Name: In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer mitofagie-detectiemethoden in menselijke cellen, C. elegans en muizen voor neurodegeneratief onderzoek. Deze technieken helpen bij het begrijpen van mitochondriale dysfunctie en het ontwikkelen van nieuwe therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Atsushi Miyawaki en Dr. Richard J. Youle voor het delen van de plasmide mt-Keima en mt-Keima geïntegreerd Hela cellen. Wij danken Raghavendra A. Shamanna en Dr Deborah L. Croteau voor de kritische lezing van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NIH (VAB), verlenen National Institute on vergrijzing, evenals een 2014-2015 en 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EVF, VAB). EVF werd gesteund door HELSE SOR-OST RHF (Project No: 2017056) en het onderzoek Raad Noorwegen (Project No: 262175).
AUTEUR BIJDRAGEN:
EVF ontworpen het manuscript en het ontwerp; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH en ED schreef verschillende secties van het papier; NT, JP, HN en VAB herziene versie van het manuscript en voorzien van deskundigheid.

<ol><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+DNA+damage+signalling+to+mitochondria+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).</li>
<li>Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+mitochondrial+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protecting the mitochondrial powerhouse.</a> Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).</li>
<li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(16)00081-2.pdf">The Mitochondrial Basis of Aging.</a> Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Shadel, G. S., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+signaling+in+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis.</a> Cell. 163 (3), 560-569 (2015).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Lazarou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+kinase+PINK1+recruits+autophagy+receptors+to+induce+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy.</a> Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).</li>
<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+Disease%3A+Cellular+and+Molecular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Fivenson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+neurodegeneration+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in neurodegeneration and aging.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+autophagy+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compromised autophagy and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).</li>
<li>Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22240478">Mechanisms of autophagosome biogenesis.</a> Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).</li>
<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+disease%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+autophagic+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of autophagic activity in mammalian cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26549682">Measuring In Vivo Mitophagy.</a> Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitophagy+in+XPA+via+PARP-1+hyperactivation+and+NAD%28%2B%29%2FSIRT1+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction.</a> Cell. 157 (4), 882-896 (2014).</li>
<li>Diot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+assay+of+mitophagy%3A+Combining+high+content+fluorescence+microscopy+and+mitochondrial+DNA+load+to+quantify+mitophagy+and+identify+novel+pharmacological+tools+against+pathogenic+heteroplasmic+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA.</a> Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).</li>
<li>Schiavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Starvation-Induced+Mitophagy+Mediates+Lifespan+Extension+upon+Mitochondrial+Stress+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans.</a> Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Sargsyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+parallel+measurements+of+macroautophagy+and+mitophagy+in+mammalian+cells+using+a+single+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor.</a> Sci Rep. 5, 12397(2015).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltun%2C+ZF+%22WormAtlas%22">WormAtlas</a>. , (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Mitophagy+Monitoring+in+Caenorhabditis+elegans+to+Determine+Mitochondrial+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Mitochondrial+Selective+Autophagy+in+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Eiyama, A., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+Mitophagy+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assays for Mitophagy in Yeast.</a> Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
</ol>

Het Bohr-laboratorium heeft CRADA regelingen met ChromaDex en GlaxoSmithKline.

Nauwkeurige meting van mitophagy is technisch veeleisend. Hier hebben wij diverse robuuste technieken waarmee beide kwalitatieve detectie van mitophagy en kwantificering van mitophagy niveaus in de meest voorkomende laboratorium experimentele modellen gepresenteerd.
Repliceerbaar om gegevens te vergaren, een experimenteel ontwerp met ten minste drie biologische herhalingen nodig is. Alle onderzoekers die betrokken zijn bij experimenten en de analyse moeten worden verblind experimentele groep i...

