Kwantificering van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van personen met chronische inflammatoire aandoeningen
October 17th, 2017
Beschrijven we een protocol voor het meten van transmigratie door monocyten over menselijke endothelial monolayers en hun daaropvolgende rijping in schuim cellen. Dit biedt een veelzijdige methode te beoordelen van de atherogene eigenschappen van monocyten geïsoleerd uit mensen met verschillende ziekten en te evalueren van factoren in het bloed die deze neiging kunnen versterken.
Het algemene doel van deze assay is om de capaciteit van monocyten uit menselijke klinische monsters om transendotheliale migratie en foamcelvorming te ondergaan te kwantificeren. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het cardiovasculaire veld te beantwoorden, zoals het atherogene potentieel van cellen van personen die risico lopen op acute coronaire hartziekte. Het grote voordeel van deze techniek is dat klinische monsters zowel van vers volbloed als van opgeslagen patiëntencohorten kunnen worden gemeten.
Bovendien kan foamcelvorming zowel door microscopie als door flowcytometrie worden gekwantificeerd. Bereid eerst de gepolymeriseerde collageengels van een verse collageensuspensie. Voeg in een vijf-milliliter polystyreen buis natriumhydroxide toe, vervolgens 10 keer M199, vervolgens azijnzuur en tot slot vezelachtig collageen.
Meng dit goed door middel van pipetten. Verdeel vervolgens 50 microliter in de interne putjes van een steriele platte bodem 96-well weefselcultuurplaat. Laad in de buitenranden van de putjes 200 microliter van een keer Dulbecco PBS om uitdroging te voorkomen.
Na twee uur incubatie bij 37 graden Celsius zal het collageen polymeriseren. Bedek vervolgens de gels met 150 microliter van een keer gesupplementeerd M199 en incubeer ze tot ze vijf dagen later kunnen worden gebruikt. Om opgeslagen humane umbilicaal veneuze endotheelcellen te expanderen, bereid een 25-vierkante-centimeter kweekfles met een milliliter fibronectine-oplossing voor en incubeer de schaal gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Ondertussen ontdooi de opgeslagen cellen in een waterbad om ze in M20 te hersuspenderen. Zodra de cellen zijn ontdooid, aspireer eventuele resterende fibronectine-oplossing uit de schaal en plateer de cellen. Kweek vervolgens tot confluentie door het medium na twee tot drie dagen te vervangen.
De HUVEC's zouden op de vijfde dag van het kweken confluent moeten zijn. Ontkoppel ze door het supernatant van de kweek uit de fles aan te zuigen en was vervolgens het serumbevattende medium weg met twee tot drie milliliter van een keer PBS. Voeg vervolgens vijf milliliter verdunde trypsine toe en incubeer de cellen kort op kamertemperatuur terwijl u de cellen voorzichtig schudt tot ze los lijken te zitten.
Verzamel ze vervolgens snel met vijf milliliter M20 en breng de suspensie over naar een 10-milliliter buis en centrifugeer de cellen. Hersuspendeer vervolgens de cellen in M20 bij 200.000 cellen per milliliter. Aspireer vervolgens de M199 van de voorbereide collageenplaat en voeg 100 microliter HUVEC's toe aan elke gel.
Vervolg de kweek gedurende drie dagen. Op de achtste dag van het kweken van de HUVEC's, activeer de monolayers voordat de monocyten worden toegevoegd. Na het aanzuiging van het overliggende medium, voeg 100 microliter menselijke TNF-alpha oplossing toe aan elke put.
Bekijk vervolgens de plaat gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie verwijdert u het medium en was de gels twee keer met 100 microliter M199 per wasbeurt. Voeg nu 50.000 vers geïsoleerde monocyten of gezuiverde monocytensubsets in 100 microliter M20 toe aan de HUVEC-monolayers.
