Name: Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer de biochemische en structurele karakterisatie van koolhydraatbindend proteïne SP0092 uit Streptococcus pneumoniae. Deze methode optimaliseert kristallisatieomstandigheden en structurele analyse voor therapeutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen OPPF-UK voor hulp bij het klonen, Gemma Harris voor SEC-WINKELCENTRA en de wetenschappers van de straallijnen I03 en I04 bij Diamond lichtbron.

Opmerking: de codering volgorde waarvoor de signaal-peptide is verwijderd wordt gekloond in de vector van de pOPINF na een standaardprotocol in-fusion; de inheemse proteïne wordt uitgedrukt als een fusie van de His-tag in Escherichia coli BL21 Rosetta cellen 28 , 29. de selenomethionine label variant wordt uitgedrukt standaardmethoden volgens de fabrikant 30 na. De recombinant SBP wordt gezuiverd zoals eerder beschreven 31 , 32.
 1. Biochemische karakterisering <ol><li>thermische Verschuif assay <ol><li>bereiden 48 bufferoplossingen met een pH variërend van 4.0 naar 9.5 en concentratie van NaCl van 0 tot 0.5 M, en afzien van 40 µL in een 96-wells-plaat, zoals beschreven in Tabel 1 33.</li> <li>toevoegen aan elke goed 5 µL van de SBP-oplossing bij concentratie 1-2 mg/mL.</li>
		<li>Toevoegen aan elke goed 5 µL van 20 x TL vlek voor eiwitten (Zie Tabel of Materials).</li>
		<li>Spin voor 2 min bij 112 x g bij kamertemperatuur, Vermeng de oplossingen door pipetteren en afdichting van de plaat met behulp van een transparante kleeffilm.</li>
		<li>Draaien van het experiment op een real time machine: instellen van de helling van een temperatuur van 3 ° C/min van 4 tot 99 ° C met een 10 s wacht tijd en lees de fluorescentie elke 0,5 ° C met excitatie op 483 nm en emissie bij 568 nm.</li>
		<li>Analyseren de fluorescentie emissie curven voor elke aandoening van de buffer, de smelttemperatuur (T m) identificeren als het minimum van de afgeleide. 
		Opmerking: Deze procedure geeft een goede indicatie van de beste bufferoplossing om te helpen bij de verbetering van eiwitstabiliteit. Kies de pH bereik en zoute concentratie op basis van de voorwaarde van de buffer met het hoogste T m en toevoegen van 2,5% (v/v) van glycerol en 0,5 mM voor tris(2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP) om te bepalen van de bufferoplossing voor de volgende stappen (SEC-buffer).</li>
	</ol></li> <li>MALS en analytische SEC <ol><li>uitvoeren van een twee-kolom volume wassen van de voorverpakte gel filtratie kolom met ontgaste gefilterd water (gebruik een breed scala moleculair gewicht 24 mL-kolom).</li>
		<li>De kolom verbinden met de verstrooiing van licht detector en de kolom met de vastberaden SEC-buffer van de bepaling van de thermische shift equilibreer.</li>
		<li>Injecteren 100 µL van gezuiverde SBP op in het volume van het equilibrated SEC kolom en stroom de kolomwaarde voor SEC-buffer 5 mg/mL.</li>
		<li>Controleren het chromatogram elutie voor één of meerdere pieken en de verstrooiing gegevens met behulp van de software van de analyse, verkrijgen de molaire massa en de polydispersiteit index voor alle soorten onderzoeken. 
		Opmerking: Voor elke piek overeenkomt met een oligomere soorten, is het nuttig om het controleren van de polydispersiteit index berekend als molaire massa gewogen op massa/molar massa gewogen op aantal moleculen (Mw/Mn). Polydispersiteit waarde dicht bij 1 geeft aan een piek monodispersed. 
		Opmerking: Zodra de oligomerisatie van alle soorten zijn gedefinieerd, is het nuttig zijn te onderzoeken hun afhankelijkheid van de eiwitconcentratie, zoals hogere concentraties kunnen het voordeel van grotere oligomeren vorming.</li>
		<li>Uitvoeren van meerdere analytische SEC loopt; injecteren 100 µL van gezuiverde SBP op toenemende concentraties (0.1 - 10 mg/mL) in de kolom filtratie geëquilibreerd gel (gebruik een breed scala moleculair gewicht 5 mL kolom) en stromen van één kolom volume van de SEC-buffer telkens.</li>
		<li>Het chromatogram elutie voor één of meerdere pieken controleren en analyseren de intensiteiten van de extinctie op 280 nm van de curven die overeenkomt met verschillende startende eiwit concentraties. Als de relatieve intensiteiten van de verschillende toppen constant blijven, dan ontbreekt geen Inter conversie tussen de oligomere soorten niet. Variatie in de relatieve intensiteiten in verschillende concentraties is een indicatie van de interconversion tussen verschillende oligomere soorten die afhankelijk is van de eiwitconcentratie. 
		Opmerking: Deze karakterisering stap is van fundamenteel belang om te bepalen welke soorten zijn meer geschikt voor kristallisatie. Inderdaad, de verschillende monodispersed soorten zijn meer vatbaar voor kristalliseren als ze in een gestage oligomere staat bij een bepaalde concentratie zijn.</li>
	</ol></li></ol> 2. Eiwit voorbereiding en kristallisatie <ol><li>voorbereidende SEC <ol><li>na een één kolom volume wassen met ontgaste gefilterd water, equilibreer met SEC-buffer de voorbereidende voorverpakte gel filtratie kolom (allerlei moleculaire gewicht 120 mL kolom).</li>
		<li>1-5 mL van gezuiverde SBP bij 5-50 mg/mL te injecteren in de gel geëquilibreerd filtratie kolom en stroom één kolom volume van de SEC-buffer.</li>
		<li>Verzamelen de kolom doorstroming in fracties van 1 mL.</li>
		<li>Bundelen de breuken die overeenkomt met een enkele monodispers piek; spin van het monster in 15 mL centrifugeren filters bij 1.500 g en kwantificeren van de concentratie, totdat de gewenste concentratie wordt bereikt (meestal 50-100 mg/mL voor SP0092).</li>
	</ol></li> <li>Kristallisatie <ol><li>bepalen het bereik van de optimale concentratie voor de kristallisatie experiment met de pre kristallisatie Test zoals beschreven door de fabrikant: <ol><li>Doseer 0,5 - 1,0 mL van elk van de vier kristallisatie-test oplossingen in een ander reservoir van een vergadering 24-well drop kristallisatie plaat.</li>
			<li>Bereid de kristallisatie druppels door het mengen van 1 µL van eiwit-oplossing met 1 µL van reservoir oplossing, afdichting van de plaat en Incubeer bij kamertemperatuur voor maar liefst 1 h (betrouwbaardere resultaten worden verkregen na een incubatieperiode van overnachting).</li>
			<li>Controle van de kwaliteit van de daling voor elke concentratie met behulp van een 10 x vergroting Microscoop. 
			Opmerking: Test ten minste drie verschillende eiwitconcentratie: (I) het merendeel van de druppels resterende duidelijk aangeven dat het eiwit ook verdund voor kristallisatie is; (II) de aanwezigheid van zware neerslag in het merendeel van de druppels impliceert een te hoge concentratie; en (III) een evenwichtige vóórkomen van zowel duidelijk druppels en neerslag (beter als lichte) is een goede indicatie dat de geteste concentratie gunstig voor de kristallisatie is.</li>
