Name: Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Ontdek hoe bisfenolen de neurale netwerkactiviteit van kippenembryo's beïnvloeden met multi-electrode arrays. Deze methode onthult de mechanismen waarmee hormoonontregelende stoffen de vroege hersenontwikkeling schaden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie wordt ondersteund door de NSF (HBCU-UP onderzoek Inleiding Award, HRD 1401426 en EPSCoR-EPS-0814251) en NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.S. wordt ondersteund door een beurs van de Delaware INBRE-III 6404.

Het protocol hieronder is gestandaardiseerd om te testen van de effecten van BPA blootstelling tijdens de embryogenese (begin), en kan worden aangepast voor gebruik met BPS, BPF of andere EDC in chick embryonale neuronen.
Dit protocol volgt het institutionele beleid van Delaware State University en het beleid van NIH voor aviaire embryo's. Het protocol is ook bevestiging met DSU van materiaal en chemische veiligheidsrichtlijnen.
1. materiële Setup
<ol><li>BPA (m.w. 228.29) in 10% ethanol (v/v) opgelost in water om een stamoplossing van 1 mM (0,23 mg per mL 10% ethanol). Maak opeenvolgende verdunningen (0.1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM en 10 µM) in neurobasal medium. Let op: BPA is een ecologische toxine en moet voorzichtigheid worden betracht bij de behandeling van het poeder.</li>
	<li>Incubeer chick eieren in een broedstoof verkrijgbare tafelblad ei bij 37 ° C. Incubeer eieren gedurende 7 dagen voor embryo's de E7.</li>
	<li>Bereiden tijdseenheid Sterilize het vereiste aantal multilaterale milieuovereenkomsten door onderdompelen in 70% ethanol voor 3 tot 4 h en spoel na drie keer in ongeveer 10 mL steriel gedistilleerd water in de kap van de BSLII. Opmerking: De multilaterale milieu-akkoorden bevatten 64 nanoporeuze platina-elektroden, gerangschikt in een 8 x 8 raster. De diameter van de elektrode is 30 µm en de afstand tussen de elektroden is 200 µm. Gebruik geen gedenatureerde ethanol voor het steriliseren van de multilaterale milieu-akkoorden, omdat dit tot corrosie van de MEA leiden zal.</li>
	<li>Plaats de multilaterale milieuovereenkomsten binnen een steriele container met deksel (om steriele omstandigheden) en naar een tafelblad incubator. Bak gedurende ten minste 6 uur bij 55 ° C. Deze stap is essentieel voor goede sterilisatie en de temperatuur mag niet hoger zijn dan 60 ° C. Handhaving van de steriliteit, verplaatsen de schotel met multilaterale milieuovereenkomsten aan de kap van de BSLII voor opslag tot verder gebruik. Opmerking: We gebruiken een oven veilige glazen ovenschaal met plastic deksel en oppervlak het steriliseren met 70% ethanol en plaats in de kap van de BSLII voor het drogen.</li>
	<li>Aliquot de extra-cellulaire matrix ECM-oplossing. De flacon bij 4 ° C's nachts ontdooien en bevriezen van 100 µL aliquots bij-20 ° C. Opmerking: De ECM is bevroren verzonden. ECM moet niet worden gebracht op kamertemperatuur totdat u jas en het polymerizes bij kamertemperatuur, zodra de polymeervorm, het is onmogelijk om de vacht. ECM zonder groeifactoren heeft de voorkeur om te voorkomen dat aanvullende effecten als gevolg van onbekende factoren.</li>
	<li>Steriliseren van alle instrumenten van de dissectie (Dumont #5 pincet gebogen pincet, kleine schaar en voorjaar schaar) en zelfsluitende materiaal bekleed dissectie gerechten met 70% ethanol en laat ze drogen in de dissectie kap.</li>
</ol>2. chick embryonale Neuron cultuur en netwerkactiviteit
<ol><li>Op de dag van de beplating, het verwijderen van een flesje voor ECM uit de diepvries van-20 ° C, spuiten met 70% ethanol en plaats op ijs. Vul aan tot 25% door het toevoegen van 300 µL koude neurobasal medium binnen BSLII kap.</li>
	<li>Met behulp van een P200 pipetteman Voeg 100 µL van 25% ECM naar het midden van de MEA verzorgen niet te raken van de elektroden en verwijderen onmiddellijk het verlaten van een dunne film op het oppervlak. Bedek de MEA en plaats in de CO2 incubator (37 ° C en 5% CO2) tot klaar om de plaat van de neuronen.</li>