Mitophagy is essentieel voor mitochondriale onderhoud. Mitochondriën kruisen meerdere cel signalering van trajecten en zijn universele sub cellulaire organellen die verantwoordelijk zijn voor cellulaire energieproductie, celstofwisseling en calcium homeostase1,2,3, 4. mitochondria voortdurend ervaring uitdagingen van endogene en exogene bronnen, zoals reactieve zuurstof soorten (ROS) en toxische stoffen in het mitochondriale, respectievelijk, die leiden tot de generatie van "leeftijd" en disfunctionele mitochondriën. Accumulatie van beschadigde mitochondriën verlaagt de efficiëntie van de ATP productie terwijl het verhogen van de hoeveelheid schadelijke ROS, en is gekoppeld aan de leeftijd gerelateerde ziekten zoals metabole ziekten, AD, en PD1,5,6 . Om te voorkomen dat mitochondriën geïnduceerde cellulaire dysfunctie, cellen moeten specifiek herkennen beschadigd mitochondriën en efficiënt verwijderen hen via een cellulaire proces genoemd mitochondriale autophagy (mitophagy). Dit toonde het belang aan van mitophagy in gezondheid en ziekte illustreert de behoefte aan nauwkeurige en efficiënte methoden voor het detecteren van mitophagy zowel in vitro als in vivo.
Mitophagy is een proces van meerdere stappen waarbij veel eiwitten en eiwit complexen5,7,8. Kortom, wordt een beschadigde mitochondrion eerst herkend en opgeslokt door een dubbel-membraned phagophore, die afkomstig van het plasmamembraan, endoplasmatisch reticulum, Golgi-complex, nucleus of mitochondrion zelf9,10 zijn kan. De sferische phagophore kieuwopeningenvorm en uiteindelijk zeehonden de mitochondriën binnen, vormen de mitochondriale autophagosome (mitophagosome). De mitophagosome combineert vervolgens met het lysosoom voor afbraak, vorming van een autolysosome waarin de beschadigde mitochondrion aangetast en gerecycleerde7,8 is. Grote autophagic eiwitten ook betrokken bij mitophagy omvatten: Autophagy verwante 7 (ATG7) en Beclin1 (initiatie), Microtubule-Associated eiwit 1A/1B-Light ketting 3 (LC3-II) (LGG-1 in C. elegans) en p62 (onderdelen van phagophore), en Lysosomale-geassocieerde membraan glycoproteïne 2 (LAMP2)6,7. Daarnaast zijn er verschillende essentiële eiwitten uniek voor mitophagy, met inbegrip van PTEN-geïnduceerde putatief Kinase 1 (roze-1), Parkin1, nucleaire Dot eiwit 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 interactie eiwit 3 zoals (NIX/BNIP3L) (DCT-1 in C. elegans), o.a.5,6,11.
Een gemeenschappelijke methode voor de opsporing van wijzigingen in niveaus van autophagy is door de verhouding tussen LC3-II/LC3-I of LC3-II/actine. Deze methode is echter niet-specifieke, zoals een toename van deze verhouding kan een verhoogde initiatie of een bijzondere waardevermindering heeft ondergaan samensmelting van mitophagosome en lysosoom12weerspiegelen. Een andere methode is het evalueren van de colocalization tussen een autophagy marker (bijvoorbeeldLC3) en een mitochondriale eiwit (bijvoorbeeldTranslocase van buitenste mitochondriale membraan 20 (TOMM20, die kan worden afgebroken door Proteasomen)). Echter, dit kan alleen veranderingen in de totale mitophagy aangeven en kan geen onderscheid maken de stappen welke blokkade optreedt. Dit kan worden verduidelijkt met behulp van lysosomale remmers (bijvoorbeeld, E64d + Pepstatin A, zogenaamde EP) parallel aan de accumulatie van mitophagosomes veroorzaken. Het verschil tussen het aantal mitophagosomes op de basislijn en het aantal mitophagosomes na behandeling met EP kan duiden op mitophagy. Deze beperkingen hebben gevraagd de ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken. Met het oog op de toenemende relevantie van mitophagy in een breed spectrum van ziekten bij de mens presenteren wij verschillende robuuste mitophagy detectietechnieken die nuttig voor onderzoekers zijn kunnen. Wij dekken zowel in vitro als in vivo technieken en adviseren combineren meerdere technieken om te controleren of de wijzigingen van de mitophagy.