		</ol></li> <li>Bereiden de daling van de 96-Wells vergadering kristallisatie platen; afzien van 100 µL van verschillende commerciële kristallisatie oplossing in elk reservoir goed 34 , 35, , 36 , 37.</li> <li>afzien 100 nL van eiwitSteekproef bij de eerder gedefinieerde concentratie (stap 1.1.6) in alle de kristallisatie drop putjes met behulp van een robot systeem van kristallisatie.</li>
		<li>100 afzien nL van het reservoir van verschillende oplossingen voor het corresponderende kristallisatie drop putten te mengen met eiwitten afgeleverd in stap 2.2.3. Zegel van de kristallisatie plaat om te voorkomen van verdamping en inschakelen van de evenwichtsinstelling van de daling van de kristallisatie met het reservoir.</li>
		<li>Check de druppels periodiek (aanvankelijk elke 1-2 dagen, later elke week) (ten minste) met behulp van een 10 x vergroting Microscoop kristal vorming en groei te evalueren. 
		Opmerking: Een geautomatiseerd imaging systeem voor eiwit kristallisatie kan worden gebruikt voor drops visualisatie en vastleggen.</li>
	</ol></li></ol> 3. Crystal karakterisering en verzamelen van de gegevens van de X-ray <ol><li>Crystal montage <ol><li>bereid de cryoprotectant-oplossing door het toevoegen van 25% (v/v) glycerol (eindconcentratie) aan de voorwaarde van de kristallisatie (dus ter vervanging van 25% van het water in de eerste mengsel) 38.</li>
		<li>Vul een schuim dewar met vloeibare stikstof en plaats het monster behuizing deel van een uni-puck in de dewar. Laat het afkoelen tot temperatuur van vloeibare stikstof.</li>
		<li>Knippen en verwijderen de afdichting van de plaat kristallisatie tape over de daling waar de kristallen worden gevormd.</li>
		<li>Breng een druppel van 1 µL van cryoprotectant oplossing op een coverslide geplaatst in de nabijheid van de daling van de target.</li>
		<li>Overbrengen van het geselecteerde kristal uit de oorspronkelijke drop naar de daling van de cryoprotectant oplossing met behulp van een nylon cryo-lus op een rug standaardgrondslag gemonteerd op een magnetische wand 39 , 40.</li>
		<li>Snel overbrengen in het kristal vanuit naar de waterdruppel cryoprotectant vloeibare stikstof, het plaatsen van de lus in de eerste lege positie van de monsterhouder uni-puck.</li>
		<li>(Uit de afdichtende tape gesneden stap) herhalen totdat alle de gewenste kristallen worden geoogst en in de uni-puck monsterhouder opgeslagen.</li>
		<li>Plaats de uni-puck baseren op de uni-puck met behulp van de toverstaf puck en neem de puck naar de beamline (in vloeibare stikstof omstandigheden). 
		Let op: Extreem lage temperatuur!</li>
		<li>Gebruiken de cryo-Tangen en de puck dewar laden hulpmiddel voor het laden van de uni-puck(s) tot de beamline monster wisselaar robot dewar. De monsterhouder uni-puck zal losmaken van de base deksel rechtop in de robot monster verlaten van de houders van de lus monster dewar dus blootgesteld aan de vloeibare stikstof en toegankelijk naar de robot monster wisselaar.</li>
	</ol></li> <li>Crystal karakterisering Opmerking: de geoogste kristallen kunnen vervolgens worden gescreend voor diffractie kwaliteit met behulp van ofwel een laboratorium X-ray source of bronbelasting een X-ray synchrotronstraling (SR). Macromoleculaire kristallografie (MX) straallijnen bieden een afstembare energiebron misbruik wil maken van abnormale diffractie voor structuur oplossing. In de volgende sectie, een reeks werkvoorschriften in overeenstemming met de experimentele mogelijkheden van Diamond licht bron MX straallijnen is voorgesteld, maar deze richtsnoeren kunnen ook worden aangepast aan de MX straallijnen op andere synchrotrons wereldwijd.
	<ol><li>Als een eerste stap, is het nuttig om te bevestigen of identificeren van afwijkende scatterers in het kristal. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door het meten van een spectrum van X-ray fluorescentie van het kristal. Eerst Stel de X-ray-energie van de beamline is hoog genoeg om alle elementen die doorgaans verwacht voor macromoleculaire kristallen prikkelen (14 keV of hoger).</li>
		<li>Gebruik van de software van de controle van de beamline om te selecteren het monster te worden gemonteerd door de robot monster wisselaar; de lus automatisch wordt gecentreerd in de X-ray-balk en de centrering van de kristallen kan worden bevestigd handmatig met behulp van de software van de controle van de beamline.</li>
		<li>Opnemen een X-ray fluorescentie spectrum met behulp van de software van de controle van de beamline: de gebruiker selecteert een belichtingstijd en initieert de meting (fluorescentie/fluorescentie Spectrum instelling, &#8594; uitvoeren, figuur 2A). De software van de controle van de beamline plaatst automatisch de X-ray fluorescentiedetector in plaats en bepaalt de minimale incident X-ray flux te verkrijgen van een leesbaar signaal op de fluorescentiedetector. De verworven spectrum wordt vervolgens geanalyseerd op een geautomatiseerde wijze met emissie pieken gemonteerd op natuurlijk voorkomende biologische elementen. Deze routines beschikbaar zijn binnen de beamline controle software grafische gebruikersinterface (GUI) - GDA (www.opengda.org) bij ons bedrijf en synchrotrons in heel Europa 41 , 42.</li>
		<li>Als geschikte elementen worden geïdentificeerd die kunnen worden benut voor een abnormale diffractie-experiment, uitvoeren van een X-ray absorptie rand energie scan om te bepalen van de optimale golflengte voor collectie van abnormale diffractie gegevens uit het kristal: op de beamline controle software, selecteert u het element en de scan starten (fluorescentie/fluorescentie Scan instelling, &#8594; atoom naam, &#8594; uitvoeren, figuur 2B). 
		Opmerking: Voor een enkele afwijkende diffractie-experiment, het hoogtepunt van de absorptie rand wordt gebruikt voor het maximaliseren van de abnormale verstrooiing. Experimentele overwegingen voor het uitvoeren van een experiment multi golflengte abnormale diffractie geweest eerder gedetailleerde 43.</li>
		<li>Om te bepalen van de eenheidparameters cel crystal, symmetrie en diffractie limiet, drie röntgendiffractie patronen meten tussenpozen 45° met de trilling-methode (Data collectie/Screening &#8594; draaien current, Figuur 2C). De software van de controle van de beamline biedt de gebruiker met een keuze van trilling hoek en blootstellingstijd en de mogelijkheid om de overdracht van het percentage van de X-ray-balk. Voor een standaard crystal-screening, een hoek van de trilling van 0,5 °, een belichtingstijd van 0,5 s, en 5% X-ray lichtbundel transmissie worden aanbevolen. De gemeten diffractie-beelden worden automatisch geanalyseerd door de pijpleiding EDNA en een set van strategieën voor de collectie van een volledige gegevensset 22 retourneren.</li>
