Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Het algemene doel van deze procedure is de biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraatsubstraatbindend eiwit van streptococcus pneumoniae. Deze methode kan helpen bij het leveren van sleutelgegevens om instructieve studies van substraatbindend eiwit te ondersteunen, zoals de identificatie van de bufferstabiliteitsprofielen, oligomerisatietoestanden en atomaire structuren. De voordelen van deze procedure zijn dat het gegevens levert die de succeskans van kristallisatie en structuuroplossing voor substraatbindende eiwitten op een robuuste en eenvoudige manier kunnen verhogen.

Bereid eerst 48 bufferoplossingen met een pH-bereik van 4,0 tot 9,5 en natriumchlorideconcentraties variërend van nul tot 0,5 molair. Dispenseer 40 microliter van elke oplossing in een 96-wellsplaat. Verkrijg een gezuiverde oplossing van het gekozen substraatbindend eiwit.

Voeg vijf microliter van de SBP-oplossing toe aan elke put voor een concentratie van één tot twee milligram per milliliter. Voeg vervolgens vijf microliter van een 20-voudig geconcentreerde fluorescerende vlek toe aan elke put. Meng de oplossingen door op en neer te pipetten.

Versluit de plaat met transparant plakfolie. Centrifugeer de plaat bij 112 keer G op kamertemperatuur gedurende twee minuten. Configureer een real-time PCR-systeem om te lopen van vier tot 99 graden Celsius met een snelheid van drie graden per minuut met een vasthoudtijd van 10 seconden.

Stel het systeem in om fluorescentiemetingen elke halve graad te nemen. Stel de fluorescentiefilterinstelling in. en wijs de monsters toe.

Voer het experiment uit en identificeer de bufferconditie met de hoogste smelttemperatuur. Bereid vervolgens een buffer met de gekozen pH en natriumchlorideconcentratie die 2,5%volume glycerol en een TCEP-concentratie van 0,5 millimolair omvat. Karakteriseer het gezuiverde SBP met analytische exclussiechromatografie met multi-hoekige lichtverstrooiing.

Identificeer de meest stabiele soort geschikt voor kristallisatie en gebruik voorbereidende SEC om pure fracties van die soorten te verkrijgen. Voer voorkristallisatietests uit om de optimale eiwitconcentratie voor kristallisatie te bepalen. Gebruik een roboticasysteem voor kristallisatie om de gewenste commerciële kristallisatieoplossingen in de oplossingsreservoirs van een optische 96-wells sitting drop plaat te doseren.

Gebruik vervolgens het systeem om 100 nanoliter van de eiwit oplossing in elke kristallisatiedropput te doseren. Breng 100 nanoliter van elke kristallisatieoplossing over van de reservoirputten naar de corresponderende welputten. Versluit de plaat met optisch plakfolie.

Gebruik een microscoop of een geautomatiseerd beeldvormingssysteem om de kristalvorming en groei om de één tot twee dagen te evalueren voor twee weken, en daarna één keer per week. Wanneer voldoende grote en goed gevormde kristallen zijn gevormd, bereid een batch van de kristallisatieoplossing voor met een extra 25%volume glycerol om als cryoprotectant te dienen. Vul vervolgens een schuimdewar met vloeibare stikstof.

Dompel een unipuck monsterbehuizing in de vloeibare stikstof en laat de behuizing afkoelen. Knip vervolgens de folie uit boven een druppel met een kristal van belang. Deponeer 0,5 microliter van de cryoprotectant op een dekglas dicht bij de druppel of in de lege druppelkamer van dezelfde toestand indien beschikbaar.

Bevestig aan een magnetische stang een cryoloop gemonteerd op een SPINE standaardbasis. Gebruik de cryoloop om het kristal van belang over te brengen naar de druppel cryoprotectant. Gebruik vervolgens de cryoloop om het kristal van de cryoprotectant over te brengen naar de eerste lege positie van de ondergedompelde unipuck monsterbehuizing.

Herhaal dit proces om extra kristallen te oogsten. Zodra alle kristallen van belang in de monsterbehuizing zijn geladen, gebruik de puck stang om de unipuck basisplaat op de behuizing te plaatsen. Vervoer de unipuck in vloeibare stikstof naar de straalbuis.

Gebruik cryotang en een puck dewar laadgereedschap om de unipuck in de straalbuis monsterwisselaar dewar te laden en om de monsterbehuizing los te koppelen. Selecteer vervolgens het monster in de straalbuis software om het monster automatisch in de röntgenstraal te plaatsen. Verwerf een röntgenfluorescentiespectrum en identificeer eventuele elementen die kunnen worden gebruikt in een anomale diffractie-experiment.

Bepaal de optimale golflengte voor het verzamelen van anomale diffractiegegevens door een röntgenabsorptie-energiescan uit te voeren. Verwerf vervolgens drie röntgendiffractiepatronen met intervallen van 45 graden in standaard oscillatiemodus om automatisch de eenheidscelparameters van de kristal, symmetrie en diffractielimiet te bepalen. Importeer de aanbevolen gegevensverzamelingparameters in de straalbuissoftware en voer een enkel- of multigolflengte anomale diffractie-experiment uit zoals passend.

De stabiliteit van het substraatbindend eiwit SP0092 in verschillende zoutbuffers werd geëvalueerd om de optimale bufferoplossing te identificeren. De hoogste smelttemperaturen werden gevonden voor buffers met een pH van 6,5 en natriumchlorideconcentraties variërend van nul tot 0,2 molair. Een buffer met een pH van 6,5 en een natriumchlorideconcentratie van 0,2 molair werd geselecteerd voor de procedure.

De verschillende oligomerisatietoestanden van SP0092 werden geïdentificeerd en gescheiden met SEC-MALS. Een analyse van het SEC profiel bij verschillende eiwitconcentraties gaf aan dat verhoogde eiwitconcentratie oligomerisatie activeert, wat suggereert dat grotere oligomeren stabieler zijn bij hoge concentraties. In overeenstemming hiermee produceerden de grote oligomeren kristallen in kristallisatieproeven, terwijl de monomeer dat niet deed.

Röntgenfluorescentie van zowel native als selenomethionine-gelabelde SP0092 kristallen gaf aan dat zink aan het eiwit gebonden is in beide vormen. Het abnormale signaal werd gemaximaliseerd door de invallende röntgengolflengte af te stemmen op de röntgenabsorptiegrenzen van zink of seleen. Een volledige anomale dataset werd vervolgens verkregen, en geautomatiseerde analyse geactiveerd door de aanwezigheid van een abnormaal signaal genereerde initiële kaarten van de eiwitstructuren.

Modellen gebouwd in deze initiële kaarten werden vervolgens verfijnd en gevalid