Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om de effecten van hormoonontregelende stoffen, zoals bisfenolen, te testen op de netwerkspiksactiviteit van neuronale netwerken van gewervelde dieren die zijn gevestigd op multi-elektrode arrays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in ontwikkelingsneurobiologie en milieutoxicologie, zoals het werkingsmechanisme van milieutoxines op de ontwikkeling van netwerkactiviteit in de embryonale hersenen. Het grote voordeel van deze techniek is dat de effecten op neuronale netwerkparameters, zoals de gemiddelde ontlaadfrequentie, het totale aantal spikes en de spikesnelheid, evenals synchronie, nu kunnen worden bestudeerd.

Onze eerdere studie toonde aan dat EDC's het woord en gedrag beïnvloeden, wat een directe uitvoer van neuronale netwerken is, en ons protocol streeft nu ernaar het effect van EDC's op deze netwerken te begrijpen. Op de dag van het platen van neuronen, verwijder een flacon extracellulaire matrix uit de vriezer van min 20 graden Celsius, spuit met 70% ethanol en plaats op ijs. Zorg ervoor dat de extracellulaire matrix op ijs ontdooit.

Ontdooi niet op kamertemperatuur, omdat het ECM boven nul graden Celsius polymeriseert. Werk in de BSL2-kap om de extracellulaire matrix te verdunnen tot 25% door 300 microliters koud neurobasaal medium toe te voegen aan de 100 microliters aliquot. Gebruik vervolgens een P200 pipet om 100 microliters 25% extracellulaire matrixoplossing toe te voegen aan het midden van de multi-elektrode array, zorg ervoor dat u de elektroden niet raakt.

Verwijder onmiddellijk de ECM en laat een dunne film achter op het oppervlak. Bedek de multi-elektrode array en plaats deze in de weefselkweekincubator tot u klaar bent om de neuronen te plateren. Begin met het isoleren van kikenneuronen door de buitenschaal van een E7-ei te steriliseren met 70% ethanol.

Het is belangrijk om vanaf nu steriele omstandigheden te handhaven. Zorg ervoor dat alle instrumenten gesteriliseerd zijn met 70% ethanol en dat de oplossingen steriel zijn. Het is handig om een dissectiekap te gebruiken, maar dit is niet absoluut noodzakelijk voor dissecties als deze snel worden uitgevoerd.

Nadat het embryo is opgehaald en onthoofd, snijdt u rond de ogen en verwijdert u de oogbollen. Gebruik vervolgens Dumont nummer vijf fijne forceps en veerscharen om een incisie te maken aan de ventrale kant en verwijder de buitenste huidlagen om de voorhersenen en het optische tectum bloot te leggen. Verwijder voorzichtig het membraan.

Breng de voorhersenen over in een andere petrischaal met HBSS en snijd deze in kleine stukjes van ongeveer twee millimeter met veerscharen. Gebruik een steriele transferpipet om de stukken voorhersenen over te brengen in een 15-milliliter centrifugeerbuis. Nadat de stukken voorhersenen op de bodem van de centrifugeerbuis zijn gezonken, verwijdert u zoveel mogelijk HBSS.

Voeg vervolgens een milliliter voorverwarmde 0,5% trypsine EDTA toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik een Pasteurpipet om de trypsine voorzichtig te verwijderen zonder de stukken weefsel te verstoren. Voeg een milliliter neurobasaal medium toe en laat de weefselstukken naar de bodem zinken.

Na het verwijderen van het medium en het herhalen van de wassing, voegt u twee milliliter neurobasaal medium toe en tritureert u voorzichtig totdat er geen weefselstukken meer zichtbaar zijn. Verdun de gesuspendeerde cellen één op tien met neurobasaal medium. Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw kleurstof en een hemocytometer.

Na het tellen, plateert u de gedissocieerde cellen op ECM-gecoate, multi-elektrode arrays met een dichtheid van 2.200 cellen per vierkante millimeter. Voeg de volgende dag 10 micromolar BPA toe aan neurobasaal medium voor de behandelde, multi-elektrode arrays. Op de dag van acquisitie, vervangt u het kweekmedium door vers neurobasaal medium en plaatst u de arrays terug in de CO2-incubator gedurende minimaal twee uur voorafgaand aan het opnemen.

Start de opnamesoftware en stel de temperatuur van de multi-elektrode array in op 37 graden Celsius door op het temperatuurpictogram te klikken. Stel de acquisitieparameters in door streams te selecteren in het linker vensterpaneel en rechts te klikken op het muse pictogram. Selecteer vervolgens verwerking toevoegen en spike detector en klik op OK in het pop-upvenster.

Spike detector zes door STD verschijnt onder de bestandsnaam. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de spike detector, selecteer verwerking toevoegen en burst detector en klik op OK in het pop-upvenster. Burst detector ISI verschijnt onder het muse pictogram.

Klik vervolgens met de rechtermuisknop op burst detector, selecteer verwerking toevoegen en neurale statistieken compiler. Zorg ervoor dat in het pop-upvenster bestandsheader, geaggregeerde welbestadistieken en synchronie zijn geselecteerd, klik op OK. De statistieken compiler verschijnt hieronder. Klik op het klokpictogram onderaan het scherm en wijzig de informatie in de instellingensectie om elke 5,1 minuten op te nemen en vijf minuten op te nemen.

Dit wordt onmiddellijk gestart en wordt één keer uitgevoerd. Nadat de multi-elektrode array uit de incubator is gehaald, plaatst u deze op de opname-eenheid en vergrendelt u deze op zijn plaats. Begin met het opnemen van de netwerkactiviteit door op start opname te klikken in het geplande opnamegedeelte.

Meestal is een opnametijd van vijf minuten voldoende, hoewel langere opnamen tot 10 minuten mogelijk zijn. Na het opnemen, plaatst u de multi-elektrode array terug in de incubator. Het gemiddelde aantal spikes is significant lager in BPA-behandelde E7 kiken voorhersenenculturen in vergelijking met controleculturen.

De gemiddelde synchronie-index is significant lager in BPA-behandelde E7 kiken voorhersenenculturen in vergelijking met controleculturen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in minder dan drie uur worden uitgevoerd als het goed wordt gedaan. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat steriele omstandigheden altijd moeten worden gehand