	</ol></li> <li>X-ray gegevensverzameling Opmerking: de gebruiker kan selecteren om gegevens in de standaard-interstadiaal modus of inverse beam-modus, waarmee Friedel stuurlieden dicht worden geregistreerd in de tijd en X-ray dosis, en met ongeveer hetzelfde absorptie gedrag te verzamelen het toestaan van een meer nauwkeurige meting van abnormale verschillen. De laatste is handig, vooral als kleine abnormale verschillen worden verwacht en/of de monsters straling gevoelig zijn bij het uitvoeren van een abnormale diffractie-experiment. Beschouwingen over de beste strategieën van de verzameling van de gegevens te gebruiken zijn volledig herziene 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47. <ol><li>met behulp van de software van de controle van de beamline, het importeren van de collectie parameters zoals voorgesteld door het programma van de strategie die zal bieden: i. beginpositie van de ω-rotatie-as ii. Breedte van de trilling van de ω-as rotatie hoek voor elke afbeelding diffractie iii. Belichtingstijd voor elke afbeelding diffractie iv. Aantal afbeeldingen voor een volledige dataset (niet indirect de totale ω-as rotatiehoek voor de hele gegevensverzameling definiëren) v. Percentage van demping van de X-ray-balk om overmatige blootstelling en straling schade te voorkomen Opmerking: bij onze instelling voor met het verzamelen van gegevens, de pijpleidingen software voor geautomatiseerde verwerking van de verzamelde gegevens zijn goed ingeburgerd: (i) de diffractie gegevens worden verlaagd (geïndexeerde, geïntegreerde en geschaald) door de xia2-pijpleiding, die genereert reflectie mtz bestanden voor de gebruiker als input voor een geleidelijke en structuur van de oplossing/verfijning 48. (ii) wanneer een aanzienlijke afwijkend signaal wordt gedetecteerd tijdens data-analyse, een eerste snelle geautomatiseerde structuur oplossing pijpleiding (fast_ep) met behulp van SHELX probeert op te lossen van de zware atoom onderbouw door experimentele fasering, het verstrekken van een gefaseerde elektronen dichtheid kaart Wanneer dat haalbaar is. Een tweede meer omvattende structuur oplossing pijpleiding verbindt automatisch pogingen op te lossen en de structu bouwenopnieuw met behulp van onafhankelijke software suites 49 , 50 , 51 , 52; in gevallen waar dit succesvol is, zal de gebruiker worden voorzien van een eerste model en elektron dichtheid kaart. Dit vormt de basis voor de gebruiker om te voltooien van verfijning en valideren van het model met de kristallografische software suites van keuze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze paper, we beschrijven en valideren van een geïntegreerde protocol voor biochemische en structurele karakterisatie van SBPs koolhydraten met een specifieke nadruk op eiwitten van S. pneumoniae. Niettemin, dit kan worden gebruikt als een standaardprocedure voor de analyse van andere SBPs uit verschillende organismen en zelfs andere niet-verwante oplosbare eiwitten.
Het eerste deel van het protocol is gericht op het verstrekken van biochemische informatie over eiwitstabiliteit en quaternaire structuur, die kan worden benut bij de voorbereiding van EiwitSteekproeven voor kristallisatie. In de sectie thermische shift testen beschrijven we alleen de pH en NaCl concentratie variaties het algemene karakter van deze procedure te handhaven. Ondanks dit, vele andere aandoeningen in de buffer kunnen worden getest op een gelijkaardige manier, bijvoorbeeld, met inbegrip van een chemische verbinding die als een stabiliserende additief gebruikt: met name de werkelijke ligand(s) die zich aan een specifieke SBP binden zijn opmerkelijk effectief in het verhogen van de Tm door een paar graden Celsius31. In sommige gevallen kunnen het denatureren curven slecht worden gedefinieerd als gevolg van lage signaal of een achtergrond van hoge fluorescentie, die wordt veroorzaakt door de aggregatie van eiwitten of gedeeltelijke ontvouwen. Om dit te voorkomen, kan een eiwit: kleurstof titratie worden uitgevoerd om de onduidelijk denatureren curven optimaliseren. Geen verbetering wordt verkregen, screening van verschillende additieven die de stabiliteit van het eiwit verbeteren kunnen wordt geadviseerd als geschikte schermen geweest eerder beschreven54.
Meestal de meeste SBPs zijn monomeer in hun natuurlijke omgeving, maar zoals hier multimerization kan optreden bij de hogere concentraties gebruikt in kristallisatie experimenten, dus de oligomerisatie gedrag karakterisering geboden door MALS en SEC is van essentieel belang om de meest gunstige stabiel monodispers oligomerisatie toestand voor kristallisatie te beoordelen. Het is echter moeilijk te voorspellen van het effect van verschillende chemische stoffen die zijn opgenomen in de voorwaarde van de kristallisatie van het gedrag van de oligomerisatie van de eiwitten. Als de SEC en MALS onderzoek uitgebreide aggregatie van de eiwitSteekproef toont, adviseren wij het volgende aan het verminderen van de kans dat dit zich voordoet: verse eiwitSteekproef (niet bevriezen-ontdooid) gebruiken en uitbreiden van de stabilisatie-analyse uitgevoerd met thermisch Shift testen, testen mogelijk additieven en milde detergenten als een laatste resource, tot een minimum beperken van aggregatie. In deze paper presenteren we basisrichtsnoeren voor kristallisatie high-throughput sparse matrix commerciële kristallisatie screening met het algemene karakter van dit protocol te handhaven. Echter het verkrijgen van hoge-resolutie röntgendiffractie eiwit kristallen wellicht iteratieve fijnafstemming voor het optimaliseren van de kristallisatie voorwaarden met betrekking tot de precipitant concentratie, pH, toevoeging van chemische additieven, verschillende temperaturen, en andere factoren de veranderende dynamica van het evenwicht tussen de kristallen druppel en reservoir16,17.
Het tweede deel van het protocol wordt de karakterisatie van de eiwit-kristallen beschreven ter vaststelling van de optimale strategie voor röntgendiffractie gegevensverzameling met een specifieke focus op de verwerving van afwijkende gegevens voor triest geleidelijke. Zelfs als SBPs een soortgelijke algemene architectuur handhaven (en er vele gedeponeerde 3D structuren mogelijk bruikbaar zijn als startende modellen), fasering van deze eiwitten door de methode van de moleculaire replacement is niet altijd eenvoudig vanwege de variabiliteit van de secundaire structuur elementen en de intrinsieke flexibiliteit van deze proteïnen. Vandaar, wij stellen de trieste methode en benadrukken dat deze proteïnen reeds hebben intrinsiek gebonden kunnen metalen of inderdaad niet-specifieke binding van metalen uit de kristallisatie buffer voorwaarden, die een aantal abnormale buigingsinrichting elementen zoals bieden kunnen een standaard stap in onze algemeen protocol.
Kortom, definieert dit protocol een standaard begeleide werkstroom van procedures waardoor de gedetailleerde beschrijving van de biochemische en structurele kenmerken van de SBPs die kunnen worden benut om het verhogen van het slagingspercentage van structuur vastberadenheid, evenals het versnellen de structurele karakterisatie van SBPs in het algemeen.