	<li>Het steriliseren van de buitenste schil van een E7-ei (embryonale dag 7, gedurende 7 dagen bij 37 ° C geïncubeerd) met 70% ethanol. Decapitate het embryo in een Sylgard bodem dissectie schotel met koude steriele Henks evenwichtig zouten oplossing (HBSS) zonder calcium. Snij rond de ogen en verwijder de oogbollen. Met behulp van DuMont #5 fijne pincet en voorjaar schaar een insnijding aan de ventrale zijde maken en verwijderen van de buitenste lagen van de huid aan de reukkolf en optische tectum bloot. Schil en zorgvuldig verwijderen van het pial membraan. Breng de reukkolf in een ander petrischaal en snijd deze in kleine stukjes van ongeveer 2 mm met lente schaar. Opmerking: Er mag niet alle bloedvaten aangesloten op de reukkolf na verwijdering van het pial membraan. Indien beschikbaar, is het beter om het uitvoeren van de dissectie in een steriele dissectie kap, hoewel we redelijk goede resultaten hebben behaald wanneer dissectie wordt uitgevoerd buiten een kap, zolang de instrumenten en de dissectie gebied zijn grondig gesteriliseerd met 70% ethanol .</li>
	<li>Met behulp van een steriele overdracht precisiepipet, verzamelen de stukjes reukkolf in een centrifugebuis 15 mL en Verwijder zo veel van de HBSS mogelijk na te laten de stukken van reukkolf zinken naar de bodem van de centrifugebuis.</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 mL van 0,05% trypsine/EDTA (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Met behulp van een pipet van Pasteur, verwijder voorzichtig trypsine zonder verstoring van de stukjes weefsel en het toevoegen van 1 mL neurobasal medium. Laat de stukjes weefsel zinken naar de bodem en verwijder het medium. Deze wassing nogmaals herhalen. Deze stap is het wassen van de trypsine/EDTA.</li>
	<li>Voeg toe 2 mL van neurobasal medium en start triturating. Verpulvering omvat het nemen van een steriele brand-gepolijst Pasteur pipet en passeren van het weefsel door het meerdere malen zachtjes totdat er geen meer stukken van weefsel worden gezien. Als alle stukken na herhaalde passen blijven, laat hen te vestigen aan de onderkant. Opmerking: Vermijd schuimvorming tijdens het triturating - als schuim vormen, stoppen en door aspiratie verwijderen.</li>
	<li>Verdun het opnieuw gesuspendeerde cellen 1:10 met neurobasal medium en tellen van levensvatbare cellen met behulp van Trypan blauwe kleurstof en een hemocytometer. Mix-50 µL van de verdunde cellen met 50 µL van Trypan Blue oplossing in een centrifugebuis 0,5 mL. 10 µL toevoegen aan de hemacytometer na het plaatsen op het dekglaasje aan en Tel de heldere cellen wissen (blauwe cellen zijn dood en moeten niet worden meegeteld). Opmerking: Typische cel nummers uit één E7 optic tectum bereik tussen 1 en 5 x 10,7 cellen/mL.</li>
	<li>Plaat de gedissocieerde cellen op ECM MEAs bekleed bij een dichtheid van 2.200 cellen/plein mm. Voor onze MEA systeem vertaalt dit aan ongeveer 130.000 cellen per MEA. Toevoegen neurobasal medium om het volume in de MEA tot 1 mL en plaats van multilaterale milieu-akkoorden in de incubator CO2 's nachts voor cel gehechtheid en neurite extensie (Figuur 1). Opmerking: Voor de multilaterale milieu-akkoorden van verschillende gebieden en elektrode cijfers, andere cel dichtheden kunnen worden geprobeerd - in het algemeen, hoger celdichtheid resulteert in een groter netwerkactiviteit, maar ook leidt tot kortere woonde culturen.</li>
	<li>De volgende dag, BPA aan een eindconcentratie van 10 µM in neurobasal medium uit de voorraad van de 1 mM in stap 1.1 aangebracht in de behandelde MEA toevoegen. Toevoegen aan het besturingselement MEA, hetzelfde volume van de 10% ethanol in water (v/v) oplossing.</li>
	<li>Vervangen besteed medium met neurobasal medium dat 10 µM BPA om de andere dag tot 7 dagen in vitro (7DIV) en elke dag daarna, als de verhogingen van de netwerk-activiteit. Opmerking: Aangezien de netwerkactiviteit stijgt, verhoogt de metabole activiteit en media wijzigingen moeten vaker. Laat niet het medium oranje.</li>