<table><tbody><tr><td>mt-Keima muis</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 DNA transfectiereagens</td><td>Thermofisher</td><td>#11668027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>#31985062</td><td>serumvrij medium</td></tr><tr><td>mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima</td><td>addgene</td><td>#72342</td><td></td></tr><tr><td>COXII antilichaam (muis)</td><td>abcam</td><td>#ab110258</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 antilichaam (konijn)</td><td>NOVUS</td><td>#CD107b</td><td></td></tr><tr><td>geit-anti-konijn met golflengte 568 nm van rood fluorescent eiwit (RFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25306</td><td>Alexa Fluor 568 kleurstof</td></tr><tr><td>geit-anti-muis met golflengte 488 nm van groen fluorescent eiwit (GFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25002</td><td>Alexa Fluor 488 kleurstof</td></tr><tr><td>prolong gold antifade met DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>#P36931</td><td></td></tr><tr><td>6-welplaat</td><td>SIGMA Corning Costar</td><td>#CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>4-wel kamerslide</td><td>THermofisher, Nunc Lab-Tek</td><td>#171080</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F 96-welplaat</td><td>Thermofisher</td><td>#152038</td><td></td></tr><tr><td>LC3B antilichaam konijn</td><td>NOVUS</td><td>#NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>DNA antilichaam</td><td>Progen Biotechnik</td><td>#anti-DNA muis monoklonaal, AC-30-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>#D1306</td><td>antifade montagemedium met DAPI</td></tr><tr><td>IN Cell analyzer (fluorescent lezer )</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#IN Cell analyzer 2200</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000e confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td>#TE-2000e</td><td></td></tr><tr><td>Colocalisatie software</td><td>Volocity</td><td>#Volocity 6.3</td><td>alternatief Zeiss ZEN 2012 software</td></tr><tr><td>IN Cell Investigator Software</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#28408974</td><td></td></tr><tr><td>celkweekmedium</td><td>Thermofisher</td><td>#DMEM&ndash;Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Thermofisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#12003C-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>Celkweekincubator</td><td>Thermofisher</td><td>#Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator</td><td></td></tr><tr><td>epifluorescentie microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Imager Z2</td></tr><tr><td>camera</td><td>Olympus</td><td></td><td>Olympus DP71</td></tr><tr><td>confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Observer Z1</td></tr><tr><td>confocale software</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>beeldanalyse software</td><td>Image J</td><td>colocalisatieanalyse, etc</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>statistische analyse software</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td><td></td><td>GraphPad Prism softwarepakket</td></tr><tr><td>materiaal om een wormpick te maken</td><td>Surepure Chemetals</td><td>#4655</td><td>De pick is gemaakt van 30 gauge 90% platina 10% iridium draad</td></tr><tr><td>IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]</td><td>Materiaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td>Transgene dieren houden bij 20 &deg;C</td></tr><tr><td>IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]</td><td>Materiaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 TOMM-20::Rosella</td><td>Materiaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pdct-1 DCT-1::GFP</td><td>Materiaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 DsRed::LGG-1</td><td>Materiaalonderzoek naar Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraquat oplossing</td><td>zie aanvullende gegevens voor bereiding</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>zie aanvullende gegevens voor bereiding</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M9-levamisol buffer</td><td>zie aanvullende gegevens voor bereiding</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen Microscoopplaten en Dekglasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>#B9992000</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische pincetten</td><td>STERIS Animal Health</td><td>19 Piece Canine Spay Pack Economy</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>STERIS Animal Health</td><td>19 Piece Canine Spay Pack Economy</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Thermofisher</td><td>#AM9625</td><td>10x PBS moet worden verdund tot 1x PBS met behulp van ddH2O</td></tr><tr><td>schudder</td><td>Fisher Scientific</td><td>#11-676-178</td><td>Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A</td></tr><tr><td>2% agarose pad</td><td>zie aanvullende gegevens voor bereiding</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibroslice bladen</td><td>World precision instruments</td><td>#BLADES-2</td><td>enkelzijdig mes</td></tr><tr><td>metalen plaat</td><td>MSC</td><td>#78803988</td><td>0,012 inch dik x 6 inch breed x 12 inch lang, 430 Roestvrijstalen Plaat</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>detergens</td></tr><tr><td>Methyl viologen dihydrochloride hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#856177</td><td>paraquat</td></tr><tr><td>Incubator voor nematoden</td><td>AQUALYTIC</td><td></td><td>Incubator om 20 &deg;C te handhaven</td></tr><tr><td>Dissectie stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>Voor nematoden (stap 2)</td></tr><tr><td>epifluorescentie microscoop</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager Z2</td><td>Voor nematoden (stap 2)</td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>Vilber Lourmat</td><td>BIO-LINK &ndash; BLX-E365</td><td>UV lichtbron; 356 nm</td></tr></tbody></table>

in vitro en in vivo opsporing van mitophagy in menselijke cellen, c. elegansen muizen

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondriën zijn de krachtpatsers van cellen en cellulaire energie in de vorm van ATP produceren. Mitochondriale dysfunctie bijdraagt aan biologische veroudering en een breed scala aan aandoeningen waaronder neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), metabole ziekten en voortijdige veroudering syndromen. Onderhoud van mitochondriale gezondheid hangt af van mitochondriale biogenese en de efficiënte goedkeuring van disfunctionele mitochondria via mitophagy. Experimentele methoden te nauwkeurig detecteren autophagy/mitophagy, met name in diermodellen, hebben zijn uitdagend om te ontwikkelen. Recente vooruitgang op weg naar het begrip van de moleculaire mechanismen van mitophagy heeft de ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken ingeschakeld. Hier introduceren we verschillende veelzijdige technieken voor het controleren van mitophagy in menselijke cellen, Caenorhabditis elegans (bijvoorbeeldRosella en DCT-1 / LGG-1 stammen), en muizen (mt-Keima). Een combinatie van deze mitophagy detectietechnieken, met inbegrip van cross-soorten evaluatie, zal de nauwkeurigheid van de metingen van de mitophagy verbeteren en leiden tot een beter begrip van de rol van mitophagy bij gezondheid en ziekte.