S. pneumoniae (Schizophrenia) is een gram-positieve bacterie die woonachtig zijn asymptomatically in de bovenste luchtwegen van de menselijke luchtwegen met de mogelijkheid om te migreren naar normaal steriele niches veroorzaakt otitis, sepsis, pneumonie en sepsis, en meningitis1,2. Bovendien, pneumokokken infectie is de belangrijkste oorzaak van Gemeenschap-verworven pneumonie, die tot een klinische en economische last wereldwijd3,4 bijdraagt. Antibioticum resistente stammen van S. pneumoniae hebben verspreid over de hele wereld en hoewel een zeven-valent en een dertien-valent pneumokokken eiwit geconjugeerde vaccin hebben bijgedragen aan het tarief van antimicrobiële resistentie, vervanging stammen uit verlagen vaccin gebruik naar voren zijn gekomen en hebben geleid tot hogere eisen voor onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor pneumokokken ziekte5,,6,,7,8.
De pneumococcus is afhankelijk van suikers geïmporteerd uit de host als een CO2 bron9,10; inderdaad besteedt het 30% van haar invoer apparaat voor het vervoer van 32 verschillende koolhydraten11,-12,13. Deze importeurs omvatten ten minste acht ABC-transporters13. In ABC vervoerders spelen de extracellulaire SBPs een fundamentele rol in het bepalen van de specificiteit voor de ligand en presenteert het aan de vervoerder integraal membraan voor opname in de cel. SBPs vertegenwoordigen geldige doelen voor het ontwerp van nieuwe vaccins en microbiciden, omdat ze oppervlakte-eiwitten en hun vitale rol in de cellulaire processen zijn.
Karakterisering van de eiwitten van het doel en gedetailleerde beschrijving van de structurele kenmerken, zoals ligand zakken en interdomain flexibiliteit, bieden een nuttig instrument voor structuur gebaseerde drug design14,15. Röntgendiffractie is de methode van keuze voor de structurele karakterisatie van eiwitten bij in de buurt van atomaire resolutie, maar de kristallisatie proces is onvoorspelbaar, tijdrovend en niet altijd succesvol. Systematische methoden verbeterd het slagingspercentage en belangrijke factoren zijn de steekproef kwaliteit en stabiliteit. Het slagingspercentage van kristallisatie is beïnvloed door de chemische eigenschappen van de eiwitten en de sample voorbereiding methodologie. Het effect hiervan kan worden beoordeeld en door Biochemische karakterisering16,17in kennis gesteld.
Een verdere complicatie voor structuur gebaseerde ontwerp is de kristallografische fase probleem, die moet worden aangepakt. Zoals meer eiwit structuren beschikbaar zijn gekomen, kunnen vele structuren worden opgelost door de methode van moleculaire replacement, waarvoor een homologe structuur18. SBPs presenteren een flexibele domeinstructuur, kan moleculaire vervanging ook blijken uitdagende19. Als een structureel model dat voldoende vergelijkbaar is met het doel-eiwit niet beschikbaar is, kan een aantal technieken te verkrijgen van de experimentele phasing20worden gebruikt. Onder deze, de Single-golflengte Anomalous Dispersion (ed)-methode heeft ontpopt als de primaire techniek en uitgebreid om op te lossen het probleem fase21is gebruikt. Het gebruik van de trieste methode heeft verder naar voren geschoven met verbeteringen in de hardware en software, evenals gegevens verzameling strategieën om de opsporing en het gebruik van zwakke abnormale signalen voor geleidelijke afschaffing van22,23, 24. Bovendien, voorschotten in directe methode voor het oplossen van de structuur van macromoleculen, die in het verleden diffractie gegevens naar atomaire resolutie vereiste, kan nu worden gebruikt door combineren bijvoorbeeld stereochemische kennis, zoals dit is geïmplementeerd in het programma ARCIMOLDO25. Een nuttig overzicht van methodes voor het oplossen van het probleem van de fase in de kristallografie is gegeven door Taylor26.
Hier presenteren we een gerationaliseerde protocol voor de karakterisatie van de koolhydraten vervoer SBP, SP0092 van S. pneumoniae, integratie van biochemische en structurele technieken (Figuur 1). Dit stapsgewijze protocol biedt een nuttig voorbeeld testcase van strategieën ter verbetering van het slagingspercentage van structurele studies over SBPs in het algemeen, die te in alle koninkrijken van het leven vinden zijn. Met name het protocol benadrukt het belang van het karakteriseren van de meest stabiele oligomere staat van het eiwit in oplossing in een snelle en doeltreffende methode, en de identificatie van de beste soort te volgen voor de kristallisatie experimenten kunt. Hoewel er meer dan 500 SBP structuren gemeld in de Protein Data Bank27, kan moleculaire vervanging lastig vanwege de flexibele aard van de twee α/β-domeinen, die zijn verbonden door een scharnier regio19. Dus, het tweede deel van het protocol wordt beschreven met de trieste methode voor geleidelijke afschaffing van gebonden metaalionen, die gemeenschappelijk in SBPs, evenals de opneming van selenomethionine en het gebruik van selenium (Se is) in Trieste geleidelijke.