</ol>3. opname van neuronale netwerkactiviteit
<ol><li>Op de dag van overname, het kweekmedium met verse neurobasal medium uit te wisselen en de MEAs terug naar de CO2 -incubator voor een minimum van 2 uur voordat u gaat opnemen. Start de opnamesoftware en stel de temperatuur van de MEA op 37 ° C door te klikken op het pictogram van de temperatuur (aanvullende figuur 3.1a-b). Opmerking: Opname kan beginnen zo vroeg als dag 3 van plating en kan blijven zolang de culturen leven zijn.</li>
	<li>De overname parameters instellen door met de rechtermuisknop op het pictogram "Muse" (onder Streams in het linker venster deelvenster) en selecteer "Add verwerking" en "Spike-Detector" en klik op OK in het pop-upvenster. "Spike Detector (6 x STD)" worden weergegeven onder de bestandsnaam (aanvullende figuur 3.2a-b).</li>
	<li>Klik met de rechtermuisknop op de Spike-Detector, selecteer vervolgens "Toevoegen verwerking" en "Barsten Detector" en klik op OK in het pop-upvenster. "Barsten Detector" (ISI) verschijnt onder het pictogram van de muze (aanvullende figuur 3.3a-b).</li>
	<li>Volgende klik met de rechtermuisknop op barsten Detector, selecteert u "Toevoegen verwerking" en "Neurale statistieken Compiler." Controleer of bestands-Header, goed statistieken samengevoegd en Synchrony zijn geselecteerd in het pop omhooggaande venster. Klik op OK. "Statistieken Compiler" verschijnt hieronder (aanvullende figuur 3.4a-b). Opmerking: Dit zal het adaptieve drempel overschrijden (6 x STD filter), het interval van de tussen piek bij 100 ms met een minimum aantal spikes op 5, het gemiddelde tarief detectie op 10 bakken instellen s met een parameter synchrony bij 20 ms, en het minimale spike tempo 0.083333 spikes per min.</li>
	<li>De geplande opname voor de opnametijd van 5 minuten (300.000 ms) instellen door te klikken op het pictogram van de klok aan de onderkant. Dit wordt bereikt door het veranderen van de informatie in de sectie van de instelling tot elke 5.1 minuten opnemen en registreert voor 5 minuten. Dit zal onmiddellijk worden gestart en één keer zal worden uitgevoerd (aanvullende figuur 3.5).</li>
	<li>Zorg ervoor dat de temperatuur van de MEA 37 ° C heeft bereikt alvorens de MEA. De MEA verwijderen uit de incubator, plaatst u deze op de opnameeenheid en de MEA vergrendelen. Start de opname van de netwerkactiviteit door te klikken op de start-record in de sectie geplande opname of het verslagpictogram in het "Bestand afspelen" venster. Een opnametijd van 5 minuten (300.000 ms) is gewoonlijk voldoende, alhoewel langer opnames van maximaal 10 minuten kunnen worden verkregen.</li>
	<li>Na de opname door de MEA te terugkomen in de incubator. Opmerking: Zorg moet worden genomen om de steriliteit en om de tijd die de MEA buiten de incubator is te minimaliseren.</li>
</ol>4. de gegevensanalyse
<ol><li>Analyse van de ruwe gegevens mogelijk off line met behulp van de opname-software. Klik op het bestand pull-down menu en open opname. Selecteer het bestand van de ruwe gegevens te analyseren. Replay de raw opnames te vangen het vereiste blancobepalingen parameters.</li>
	<li>De Spike-Detector-module gebruiken voor het verkrijgen van het gemiddelde aantal van Spikes, en voor het verkrijgen van Synchrony Index, de neurale statistieken Compiler-module gebruiken.</li>
	<li>De Spike-Detector, Burst Detector en statistieken Compiler Modules als vóór (sectie 3) geladen.</li>
	<li>De pull-down menu's binnen de Spike-Detector Detector barsten en de statistieken Compiler modulevensters, selecteer Spike lijst, de netwerklijst barsten en geavanceerde statistieken, respectievelijk.</li>
	<li>Klik op de record-knop om te beginnen het gegevensbestand die tot een CSV-bestand in de gestuurde map leiden zal opnemen. De spike parameters - het totale aantal spikes en de Synchrony Index - zal worden opgenomen in het CSV-bestand. Opmerking: real-time analyse tijdens het opnemen van onbewerkte gegevens wordt niet aanbevolen omdat dit zou kunnen processortijd en computationele middelen verbruiken.</li>
</ol>