Na het toevoegen van de monocyten, incubeer de plaat een uur om voorwaartse transmigratie van de cellen mogelijk te maken. Na een uur verzamelt u de niet-transmigreerde cellen in wasoplossing. Begin met het poolen van twee EGTA-washes met 100 microliter per putje.
Centrifugeer vervolgens de gecombineerde wasoplossingen bij 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en hersuspendeer de cellen in 30 microliter PBS en tel de cellen om het percentage voorwaarts getransmigreerde cellen te bepalen. Was vervolgens de plaatputjes eenmaal met M199 en voeg 100 microliter vers M20 toe aan de plaatputjes en incubeer de plaat gedurende twee dagen.
Na twee dagen herhaalt u de procedure voor het verzamelen van niet-transmigreerde cellen in EGTA-wasoplossing om omgekeerd getransmigreerde cellen te verzamelen en gaat u verder met fenotypische analyse van de cellen. Om de gel-gebonden cellen fenotypisch te karakteriseren door FACS-analyse, verteer de cellen door 100 microliter 37-graad-Celsius collagenase D toe te voegen en gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius te incuberen. Na de incubatie, macer de gels met behulp van een 200-microliter pipettip en incubeer ze gedurende nog eens 20 minuten om de gels volledig te verteren.
Eens volledig verteerd, filter en pool de verteerde replicaatgels door een 35-micron nylon gaas in een FACS-buis op ijs. Was vervolgens de gefilterde cellen eenmaal met koude FACS-wasoplossing. Centrifugeer de cellen en hersuspendeer ze in 100 microliter koude wasoplossing.
Voer vervolgens FACS-kleuring en -analyse uit volgens het tekstprotocol. Om de cellen door middel van microscopie te analyseren, kleurt u de cellen eerst zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de gekleurde cellen los te maken, omrandt u de putjes met een 21-gauge naald met de bevel naar buiten gericht.
Bereid vervolgens dia's voor om de gels te monteren. Boor twee kleine gaatjes in een strook dubbelzijdig plakband en bevestig vervolgens het plakband aan de dia en verwijder de beschermende coating. Voeg vervolgens een druppel water toe aan elk gaatje in het plakband.
Breng vervolgens met behulp van een pincet voorzichtig twee gels over op de twee gaatjes en bedek het plakband. Bevestig tenslotte voorzichtig een dekglas op het plakband en ga verder met visualisatie van de cellen. Na transmigratie werden niet-transmigreerde cellen geteld zoals beschreven.
In totaal werden 15.000 niet-transmigreerde cellen teruggewonnen en het percentage voorwaartse transmigratie werd bepaald op 95%Na 48 uur verdere incubatie werden 36.000 omgekeerd getransmigreerde cellen teruggewonnen, wat neerkwam op 12,6% omgekeerde transmigratie. Kleuring van de gels met olierode O onthulde foamcellen aangegeven door witte pijlen en macrofagen aangeg
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het meten van de transmigratie van monocyten door humane endotheliale monolagen en hun rijping tot foamcellen. Deze methode is waardevol voor het beoordelen van de atherogene eigenschappen van monocyten van individuen met verschillende ziektecondities.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculair onderzoek
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Monocyten spelen een cruciale rol bij atherosclerose.
- Inzicht in hun gedrag kan inzichten bieden in hart- en vaatziekten.
- Transendotheliale migratie is een sleutelproces in de functie van monocyten.
- De vorming van foamcellen is een belangrijke gebeurtenis in atherogenese.
Doel van het onderzoek
- Om de transendotheliale migratie van monocyten uit humane klinische monsters te kwantificeren.
- Om de vorming van foamcellen te evalueren als maatstaf voor atherogene potentie.
- Om de impact van verschillende factoren in het bloed op het gedrag van monocyten te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van gepolymeriseerde collageengels uit verse collageensuspensie.
- Transmigratie-assays met behulp van humane endotheliale monolagen.
- Kwantificering van foamcelvorming via microscopie.
- Flowcytometrie voor gedetailleerde analyse van cellulaire veranderingen.