<table><tbody><tr><td>SelenoMethionine Medium Complete</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-500</td><td>Gebaseerd op een synthetisch M9 minimaal media aangevuld met glucose, vitaminen en aminozuren met uitzondering van L-methionine. Andere equivalente producten zijn commercieel verkrijgbaar bij andere bedrijven.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well plate</td><td>Applied Biosystems</td><td>4306737</td><td>De Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reactieplaat met Barcode is geoptimaliseerd om ongeëvenaarde temperatuurnauwkeurigheid en uniformiteit te bieden voor snelle, efficiënte PCR-amplificatie. Deze plaat, geconstrueerd uit een enkel stuk stijf polypropyleen in een 96-well formaat, is compatibel met Applied Biosystems&reg; 96-Well Real-Time PCR-systemen en thermale cyclussen.</td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Molecular Probes</td><td>S6651</td><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain is een gevoelige, kant-en-klare fluorescente vlek voor eiwitten in 1D gels. Een vrij universele en goed gevestigde eiwitkleurstof voor hydrofobe regio's.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>De Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film vermindert de kans op well-tot-well besmetting en sample verdamping wanneer toegepast op een microplaat. Het is ideaal voor optische meting, omdat het een lage achtergrond geeft.</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>Het Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-systeem maakt standaard 96-well formaat hoge snelheid thermische cyclus mogelijk, waardoor uw uitvoeringstijd voor kwantitatieve real-time PCR-toepassingen aanzienlijk wordt verkort, met resultaten in ongeveer 30 minuten. Het Upgrade-kit is beschikbaar om een standaard 7500 Real-Time PCR-systeem te upgraden naar de Fast Configuratie via een service-installatie in het veld. Andere RT-PCR-machines kunnen worden gebruikt. Gegevensexport niet eenvoudig voor de oude data-analysesoftware.</td></tr><tr><td>Superdex 200 increase 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL is een veelzijdige, voorgepakte kolom voor exclusiechromatografie in kleinschalige (mg) preparatieve zuivering evenals voor karakterisering en analyse van eiwitten met molecuulgewichten tussen 10 000 en 600 000, zoals antilichamen. Optimale scheiding ideaal voor hoge resolutie biofysische technieken.</td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II</td><td>Wyatt</td><td></td><td>DAWN HELEOS II is de belangrijkste Multi-Angle statische Lichtverstrooiing (MALS) detector voor absolute karakterisering van de molaire massa en grootte van macromoleculen en nanodeeltjes in oplossing. De DAWN biedt de hoogste gevoeligheid, het breedste bereik van molecuulgewicht, grootte en concentratie, en de grootste selectie van configuraties en optionele modules voor verbeterde mogelijkheden. Andere MALS detectiesystemen van andere bedrijven behalve Wyatt zijn niet getest, dus er kan geen aanvullende feedback worden gegeven.</td></tr><tr><td>Superdex 200 5/150 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906561</td><td>Superdex 200 zijn voorgepakte exclusiechromatografie kolommen voor hoog-resolutie kleinschalige preparatieve en analytische scheidingen van biomoleculen. Superdex 200 heeft een scheidingsbereik voor moleculen met molecuulgewichten tussen 10 000 en 600 000. De piekscheiding is niet zo optimaal als voor de "increase" versie, maar dit model is ideaal voor het standaard dagelijks gebruik.</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade zijn voorgepakte XK kolommen ontworpen voor hoog-resolutie preparatieve gel filtratie chromatografie.</td></tr><tr><td>24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate</td><td>MiTeGen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td>De 24 well "big" kristallisatieplaat wordt voornamelijk gebruikt voor eiwitkristallen screening door sitting drop dampdiffusietechnieken, en voor optimalisatie van kristallisatiecondities. Het heeft een vrij grote reservoirput en monstercontainer, die gunstig zijn voor handmatig hanteren en grote eiwitkristallengroei. Bovendien zijn de vlakke oppervlakken gemakkelijk te verzegelen met transparant plakband of dekglasjes.</td></tr><tr><td>PCT Pre-Crystallization Test</td><td>Hampton</td><td>HR2-140</td><td>De PCT Pre-Crystallization Test wordt gebruikt om de geschikte eiwitconcentratie voor kristallisatie screening te bepalen.</td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>6098xx</td><td>Vierkante putjesplaten hebben drie kristallisatieputjes per reservoir, waardoor het mogelijk is om 288 monsters per plaat te testen. Over het algemeen alleen gebruikt voor de initiële screening omdat hun vierkante rand het vissen van kristallen bemoeilijkt.</td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-601</td><td>De Universal V1-Puck (Uni-puck) is een opslag- en verzendcontainer voor monsterspinnen voor gebruik met de meeste geautomatiseerde monstermontagesystemen wereldwijd - inclusief de ACTOR, SAM en CATS systemen onder anderen (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI en in de VS)</td></tr><tr><td>Standard Foam Dewar</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-35</td><td>5,7" diameter door 2,8" diep. 800mL capaciteit.</td></tr><tr><td>Mounted CryoLoop - 20 micron</td><td>Hampton</td><td>HR4-955</td><td>Gemonteerde CryoLoops met 20 micron diameter nylon. Deze nylon loops zijn gebonden aan holle, roestvrijstalen MicroTubes&trade; die worden gebruikt om de kristallen te monteren, invriezen en vastzetten tijdens cryokristallografische procedures en röntgengegevensverzameling. Er bestaan verschillende maten en ze kunnen worden aangepast in lengte. Het zijn behoorlijk veelzijdige tools.</td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Puck dewar loading tool</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-607</td><td>Dit gereedschap wordt gebruikt om uni-pucks te scheiden om ze in de robotdewar te laden. Het bestaat uit twee delen: een Teflon buis en een metalen staaf.</td></tr></tbody></table>

biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne sp0092

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Ontwikkeling van nieuwe microbiciden en vaccins voor Streptococcus pneumoniae (Schizophrenia) zijn noodzakelijk voor het stoppen van de snelle stijging van de meervoudige resistente stammen. Koolhydraten substraat bindende proteïnen (SBPs) vertegenwoordigen haalbare doelen voor de ontwikkeling van vaccins op basis van eiwitten en nieuwe antimicrobiële stoffen vanwege hun extracellulaire lokalisatie en de centraliteit van koolhydraten invoer voor pneumokokken metabolisme, respectievelijk. Hier beschreven is een gerationaliseerde geïntegreerde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide karakterisering van SP0092, die kan worden uitgebreid tot andere koolhydraten SBPs uit de pneumococcus en andere bacteriën. Deze procedure kan helpen het structuur gebaseerde ontwerp van remmers voor deze klasse van eiwitten. Gepresenteerd in het eerste deel van dit manuscript zijn protocollen voor biochemische analyse door thermische shift assay, multi hoek lichtverstrooiing (MALS) en uitsluiting chromatography (SEC), de grootte die het optimaliseren van de stabiliteit en homogeniteit van het monster gericht aan kristallisatie proeven en zo vergroten de kans op succes. Het tweede deel van deze procedure beschrijft de karakterisatie van de SBP kristallen met behulp van een afstembare golflengte abnormale diffractie synchrotron beamline en gegevens verzameling protocollen voor gemeten gegevens die kunnen worden gebruikt om op te lossen het gekristalliseerde eiwit structuur.

Dit geïntegreerde protocol is bewezen succesvol met vier (twee gepubliceerde en ongepubliceerde twee structuren) van zes koolhydraten bindende eiwit doelstellingen van Schizophrenia geanalyseerd tot op heden32,,53. In deze sectie presenteren wij de biochemische en structurele karakterisatie van SP0092 als een representatief resultaat te begeleiden van structurele studies van SBPs in het algemeen.
Nadat de SBP-SP0092 is uitgedrukt en gezuiverd zoals eerder omschreven32, het gezuiverde eiwit werd geanalyseerd voor stabiliteit van de buffer met behulp van een thermische shift test: SP0092 vertoont een verhoogde Tm met een pH van 6.5 en in aanwezigheid van NaCl in de 0 - 0.2 M concentratiebereik (figuur 3A). In dit licht was de bufferoplossing voor de volgende stappen gedefinieerd als: 0,02 M MES pH 6,5, 0,2 M NaCl, 2,5% (v/v) glycerol, 0.5 mM TCEP. De absolute molaire massa van de Staten van de verschillende oligomerisatie van SP0092 werd gemeten door MALS gekoppeld aan SEC het meten van een molecuulgewicht van 187,2, 140,8 97,0 en 49.4 kDa, overeenkomt met het tetramere, trimeric, dimeric en monomeer soorten, respectievelijk () Figuur 3B). Het onderzoek van de SEC-profiel in verschillende eiwit verdunningen bleek dat de oligomerisatie wordt geactiveerd door verhoogde eiwitconcentratie, suggereren dat de grotere oligomeren stabieler bij hogere concentraties dan meestal gebruikt in kristallisatie. Inderdaad, de gezuiverde grotere oligomere soorten omgeleid naar kristallisatie proeven, met succes geproduceerde eiwit kristallen terwijl het monomeer soorten niet.
De geoptimaliseerde kristallen verkregen uit de inheemse en Se-methionine vormen van SP0092 het label werden gekenmerkt door röntgendiffractie. Meting van de Röntgen fluorescentie van deze kristallen geopenbaard in beide gevallen emissie pieken voor Zn wordt gebonden aan het eiwit, terwijl Se alleen voor de Se-methionine kristallen zoals verwacht werd ontdekt. Later, werden X-ray absorptie scans aan de randen van de Se en Zn uitgevoerd, die geboden directe experimentele gegevens om af te stemmen op het incident golflengte X-ray aan de respectieve X-ray absorptie randen van Zn of Se presenteren in de kristallen te maximaliseren van het afwijkend signaal verkrijgbaar bij de resulterende gegevens (figuur 4A-B).
Na drie diffractie patronen op lage transmissie te meten, werd een complete set voor afwijkende gegevens verkregen met behulp van de gegevens collectie strategie voorgesteld door EDNA (figuur 4C). Het afwijkend signaal aanwezig activeert de geautomatiseerde phasing pijpleiding op de beamline om te bepalen van de sub structuur, en op basis van de eerste experimentele fasen afgeleid, produceert eerste kaarten en modellen, die vervolgens kunnen worden verfijnd en gevalideerd (Figuur 4 d ).
Kortom, zijn potentiële valkuilen van de techniek gecentreerd voornamelijk op crystal beschikbaarheid en kwaliteit. Optimalisatie van de voorwaarden van de buffer te verbeteren van eiwitstabiliteit, alsmede de identificatie van de meest geschikte oligomere staat van het eiwit te gebruiken, wanneer meer dan één oligomeren wordt geïdentificeerd in oplossing, kan het risico van mislukking op de kristallisatie fase. Exploitatie van het gebruik van afhankelijke metaalionen in een vroeg stadium geïdentificeerd kan versnellen structuur oplossing en vermijden van geen onnodige productie van selenomethionine label eiwit als vervanging van de moleculaire methoden falen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
Figuur 1. Diagram van de workflow voor biochemische en structurele karakterisatie van koolhydraten SBPs. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
Figuur 2. Crystal karakterisering in GDA. (A) Screenshot van het tabblad Röntgen fluorescentie beheer van de software van de controle van het beamline van GDA. (B) Screenshot van de X-ray energie rand-scan controle tab in GDA. (C) Screenshot van het tabblad gegevens verzameling crystal screening in GDA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
Figuur 3. Biochemische karakterisering van SP009239-491. (A) 3D-oppervlak grafiek plotten van de smelttemperatuur van SP009239-491 als een functie van de pH en de concentratie van de NaCl bufferoplossing. (B) SEC en MALS resultaten voor SP009239-491. Absorptie bij 280 nm wordt in blauw weergegeven. De molaire massa van de verschillende oligomerisatie Staten worden in rood weergegeven. Deelvenster (B) is gewijzigd van32. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
Figuur 4. Structurele karakterisering van SP009239-491. (A) en (B) X-ray absorptie energie scan aan de rand van het Zn en Se voor SP009239-491 kristallen. De gemeten fluorescentie van de Zn en Se met kristallen wordt weergegeven in het blauw, cyaan en de berekende f' en f "abnormale verstrooiing breuken zijn in groen en rood, respectievelijk. (C) voorbeelden van röntgendiffractie patronen verzameld uit SP009239-491 kristallen. (D) Cartoon vertegenwoordiging van de SP009239-491 dimeer structuur. Een protomer is wit gekleurd en de andere magenta (residuen 39-366) en violet (residuen 367-491), en de abnormale verstrooiing atomen worden weergegeven als blauwe en cyaan ballen voor Zn en Se, respectievelijk. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0,1 M citroenzuur pH 4.0</td>
			<td>0,1 M citroenzuur pH 4,5</td>
			<td>0,1 M fosfaat pH 5.0</td>
			<td>0,1 M citraat pH 5.5</td>
			<td>0,1 M Bis-tris pH 6</td>
			<td>0,1 M ADA pH 6,5</td>
			<td>0,1 M MOPS pH 7</td>
			<td>0,1 M HEPES pH 7.5</td>
			<td>0,1 M imidazool pH 8,0</td>
			<td>0,1 M Tris pH 8,5</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0,1 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,2 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.5 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
	