<ol><li>Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16819149">Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis.</a> Arch. of Histol. Cytol. 69 (2), 101-107 (2006).</li>
<li>Dodds, C. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/bmb/article-abstract/11/2/131/256818/SYNTHETIC-OESTROGENS?redirectedFrom=fulltext">Synthetic oestrogens.</a> Br. Med. Bull. 11 (2), 131-134 (1955).</li>
<li>Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+estrogenic+transcriptional+activities+of+Bisphenol+A+and+Bisphenol+S%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S.</a> Toxicology In Vitro. 26 (5), 727-731 (2012).</li>
<li>Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenocarcinoma+of+the+vagina%3A+association+of+maternal+stilbestrol+therapy+with+tumor+appearance+in+young+women%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women.</a> New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).</li>
<li>Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+exposure+to+bisphenol+A+increases+dimethylbenzanthracene-induced+mammary+cancer+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Persp%22%5BJournal%5D)">Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats.</a> Environ Health Persp. 117 (6), 910-915 (2009).</li>
<li>Okada, A., Kai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estradiol-17beta+and+bisphenol+A+administered+chronically+to+mice+throughout+pregnancy+and+lactation+on+the+male+pups%27+reproductive+system%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups' reproductive system.</a> Asian J Androl. 10 (2), 271-276 (2008).</li>
<li>Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+developmental+exposure+to+bisphenol+A+on+brain+and+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice.</a> Environ. Res. 108 (2), 150-157 (2008).</li>
<li>Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364 (4), 883-888 (2007).</li>
<li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germLine+and+causes+chromosome+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities.</a> Proceedings Natl. Acad. Sci. 107 (47), 20405-20410 (2010).</li>
<li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Funct.+%3A+BBF%22%5BJournal%5D)">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27(2015).</li>
<li>Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+GermLine+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function.</a> PLOS Genetics. 12 (7), 1006223(2016).</li>
<li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Synchronous+Oscillations+in+Freely-Organized+Small+Neuronal+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits.</a> PLoS ONE. 5 (12), 14443(2010).</li>
<li>Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Oscillating+Population+Activity+in+Developing+Cortical+Networks%3A+Models+and+Experimental+Results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results.</a> J. Neurophysiol. 106 (3), 1500-1514 (2011).</li>
<li>Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Biochemical+Maturation+of+Neurones+Cultured+in+the+Absence+of+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells.</a> Nature. 281 (5730), 378-380 (1979).</li>
<li>Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuronal+Synapses+Formed+by+Motor+Neurons+Appear+to+Be+Glutamatergic%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic.</a> NeuroReport. 22 (16), 809-813 (2011).</li>
<li>Paiva, A. R. C., Park, I., Príncipe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.sci.utah.edu/~arpaiva/pubs/2010b.pdf">A Comparison of Binless Spike Train Measures.</a> Neural Comp. and Appl. 19 (3), 405-419 (2010).</li>
<li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Rat+Glioma+Growth%2C+Invasion%2C+and+Vascularization+in+a+Novel+Chick+Embryo+Brain+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li>
<li>Chiappalone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+cortical+networks+show+spontaneously+correlated+activity+patterns+during+in+vitro+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development.</a> Brain Res. 93, (2006).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+recording+on+multi-electrode+array+reveals+degraded+inhibitory+connection+in+neuronal+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development.</a> Biosens Bioelectron. 22 (7), 1538-1543 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Fasen van snelle groei en ontwikkeling zoals embryogenese zijn bijzonder kwetsbaar zijn voor de nadelige gevolgen van verschillende hormoonontregelende stoffen met inbegrip van BPA. Wij bieden gedetailleerde protocollen voor het bestuderen van de effecten van BPA blootstelling in een in vitro gewervelde neuronale netwerkmodel. Met behulp van dit protocol, vastgesteld we dat BPA het tarief van de spike evenals de synchrony index in de ontwikkelingslanden neuronale netwerken (Figuur 2a-b verlaagt).
Onze methodologie is ontworpen om te studeren BPA blootstelling tijdens de vroege embryogenese en kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van de effecten van andere EDCs. Embryonale neuronale culturen van het kuiken zijn relatief eenvoudig om vast te stellen ten opzichte van andere gewervelde modellen, met inbegrip van de rat of muis. Bovendien, er is geen vereiste voor een dierlijke logeerkamer — een eenvoudige incubator op een bankje laboratorium is voldoende voor het uitvoeren van deze tests. We beschrijven het gebruik van een systeem met meerdere elektrode (MEA) voor de beoordeling van het effect van de EDG, BPA, op netwerkactiviteit. De hier beschreven protocollen kunnen worden toegepast op andere systemen. Een kritisch aspect van dit protocol is handhaving van de steriliteit. Dit omvat van het embryo onder steriele condities dissectie — steriliseren van instrumenten met 70% ethanol en het gebruik van steriele Henks evenwichtig zouten oplossing is voldoende. Naarmate de gegevens worden verzameld over een periode van weken, is het van cruciaal belang voor het handhaven van de steriele behandeling van de multilaterale milieu-akkoorden. De neuronale culturen zodra die opgericht kunnen worden gekweekt op lange termijn - tot drie maanden — en zijn dus nuttig voor de studie van langdurige blootstelling aan EDCs en andere verbindingen over neuronale netwerken. Een ander belangrijk aspect van dit protocol is de tijd tussen dissectie beplating. De optimale tijd is 30 min, met inbegrip van de incubatie van het weefsel met trypsine. Hoe langer de tijd genomen, hoe armer het voortbestaan van de cellen.
Hier beschrijven we een basisprotocol die kan worden toegepast voor de beoordeling van de chemische stof of geneesmiddel dat is van invloed op gedrag en neurale functie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een celdichtheid van 2.200 cellen per mm2; echter, dit kan worden gewijzigd en andere cel dichtheid kunnen worden gebruikt. In het algemeen, hebben we gevonden dat celdichtheid netwerkactiviteit - meer pieken in een kortere tijd verhoogt. De methode heeft beschreven, hoewel zeer nuttig in de beoordeling van de effecten van chemicaliën op netwerkactiviteit beperkingen. Een van de grootste beperkingen van de methode is dat deze in vitro culturen zijn twee dimensionale kan niet overeen met de drie-dimensionale architectuur van de gewervelde hersenen. Dit kan worden overwonnen met behulp van segment opnames. Een ander alternatief is de behandelingen toepassen op het kuiken zich ontwikkelende embryo door betekent voor een klein venster knippen op het brede uiteinde van de ei-15, ontleden de hersenen aan het einde van het behandelingsschema, dik secties op een vibratome maken en plaatsen op de MEA voor de activiteit van de netwerken van de opname.
Ons protocol is belangrijk dat het onderzoek naar het effect van EDCs op de ontwikkeling van de netwerkactiviteit maakt en de verkenning van een mechanistische basis voor de effecten van deze chemicaliën biedt.