Detectie van Mitophagy in menselijke cellen:
Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, waren menselijke HeLa cellen transfected met mt-Keima plasmide. Gezonde cellen aangetoond een goed georganiseerde mitochondriale netwerk (GFP, 488 nm) met enkele gevallen van mitophagy (RFP, 561 nm). Echter cellen voorbehandeld met een mitochondriaal uncoupler FCCP (30 µM voor 3U) tentoongesteld een grote stijging in mitophagy incidenti...

Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Het algemene doel van deze experimenten is om niveaus van mitofagie in menselijke cellen, C. elegans en muizen te evalueren. Mitofagie is een zeer belangrijk concept geworden op het kruispunt van neurodegeneratie, metabole ziekten en veroudering, en inzicht in de methodologieën die hier worden gepresenteerd en toekomstig gebruik hiervan kunnen helpen bij het maken van vorderingen op dit belangrijke gebied. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het mitofagie detecteert op een robuuste en efficiënte manier en de detectie van mitofagie zowel in vitro als in vivo mogelijk maakt.Deze hier gepresenteerde techniek zal onderzoekers helpen om nieuwe inzichten te ontwikkelen en nieuwe strategieën voor therapie te ontwikkelen tegen neurogeneratieve ziekten, inclusief Alzheimer en Parkinson, waar we weten dat er een mitochondriale disfunctie is. Naast het verschaffen van inzicht in de moleculaire mechanismen van mitofagie, kunnen deze methoden leiden tot de ontdekking van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen door het screenen van mitofagie-inductoren. Visuele demonstraties van deze methoden zijn cruciaal omdat niveaus van mitofagie zeer gevoelig zijn voor veranderingen in experimentele omstandigheden in zowel C. elegans als muizen.Zaai 300.000 tot een miljoen cellen in een 35 millimeter glazen bodem microwell-schaal, 10 millimeter microwell, zodat de cellen de volgende dag 70% confluency bereiken. Bewaar de cellen in compleet celkweekmedium en incubeer ze in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag verdun 15 microliter van het DNA-transfectiereagens met 150 microliter serumvrij medium volgens het protocol van de fabrikant.Verdun ook twee tot vijf microgram van het mito-Keima plasmide DNA met 150 microliter serumvrij medium. Voeg het verdunde mito-Keima plasmide toe aan het verdunde DNA-transfectiereagens en vortex de mengsel gedurende 10 seconden. Bewaar vervolgens het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens het DNA-transfectiereagensmengsel druppelsgewijs toe aan de cellen, schud de platen zachtjes gedurende vijf tot 10 seconden om de oplossing te mengen. Plaats de cellen op dit punt terug in de incubator en incubeer ze gedurende 24 uur. De volgende dag ververs het medium naar vers compleet celkweekmedium en incubeer vervolgens de getransfecteerde cellen nog eens 24 uur.Beeld de getransfecteerde cellen af met behulp van confocale microscopie. Beeld willekeurig 20 gebieden onder 40 keer vergroting af om een totaal van 100 tot 200 cellen in elke put te documenteren. Op dag één, kies L4 larven van transgene dieren die zowel DCT-1 GFP als DSRed LGG-1 tot expressie brengen in lichaamswand spiercellen en plaats ze op een OP50 gezaaide nematode groeimediumplaat.Plaats vijf tot 10 wormen op elke 3,5 centimeter plaat met behulp van ten minste drie platen. Wanneer u klaar bent, incubeer de nematoden bij 20 graden Celsius. Vervolgens, op dag vijf, synchroniseer de nematoden door 15 tot 20 L4 transgene larven te selecteren en ze over te brengen naar verse OP50 gezaaide platen.Gebruik minimaal vijf platen voor elke experimentele conditie. Op dag zeven, bereid een aantal van de voertuigplaten voor voor mitofagie-aantastende geneesmiddelen van belang en enkele om als positieve controles te gebruiken. Vervolgens, leg E.coli gezaaide platen bloot aan UV-licht gedurende 15 minuten met een intensiteit van 222 microwatt per centimeter vierkant, om ervoor te zorgen dat de mitofagie-inducerende verbindingen op de platen niet worden gemetaboliseerd door bacteriën.Voeg nu het verbinding van belang toe in 10 microliters aan de bovenkant van de gezaaide platen en voeg een gelijkwaardige hoeveelheid verbindingsvoertuig toe aan de voertuigplaten als een negatieve controle. Voor positieve controle van mitofagie-inductie, voeg paraquat toe, een mitochondriale toxische stof. Draai voorzichtig de platen rond tot de oplossing het hele oppervlak bedekt en laat de platen drogen met de deksels gesloten, bij kamertemperatuur, gedurende ten minste één uur.Eenmaal droog, breng 10 tot 20 twee dagen oude volwassen transgene dieren over naar de platen. Incubeer ze gedurende twee dagen bij 20 graden Celsius. Op dag negen, bereid 2% agarose pads en voeg een druppel van 20 millimolair levamisol in M9 toe, per pad.Immobiliseer de transgene dieren voor beeldvorming door ze in de M9 levamisol druppel te plaatsen. Plaats vervolgens voorzichtig een dekglas op de bovenkant van de druppel. Plaats het monster op een confocale microscoopstandaard en beeld de enkele lichaamswand spiercellen af door Z-stack beelden te nemen onder 63 keer vergroting.Plaats een vers, geïsoleerd mito-Keima muizenlever op een gekoelde metalen plaat, op ijs, om het weefsel snel af te koelen. Houd het daar terwijl u het weefsel zo snel mogelijk verwerkt, omdat het signaal van het mito-Keima-eiwit tot een uur stabiel blijft op ijs. Gebruik vervolgens een paar gebogen pincetten om het levermonster op te tillen en spoel het af met vijf milliliter ijskoud PBS.Beeld uiteindelijk de weefselsecties af met behulp van confocale microscopie met twee opeenvolgende excitaties. Met behulp van de hier gepresenteerde procedure werden humane HeLa-cellen getransfecteerd met het mito-Keima plasmide. Gezonde cellen vertoonden een goed georganiseerd mitochondriaal netwerk met weinig incidenties van mitofagie.Echter, cellen die voorbehandeld waren met een mitochondriale ontkoppelaar FCCP, vertoonden een aanzienlijke toename in mitofagie-incidentie. Mitofagie werd ook gemeten met behulp van de co-lokalisatie van LAMP2 en COXII. Voor in vivo detectie van mitofagie in C. elegans, werden transgene nematoden die MT rosella tot expressie brengen in lichaamswand spiercellen behandeld met acht millimolair paraquat.Het niveau van mitofagie-inductie, aangegeven door een afname in de pH-gevoelige fluorescentie verhouding,