Tabel 1. De samenstelling van de buffer voor thermische shift assay.

Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Het algemene doel van deze procedure is de biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraatsubstraatbindend eiwit van streptococcus pneumoniae. Deze methode kan helpen bij het leveren van sleutelgegevens om instructieve studies van substraatbindend eiwit te ondersteunen, zoals de identificatie van de bufferstabiliteitsprofielen, oligomerisatietoestanden en atomaire structuren. De voordelen van deze procedure zijn dat het gegevens levert die de succeskans van kristallisatie en structuuroplossing voor substraatbindende eiwitten op een robuuste en eenvoudige manier kunnen verhogen.Bereid eerst 48 bufferoplossingen met een pH-bereik van 4,0 tot 9,5 en natriumchlorideconcentraties variërend van nul tot 0,5 molair. Dispenseer 40 microliter van elke oplossing in een 96-wellsplaat. Verkrijg een gezuiverde oplossing van het gekozen substraatbindend eiwit.Voeg vijf microliter van de SBP-oplossing toe aan elke put voor een concentratie van één tot twee milligram per milliliter. Voeg vervolgens vijf microliter van een 20-voudig geconcentreerde fluorescerende vlek toe aan elke put. Meng de oplossingen door op en neer te pipetten.Versluit de plaat met transparant plakfolie. Centrifugeer de plaat bij 112 keer G op kamertemperatuur gedurende twee minuten. Configureer een real-time PCR-systeem om te lopen van vier tot 99 graden Celsius met een snelheid van drie graden per minuut met een vasthoudtijd van 10 seconden.Stel het systeem in om fluorescentiemetingen elke halve graad te nemen. Stel de fluorescentiefilterinstelling in. en wijs de monsters toe.Voer het experiment uit en identificeer de bufferconditie met de hoogste smelttemperatuur. Bereid vervolgens een buffer met de gekozen pH en natriumchlorideconcentratie die 2,5%volume glycerol en een TCEP-concentratie van 0,5 millimolair omvat. Karakteriseer het gezuiverde SBP met analytische exclussiechromatografie met multi-hoekige lichtverstrooiing.Identificeer de meest stabiele soort geschikt voor kristallisatie en gebruik voorbereidende SEC om pure fracties van die soorten te verkrijgen. Voer voorkristallisatietests uit om de optimale eiwitconcentratie voor kristallisatie te bepalen. Gebruik een roboticasysteem voor kristallisatie om de gewenste commerciële kristallisatieoplossingen in de oplossingsreservoirs van een optische 96-wells sitting drop plaat te doseren.Gebruik vervolgens het systeem om 100 nanoliter van de eiwit oplossing in elke kristallisatiedropput te doseren. Breng 100 nanoliter van elke kristallisatieoplossing over van de reservoirputten naar de corresponderende welputten. Versluit de plaat met optisch plakfolie.Gebruik een microscoop of een geautomatiseerd beeldvormingssysteem om de kristalvorming en groei om de één tot twee dagen te evalueren voor twee weken, en daarna één keer per week. Wanneer voldoende grote en goed gevormde kristallen zijn gevormd, bereid een batch van de kristallisatieoplossing voor met een extra 25%volume glycerol om als cryoprotectant te dienen. Vul vervolgens een schuimdewar met vloeibare stikstof.Dompel een unipuck monsterbehuizing in de vloeibare stikstof en laat de behuizing afkoelen. Knip vervolgens de folie uit boven een druppel met een kristal van belang. Deponeer 0,5 microliter van de cryoprotectant op een dekglas dicht bij de druppel of in de lege druppelkamer van dezelfde toestand indien beschikbaar.Bevestig aan een magnetische stang een cryoloop gemonteerd op een SPINE standaardbasis. Gebruik de cryoloop om het kristal van belang over te brengen naar de druppel cryoprotectant. Gebruik vervolgens de cryoloop om het kristal van de cryoprotectant over te brengen naar de eerste lege positie van de ondergedompelde unipuck monsterbehuizing.Herhaal dit proces om extra kristallen te oogsten. Zodra alle kristallen van belang in de monsterbehuizing zijn geladen, gebruik de puck stang om de unipuck basisplaat op de behuizing te plaatsen. Vervoer de unipuck in vloeibare stikstof naar de straalbuis.Gebruik cryotang en een puck dewar laadgereedschap om de unipuck in de straalbuis monsterwisselaar dewar te laden en om de monsterbehuizing los te koppelen. Selecteer vervolgens het monster in de straalbuis software om het monster automatisch in de röntgenstraal te plaatsen. Verwerf een röntgenfluorescentiespectrum en identificeer eventuele elementen die kunnen worden gebruikt in een anomale diffractie-experiment.Bepaal de optimale golflengte voor het verzamelen van anomale diffractiegegevens door een röntgenabsorptie-energiescan uit te voeren. Verwerf vervolgens drie röntgendiffractiepatronen met intervallen van 45 graden in standaard oscillatiemodus om automatisch de eenheidscelparameters van de kristal, symmetrie en diffractielimiet te bepalen. Importeer de aanbevolen gegevensverzamelingparameters in de straalbuissoftware en voer een enkel- of multigolflengte anomale diffractie-experiment uit zoals passend.De stabiliteit van het substraatbindend eiwit SP0092 in verschillende zoutbuffers werd geëvalueerd om de optimale bufferoplossing te identificeren. De hoogste smelttemperaturen werden gevonden voor buffers met een pH van 6,5 en natriumchlorideconcentraties variërend van nul tot 0,2 molair. Een buffer met een pH van 6,5 en een natriumchlorideconcentratie van 0,2 molair werd geselecteerd voor de procedure.De verschillende oligomerisatietoestanden van SP0092 werden geïdentificeerd en gescheiden met SEC-MALS. Een analyse van het SEC profiel bij verschillende eiwitconcentraties gaf aan dat verhoogde eiwitconcentratie oligomerisatie activeert, wat suggereert dat grotere oligomeren stabieler zijn bij hoge concentraties. In overeenstemming hiermee produceerden de grote oligomeren kristallen in kristallisatieproeven, terwijl de monomeer dat niet deed.Röntgenfluorescentie van zowel native als selenomethionine-gelabelde SP0092 kristallen gaf aan dat zink aan het eiwit gebonden is in beide vormen. Het abnormale signaal werd gemaximaliseerd door de invallende röntgengolflengte af te stemmen op de röntgenabsorptiegrenzen van zink of seleen. Een volledige anomale dataset werd vervolgens verkregen, en geautomatiseerde analyse geactiveerd door de aanwezigheid van een abnormaal signaal genereerde initiële kaarten van de eiwitstructuren.Modellen gebouwd in deze initiële kaarten werden vervolgens verfijnd en gevalid