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, meestal aangeduid als Bisphenol-A of BPA, een anti-oxydant additief komt voor in een grote verscheidenheid van polycarbonaat en epoxy hars gebaseerd producten variërend van thermisch papier, cd's en veiligheidsmaterialen bewijs glas, aan de binnenkant coating van drank blikjes. Hoewel BPA is gekend als een endocriene ontregelen agent dat oestrogeen1nabootst, studies over zijn nadelige effecten als gevolg van dagelijkse casual blootstelling aan BPA meestal uit gekomen in de afgelopen 10 tot 15 jaar. De gevolgen van zelfs lage niveaus van BPA blootstelling zijn diepgaandste in vroege developmental perioden, waaronder tijdens de embryogenese door blootstelling van moeders2,3. In utero blootstelling van vrouwelijke embryo's aan hormoonontregelaars is ook gekoppeld aan verhoogde ziekte gevoeligheid van vaginale borst kanker4,5. Dierlijke studies hebben aangetoond dat blootstelling aan BPA leidt tot atypische hersenstructuur en functionele afwijkingen tot uiting in gedrag6. Dientengevolge heeft het gebruik van BPA in baby zuigflessen door meest regelgevende agentschappen in Europa en Noord-Amerika, met inbegrip van de FDA is verboden. Om te voldoen aan regelgeving, hebben veel fabrikanten overgestapt naar 4, 4'-sulfonyldiphenol of Bisfenol-S (BPS). Gebaseerd op het feit dat de BPA en BPS zijn structuuranalogons daarvan en dat recente rapporten vergelijkbare potentie van BPS in oestrogene transcriptie7 toonden, is het belangrijk om te bestuderen van de toxiciteit van deze samengestelde ten opzichte van BPA.
Hier beschrijven we een protocol om te testen van de effecten van BPA (en andere EDCs) op netwerken van neuronen met behulp van een gewervelde model, het kuiken embryo. In vitro culturen van neuronen synaptic contacten vormen en genereren van de actie potentieel (ook wel ' spikes ' genoemd). De blancobepalingen activiteit van deze culturen kan worden vastgelegd met behulp van meerdere elektrodenserie (MEA) systemen. Spikes worden beschouwd als in synchronie wanneer zij binnen 5 ms voor elkaar plaatsvinden. Eerste willekeurige blancobepalingen activiteit die uiteindelijk worden gesynchroniseerd, is een belangrijk kenmerk van de ontwikkeling van de neuronale netwerken8,9. Synchrony kan worden gemeten met behulp van verschillende methoden en verschillende algoritmen worden beschreven in de literatuur9,10,11. In onze analyses gebruiken we een algoritme ontwikkeld door Paiva en collega's12 die is geïntegreerd in de opname-software die de MEA-acquisitiesysteem drijft. De robuuste blancobepalingen activiteit van embryonale chick neuronen biedt een prototype voor de studie van het effect van BPA op neuraal netwerk activiteit13. Het gebruik van meerdere elektrode arrays record blancobepalingen activiteit, vastgesteld we hebben dat BPA blootstelling de ontwikkeling van neuronale blancobepalingen synchrony9,14 remt. Wij bieden hier een gedetailleerde methodologie voor het bestuderen van BPA blootstelling op kuiken embryo neuronen in cultuur samen met representatieve resultaten op de ontwikkeling van neuronale blancobepalingen synchrony in chick embryonale culturen.