Belangrijkste resultaten
- Demonstreerde de mogelijkheid om monocytentransmigratie effectief te meten.
- Toonde aan dat klinische monsters kunnen worden geanalyseerd uit zowel vers bloed als opgeslagen cohorten.
- Stelde een correlatie vast tussen monocytengedrag en atherogene risico's.
- Valideerde het gebruik van microscopie en flowcytometrie voor het kwantificeren van foamcellen.
Conclusies
- Dit protocol biedt een veelzijdige benadering voor het bestuderen van monocytengedrag in cardiovasculair onderzoek.
- Het kan helpen bij het identificeren van personen met een risico op acute coronaire hartziekte.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om therapeutische interventies te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This human in vitro model enables direct assessment of monocyte transmigration and foam cell formation from clinical samples, providing a disease-relevant system for evaluating atherogenic potential in comorbid conditions such as HIV and aging. By capturing key early atherogenic events in a human cellular context, the assay supports mechanistic de-risking in cardiovascular target validation and lead identification efforts. It bridges the gap between murine model limitations and human pathophysiology, offering predictive value for prioritizing therapeutic candidates targeting monocyte-driven inflammation in atherosclerosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying monocyte transmigration and foam cell formation as functional readouts of atherogenic potential in disease-relevant human cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets involved in monocyte-endothelial interactions using primary monocytes from defined clinical cohorts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating monocyte behavior with known atherogenic stimuli like oxidized LDL, enhancing confidence in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative outputs via microscopy or flow cytometry to assess monocyte migration and lipid-laden macrophage formation under controlled conditions.
- Operational Value: Establishes a reproducible platform for screening serum or plasma factors that modulate monocyte transmigration or foam cell maturation.
- Scalability: Compatible with 96-well format and cryopreserved samples, enabling batch processing of clinical cohorts for biomarker discovery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant human monocytes from individuals with chronic inflammatory conditions (e.g., HIV, aging) to model human-specific atherogenic mechanisms not fully recapitulated in mice.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase monocyte behavior to preclinical validation by measuring responses to pro-atherogenic ligands like oxidized LDL.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables evaluation of how comorbid diseases alter monocyte phenotype, informing patient stratification strategies in therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional immune cell assays that inform early cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on monocyte activation states and endothelial crosstalk in atherosclerosis pathogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized readouts for evaluating compound effects on monocyte transmigration and foam cell formation.
- Analytics: Generates quantitative metrics (e.g., % transmigration, mean fluorescence intensity) enabling comparison across experimental conditions and donor groups.
- Translational Research: Uses primary human monocytes to enhance clinical relevance of mechanistic findings before preclinical investment.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various stimuli (e.g., cytokines, lipids, serum) and readouts across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by measuring functional monocyte behavior in a human disease-relevant system.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through defined steps for collagen gel preparation, endothelial monolayer formation, and cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying targets that modulate monocyte-driven atherogenic processes early in discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on effects in human monocyte assays from clinically relevant cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, endothelial cell culture, and sterile technique for handling clinical blood samples.
- Dependent on consistent sourcing of fibrinolytic collagen, endothelial cells (HUVECs), and endotoxin-free reagents for reproducible gel polymerization.
- Necessitates standardized protocols for monocyte isolation (e.g., PBMC purification) and activation status assessment across donor cohorts.
- Requires access to flow cytometry or fluorescence microscopy platforms for endpoint quantification of transmigrated and foam cells.
- Limited by donor variability and sample availability; necessitates adequate cohort sizing for statistical power in comparative studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Culturing HUVEC Monolayer on Collagen Gels
3:38
Activation of HUVEC Monolayer and Isolation/Activation of Monocytes for Transmigration
5:44
Quantification of Foam Cells and Macrophages by Microscopy or Flow Cytometry
7:42
Results: Characterizing the Transmigrating Mice
9:09
Conclusion
