te verwijderen na het opofferen van de muis aan het einde van het experiment. Oefen de injectie van monocyten met een natriumchloride-oplossing voordat u met de experimenten begint. Als de monocyten niet systemisch kunnen worden toegediend, zal er geen systemisch effect optreden.In dit protocol hebben we 2,5 miljoen monocyten geïnjecteerd. Probeer niet meer dan vijf microliter per gram te injecteren. Zorg ervoor dat de muis gedurende de gehele procedure warm wordt gehouden met behulp van een warmtemat.Voor systemische toediening van de cellen heeft u een fixatiebeker en een insulinespuit van één milliliter, een naald van 30 g en de resuspenderde monocyten in natriumchloride-oplossing nodig. Behandel de muis voorzichtig en fixeer het dier in de fixatiebeker. Zorg ervoor dat de muis niet gewond raakt en voldoende ruimte heeft om te ademen.Plaats de fixatiehouder op het warmtekussen, zodat de staart de plaat kan raken. Zorg ervoor dat u de injectieplaats desinfecteert om een infectie te voorkomen. Lokaliseer de staartvenen, die zich aan de laterale zijde van de staart bevinden.Draai de staart 90 graden zodat de staartvene aan de bovenzijde van de staart zichtbaar is. Probeer de monocytenoplossing in een vlakke hoek te injecteren. Observeer het dier gedurende 30 minuten om te controleren op systemische bijwerkingen.Plaats de muis terug in de kooi zodra het dier volledig is hersteld. Plaats de geanestheseerde muis op de voorverwarmde microscooptafel nadat de microscoop een stabiele conditie heeft bereikt en de instellingen met een dummy zijn getest. Fixeer de poten met plakband.Desinfecteer de huid op de plek van het been of de flank die voor microscopie wordt gebruikt. Scheer het betreffende gebied voor een betere hanteerbaarheid en om interferentie door haar te voorkomen. Houd het betreffende gebied vochtig.Anders zal de kwaliteit van de beelden en het weefsel verslechteren. Plaats het pootje tussen twee verstelbare stempels. Positioneer een dekglas bovenop de stempels.Start de microscopie en pas indien nodig de positie van het pootje aan. De microscoopinstellingen zijn afhankelijk van de gebruikte software. Raadpleeg het protocol voor meer informatie.Onze gegevens tonen aan dat intravitale microscopie een krachtig instrument is voor de visualisatie van getransplanteerde monocyten binnen de bloedstroom in kleine diermodellen. De monocyten moeten in het veneuze systeem worden geïnjecteerd om systemische effecten te behouden en embolieën te voorkomen die kunnen optreden als de injectie in het arteriële systeem wordt uitgevoerd. Indien Matrigel wordt gebruikt, helpt langzaam injecteren om dispersie te voorkomen bij de explantatie van plaques voor verder histologisch onderzoek.Binnen de Matrigel-plak kunnen we de vascularisatie meten door haarvaten te tellen binnen verschillende experimentele opstellingen. De bevindingen van de intravitale microscopie kunnen worden geverifieerd door histologisch onderzoek. We kunnen de door intravitale microscopie gedetecteerde monocyten terugvinden in alle weefselcoupes.Als er veel tijd nodig is voor de acquisitie van beelden, neemt de hoeveelheid rhodamine-dextran in het vat af. Voor een betere zichtbaarheid van de vaten moet de applicatie van de rhodamine-dextran worden herhaald. Het gebruik van positieve probes voor cellen op Matrigel kan helpen om optimale instellingen te verkrijgen.Het doel van therapieën voor perifeer arterieel levyden of ischemische hartziekten is het verhogen van de bloedstroom naar andere geperfuseerde gebieden die zijn aangetast door hemodynamische stenose. Celtherapie via monocyt-versterkte perfusie door het stimuleren van collaterale vorming is een niet-invasieve optie voor patiënten zonder indicaties voor chirurgie. Naast de ontwikkeling van collaterale arteriën in ischemische gebieden kunnen monocyten ook de groei van tumoren beïnvloeden.Om deze processen te onderzoeken, maken we gebruik van Matrigel-injectie in combinatie met intravitale microscopie. Ons doel met dit protocol is om een eenvoudige en efficiënte manier aan te tonen om immunologische processen veroorzaakt door ischemie in een in vivo model te bestuderen. Met deze nieuwe methode zijn we in staat om een realistischer testmilieu te creëren in vergelijking met de histologische verwerking van postmortaal spierweefsel.

intravital-microscopy-monocyte-homing-tumor-related-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Door het gebruik van transgene reportermuizen en injecteerbare fluorescerende labels, maakt langdurige intravitale spinning disk confocale microscopie directe visualisatie mogelijk van het gedrag van myeloïde cellen in darmadnomen in het ApcMin/+ colorectaal kankermodel.

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc Min / + Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

Dit manuscript beschrijft het gebruik van transgene reporter muizen en andere beheerprogramma routes van fluorescente kleurstoffen in angiotensine II-geïnduceerde hypertensie met behulp van intravital videomicroscopie van bloedvaten te evalueren van de activering van immune cellen en hun mogelijkheid te rollen en zich houden aan het endotheel.

Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

We beschrijven twee methoden voor het beoordelen van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit geassocieerd met tumor micro omgeving van metastasen (tmem) deuropening functie en kankercel intravasatie met behulp van intraveneuze injectie van hoog-moleculair gewicht (155 kDa) dextran bij muizen. De methoden omvatten intravital beeldvorming in levende dieren en vaste weefsel analyse met behulp van immunofluorescentie.

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Het huidige protocol beschrijft een uniek, klinisch relevant model van perifere arteriële ziekte dat femorale slagader en aderelektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthaseremmer om hindlimb gangreen te induceren in FVB-muizen. Intracardiale DiI-perfusie wordt vervolgens gebruikt voor hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van de voetzool vasculatuur.

Driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de voetzool vasculatuur in een Murine Hindlimb Gangreen model

Leer intravitale microscopie van monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese in een muizenmodel van perifere arteriële ziekte. Deze methode maakt real-time visualisatie van vasculaire remodellering mogelijk.

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte (Video) | JoVE Journal

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte

Meer video's verkennen