biochemical-structural-characterization-carbohydrate-transport

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Surface Plasmon Resonance (SPR) is een label vrij werkwijze voor het detecteren van biomoleculaire interacties in real time. Hierin, een protocol voor een membraaneiwit: wordt receptor interactie experiment beschreven, terwijl de discussie over de voors en tegens van de techniek.

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

We presenteren een geautomatiseerde modulaire methode met hoge doorvoer voor de identificatie en karakterisering van microbiële exopolysachariden op kleine schaal. Deze methode combineert een snelle preselectie om de totale hoeveelheid uitgescheiden polysacchariden te analyseren met een gedetailleerd koolhydraat-vingerafdruk om het snelle screenen van nieuw geïsoleerde bacteriestammen of hele stamcollecties mogelijk te maken.

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

We beschrijven een methode voor de karakterisering van protonen-gedreven membraan transporteurs in membraan vesikel preparaten geproduceerd door heterologeuze expressie in E. coli en Lysis van cellen met behulp van een Franse pers.

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Het hier gepresenteerde protocol is bedoeld om het optreden van heterologe interacties tussen Golgi-residente type III membraaneiwitten met cytoplasmatisch blootgestelde N- en/of C-termini in levende zoogdiercellen aan te tonen met behulp van de meest recente variant van de split luciferase complementatie assay.

Demonstratie van heterologe complexen gevormd door Golgi-Resident Type III membraaneiwitten met behulp van Split Luciferase Complementation Assay

Open zoeken maakt de identificatie van glycopeptiden versierd met voorheen onbekende glycaansamenstellingen mogelijk. In dit artikel wordt een gestroomlijnde aanpak voor het uitvoeren van open zoekopdrachten en daaropvolgende glycaangerichte glycopeptide-zoekopdrachten gepresenteerd voor bacteriële monsters met behulp van Acinetobacter baumannii als model.

De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden

Het huidige protocol beschrijft nieuwe hulpmiddelen voor SPR-bindingstests om CV-N-binding aan HA, S-glycoproteïne, gerelateerde hybride-type glycanen en oligosacchariden met een hoog mannosegehalte te onderzoeken. SPR wordt gebruikt om de KD te bepalen voor het binden van dimerische of monomere CV-N aan deze glycanen.

Engineering antivirale middelen via Surface Plasmon Resonance

Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

Recente studies benadrukken de rol van enzymen van de menselijke darmmicrobiota bij het metaboliseren van C-glycosiden. Hier presenteren we een uitgebreide methodologie die analytische chemietechnieken (LC-MS/MS en NMR) integreert met structurele biologische benaderingen om de structurele en enzymatische reactieketens van deze C-glycoside-metaboliserende enzymen systematisch te karakteriseren.

Structurele biologie en analytische chemie benaderingen voor het karakteriseren van C-glycoside metabole enzymen in de menselijke darmmicrobiota

Dit op NMR gebaseerde protocol onderzoekt zwakke eiwit-glycaaninteracties met behulp van cyanovirine-N en D-mannose. Door ligand- en eiwitgedetecteerde methoden te combineren, brengt het bindingsplaatsen in kaart, detecteert het allosterische effecten en identificeert het ontmoetingscomplexen. De aanpak schetst monstervoorbereiding en gegevensanalyse en biedt structurele en dynamische inzichten die waardevol zijn voor glycaanspecifieke diagnostiek en herkenningsmechanismen.

Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

Leer de biochemische en structurele karakterisatie van koolhydraatbindend proteïne SP0092 uit Streptococcus pneumoniae. Deze methode optimaliseert kristallisatieomstandigheden en structurele analyse voor therapeutisch onderzoek.

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Meer video's verkennen