<table><tbody><tr><td>#5 foreceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Axion Muse MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td>M64-GL1-30Pt200</td><td>Wordt MEA-systeem genoemd in manuscript</td></tr><tr><td>Axis Software</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>Wordt opnamesoftware genoemd in het manuscript</td></tr><tr><td>BPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239658-250g</td><td></td></tr><tr><td>curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Fertilized chicken eggs</td><td>van elke lokale boerderij of Spafas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher</td><td>&nbsp;02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Wordt Extra Cellulaire Matrix (ECM) genoemd in het manuscript</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>BrainBits</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer statistische software</td><td>Nex Technologies</td><td>Neuroexplorer versie 5</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>&nbsp;13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15514-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard bottom dissection dishes</td><td>Living Systems Instrumentaion</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue kleurstof</td><td>Fisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode arrays

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

BIB-fenolen, zoals bis-fenol A (BPA) en bis-fenol-S (BPS), zijn actinemonomeren agenten op grote schaal gebruikt in de productie van plastics en talrijke alledaagse producten. Ze worden geclassificeerd als endocriene storende stoffen (EDC) met estradiol-achtige eigenschappen. Langdurige blootstelling aan EDCs, zelfs op lage doses, is verbonden met verschillende gezondheid defecten met inbegrip van kanker, gedragsstoornissen en onvruchtbaarheid, met grotere kwetsbaarheid vroege developmental perioden. We gebruikten om te bestuderen van de effecten van BPA op de ontwikkeling van neuronale functie, een in vitro neuronale netwerk afgeleid van de vroege embryonale kuiken-hersenen als een model. We vonden dat de blootstelling aan BPA beïnvloed de ontwikkeling van de netwerkactiviteit, specifiek stekelige activiteit en synchronisatie. Een verandering in de netwerkactiviteit is de cruciale verbinding tussen het moleculaire doel van een drug of samengestelde en het effect op gedrags uitkomst. Multi elektrode matrices zijn steeds meer nuttige hulpmiddelen om te bestuderen van de effecten van drugs op netwerk activiteit in vitro. Er zijn verschillende systemen beschikbaar in de markt en, hoewel er variaties in het aantal elektroden, het type en de kwaliteit van de elektrodenserie en de software van de analyse, de onderliggende grondbeginselen, en de gegevens verkregen is hetzelfde over de verschillende systemen. Hoewel momenteel beperkt tot analyse van tweedimensionale in vitro culturen, worden deze MEA-systemen verbeterd zodat in vivo netwerkactiviteit in plakjes van de hersenen. Hier, bieden wij een gedetailleerd protocol voor embryonale blootstelling en opname van neuronale netwerkactiviteiten en synchrony, samen met representatieve resultaten.

We hebben onderzocht het effect van BPA op synchrony ontwikkeling in chick embryo neuronale culturen. Synchronisatie van stekelige activiteit is een indicator van de normale ontwikkeling van neuronale netwerken in vitro. Wanneer twee pieken binnen 5 ms van elkaar plaatsvinden, ze worden beschouwd als synchrone. In vitro neuronale culturen weergeven in eerste instantie willekeurige blancobepalingen activiteit — spikes optreden willekeurig en de intervallen tussen spike tonen een normaalverdeling. Naarmate de culturen rijpen, de blancobepalingen activiteit meer wordt gesynchroniseerd en de intervallen tussen spike zijn constant. Synchrone blancobepalingen activiteit van een cultuur was quantitated door cross-correlatie analyse van de Prikker tijden met opname software12 voor het afleiden van een Synchrony Index (SI). We vonden dat BPA blootstelling beïnvloedt in negatieve zin de ontwikkeling van de activiteiten van het netwerk verminderen blancobepalingen activiteit en de synchrony index (Figuur 2een en 2b). Kortom, hebben we aangetoond dat de nadelige effecten van BPA blootstelling op een embryo van invloed op de ontwikkeling ervan, met inbegrip van neuronale functie die kan worden beoordeeld door synchrony ontwikkeling in chick neuronen in cultuur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig1.jpg"> Figuur 1: Van het protocol van de stappen van de dissectie van chick reukkolf dissociatie, plating, en opname van de netwerkactiviteit schematische. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig2.jpg"> Figuur 2: (A) het gemiddelde aantal spikes is beduidend lager in BPA behandeld E7 chick reukkolf culturen in vergelijking met de controleculturen. Het gemiddelde aantal spikes is geëxtraheerd met behulp van de opname-software. De middelen (control, 14,890 ± 949.0, N = 15 en BPA, 5,624 ± 465.9, N = 22) aanzienlijk verschilden (ongepaarde t-test, p < 0.0001). (B) de gemiddelde synchrony index (SI) is beduidend lager in BPA behandeld E7 chick reukkolf culturen in vergelijking met de controleculturen. De SI is geëxtraheerd met behulp van de neurale statistieken Compiler module binnen de opnamesoftware. De SI-middelen (control, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 en BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) aanzienlijk verschilden (ongepaarde t-test, p < 0.0001). Foutbalken verbeelden standaarddeviatie. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Blootstelling aan milieu-toxines kan acuut ontwikkelende embryo's beïnvloeden. Hormoonontregelende chemische stoffen zoals Bisfenol is bekend dat een nadelige invloed op het zenuwstelsel. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een in vitro gewerveld dier (chick embryo) neuronale netwerkmodel te bestuderen van de functionele gevolgen van toxine blootstelling op vroege embryo's.

Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om de effecten van hormoonontregelende stoffen, zoals bisfenolen, te testen op de netwerkspiksactiviteit van neuronale netwerken van gewervelde dieren die zijn gevestigd op multi-elektrode arrays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in ontwikkelingsneurobiologie en milieutoxicologie, zoals het werkingsmechanisme van milieutoxines op de ontwikkeling van netwerkactiviteit in de embryonale hersenen. Het grote voordeel van deze techniek is dat de effecten op neuronale netwerkparameters, zoals de gemiddelde ontlaadfrequentie, het totale aantal spikes en de spikesnelheid, evenals synchronie, nu kunnen worden bestudeerd.Onze eerdere studie toonde aan dat EDC's het woord en gedrag beïnvloeden, wat een directe uitvoer van neuronale netwerken is, en ons protocol streeft nu ernaar het effect van EDC's op deze netwerken te begrijpen. Op de dag van het platen van neuronen, verwijder een flacon extracellulaire matrix uit de vriezer van min 20 graden Celsius, spuit met 70% ethanol en plaats op ijs. Zorg ervoor dat de extracellulaire matrix op ijs ontdooit.Ontdooi niet op kamertemperatuur, omdat het ECM boven nul graden Celsius polymeriseert. Werk in de BSL2-kap om de extracellulaire matrix te verdunnen tot 25% door 300 microliters koud neurobasaal medium toe te voegen aan de 100 microliters aliquot. Gebruik vervolgens een P200 pipet om 100 microliters 25% extracellulaire matrixoplossing toe te voegen aan het midden van de multi-elektrode array, zorg ervoor dat u de elektroden niet raakt.Verwijder onmiddellijk de ECM en laat een dunne film achter op het oppervlak. Bedek de multi-elektrode array en plaats deze in de weefselkweekincubator tot u klaar bent om de neuronen te plateren. Begin met het isoleren van kikenneuronen door de buitenschaal van een E7-ei te steriliseren met 70% ethanol.Het is belangrijk om vanaf nu steriele omstandigheden te handhaven. Zorg ervoor dat alle instrumenten gesteriliseerd zijn met 70% ethanol en dat de oplossingen steriel zijn. Het is handig om een dissectiekap te gebruiken, maar dit is niet absoluut noodzakelijk voor dissecties als deze snel worden uitgevoerd.Nadat het embryo is opgehaald en onthoofd, snijdt u rond de ogen en verwijdert u de oogbollen. Gebruik vervolgens Dumont nummer vijf fijne forceps en veerscharen om een incisie te maken aan de ventrale kant en verwijder de buitenste huidlagen om de voorhersenen en het optische tectum bloot te leggen. Verwijder voorzichtig het membraan.Breng de voorhersenen over in een andere petrischaal met HBSS en snijd deze in kleine stukjes van ongeveer twee millimeter met veerscharen. Gebruik een steriele transferpipet om de stukken voorhersenen over te brengen in een 15-milliliter centrifugeerbuis. Nadat de stukken voorhersenen op de bodem van de centrifugeerbuis zijn gezonken, verwijdert u zoveel mogelijk HBSS.Voeg vervolgens een milliliter voorverwarmde 0,5% trypsine EDTA toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik een Pasteurpipet om de trypsine voorzichtig te verwijderen zonder de stukken weefsel te verstoren. Voeg een milliliter neurobasaal medium toe en laat de weefselstukken naar de bodem zinken.Na het verwijderen van het medium en het herhalen van de wassing, voegt u twee milliliter neurobasaal medium toe en tritureert u voorzichtig totdat er geen weefselstukken meer zichtbaar zijn. Verdun de gesuspendeerde cellen één op tien met neurobasaal medium. Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw kleurstof en een hemocytometer.Na het tellen, plateert u de gedissocieerde cellen op ECM-gecoate, multi-elektrode arrays met een dichtheid van 2.200 cellen per vierkante millimeter. Voeg de volgende dag 10 micromolar BPA toe aan neurobasaal medium voor de behandelde, multi-elektrode arrays. Op de dag van acquisitie, vervangt u het kweekmedium door vers neurobasaal medium en plaatst u de arrays terug in de CO2-incubator gedurende minimaal twee uur voorafgaand aan het opnemen.Start de opnamesoftware en stel de temperatuur van de multi-elektrode array in op 37 graden Celsius door op het temperatuurpictogram te klikken. Stel de acquisitieparameters in door streams te selecteren in het linker vensterpaneel en rechts te klikken op het muse pictogram. Selecteer vervolgens verwerking toevoegen en spike detector en klik op OK in het pop-upvenster.Spike detector zes door STD verschijnt onder de bestandsnaam. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de spike detector, selecteer verwerking toevoegen en burst detector en klik op OK in het pop-upvenster. Burst detector ISI verschijnt onder het muse pictogram.Klik vervolgens met de rechtermuisknop op burst detector, selecteer verwerking toevoegen en neurale statistieken compiler. Zorg ervoor dat in het pop-upvenster bestandsheader, geaggregeerde welbestadistieken en synchronie zijn geselecteerd, klik op OK. De statistieken compiler verschijnt hieronder. Klik op het klokpictogram onderaan het scherm en wijzig de informatie in de instellingensectie om elke 5,1 minuten op te nemen en vijf minuten op te nemen.Dit wordt onmiddellijk gestart en wordt één keer uitgevoerd. Nadat de multi-elektrode array uit de incubator is gehaald, plaatst u deze op de opname-eenheid en vergrendelt u deze op zijn plaats. Begin met het opnemen van de netwerkactiviteit door op start opname te klikken in het geplande opnamegedeelte.Meestal is een opnametijd van vijf minuten voldoende, hoewel langere opnamen tot 10 minuten mogelijk zijn. Na het opnemen, plaatst u de multi-elektrode array terug in de incubator. Het gemiddelde aantal spikes is significant lager in BPA-behandelde E7 kiken voorhersenenculturen in vergelijking met controleculturen.De gemiddelde synchronie-index is significant lager in BPA-behandelde E7 kiken voorhersenenculturen in vergelijking met controleculturen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in minder dan drie uur worden uitgevoerd als het goed wordt gedaan. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat steriele omstandigheden altijd moeten worden gehand

assessment-effects-endocrine-disrupting-compounds-on-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol biedt de nodige informatie voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO's.

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s)

This video demonstrates a method to isolate neurons from the forebrain of an early-stage chick embryo and culture them on a microelectrode array to form a neuronal network.

Isolating and Culturing Chick Embryonic Neurons on a Multi-Electrode Array

The video demonstrates how to use a microelectrode array (MEA) to record the electrophysiological activity of neurons derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Electrophysiological activity from a multiwell MEA containing a neuron-astrocyte co-culture is recorded to detect action potentials from multiple neurons in the network, confirming the successful differentiation of hiPSCs into neurons.

Measuring the Electrophysiological Activity of Neuronal Networks Using Micro-Electrode Arrays

This video demonstrates a microelectrode array-based assay for studying neuronal network activity in mouse spinal cord sections. First, the electrophysiological activity from the superficial dorsal horn (SDH) of the slice is recorded. Then, a potassium channel inhibitor is introduced to prolong depolarization, resulting in synchronous rhythmic activity across the neuronal network.

Microelectrode Array-Based Assessment of Neuronal Networks in Mouse Spinal Cord Slices

This video demonstrates the use of multi-electrode arrays (MEA) to study the effects of toxins on early embryonic chick neuronal cultures. By monitoring the synchronous activity of the neurons in the neuronal network, the MEA captures the functional dynamics of the neuronal network in response to toxin exposure. Reduced synchrony and firing rates upon toxin exposure highlight its detrimental impact on neuronal network maturation and function.

Assessing the Effects of Toxins on Chick Embryo Neural Network Development Using Multielectrode Arrays

Verschillende elektrode coatings invloed neurale opname prestaties door veranderingen in elektrochemische, chemische en mechanische eigenschappen. Vergelijking van elektroden in vitro is relatief eenvoudig, maar vergelijken in vivo reactie wordt typisch gecompliceerd door variaties in elektrode / neuron afstand en tussen dieren. Dit artikel geeft een robuuste methode om neurale registrerende elektroden vergelijken.

Een methode voor het systematisch Elektrochemische en elektrofysiologische evaluatie van neurale registrerende elektroden

We presenteren een protocol om primaire murine spiraalvormige ganglion neuron explantaten te kweken op multi-elektrode arrays om neuronale responsprofielen te bestuderen en stimulatieparameters te optimaliseren. Dergelijke studies zijn gericht op het verbeteren van de neuron-elektrode interface van cochleaire implantaten om het gehoor bij patiënten te verbeteren evenals het energieverbruik van het apparaat.

Spiraal Ganglion Neuron Explantatie Cultuur en elektrofysiologie op Multi Electrode Arrays

Muisneuronale cellen die op multi-elektrode arrays worden gekweekt, tonen een toename van de respons na elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronen kunt cultiveren, hoe u activiteiten opneemt en hoe u een protocol kunt opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen.

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Hier gebruiken we HD-MEA om ons te verdiepen in de computationele dynamica van grootschalige neuronale ensembles, met name in hippocampussen, olfactoriusbolcircuits en menselijke neuronale netwerken. Het vastleggen van spatiotemporele activiteit, gecombineerd met computationele tools, geeft inzicht in de complexiteit van neuronale ensembles. De methode verbetert het begrip van hersenfuncties en identificeert mogelijk biomarkers en behandelingen voor neurologische aandoeningen.

Vastleggen en analyseren van multimodale grootschalige neuronale ensembledynamiek op CMOS-geïntegreerde micro-elektrode-array met hoge dichtheid

Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.

Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden

Ontdek hoe bisfenolen de neurale netwerkactiviteit van kippenembryo's beïnvloeden met multi-electrode arrays. Deze methode onthult de mechanismen waarmee hormoonontregelende stoffen de vroege hersenontwikkeling schaden.

Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays

Meer video's verkennen