in-vitro-vivo-detection-mitophagy-human-cells-c-elegans

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates an in vivo assay to study mitophagy in Caenorhabditis elegans. Upon exposing the nematodes to a mitophagy-inducing drug, the occurrence of mitophagy is assessed by co-localization between DCT-1, a mitophagy receptor on the damaged mitochondria, and the autophagosomal membrane protein LGG-1.

An In Vivo Assay to Detect Mitophagy in Transgenic Nematodes

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.

Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in Drosophila Embryo's

Mitophagy, de selectieve afbraak van mitochondriën, heeft betrokken bij mitochondriale homeostase en in verschillende ziekten bij de mens is gedereguleerd. Handige experimentele methoden voor het meten van de activiteit van de mitophagy zijn echter zeer beperkt. Hier bieden we een gevoelige test voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van stroom cytometry.

Gevoelige meting van Mitophagy door Stroom Cytometry met behulp van de pH-afhankelijke fluorescerende verslaggever mt-Keima

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Het verkennen van mitofagie door middel van elektronenmicroscopie, genetische sensoren en immunofluorescentie vereist dure apparatuur, geschoold personeel en een aanzienlijke tijdsinvestering. Hier demonstreren we de werkzaamheid van een commerciële fluorescentiekleurstofkit bij het kwantificeren van het mitofagieproces in zowel Caenorhabditis elegans als een leverkankercellijn.

Detectie van mitofagie in Caenorhabditis elegans en zoogdiercellen met behulp van organel-specifieke kleurstoffen

Dit protocol schetst twee methoden voor de kwantitatieve analyse van mitofagie in pancreas-β-cellen: ten eerste een combinatie van celdoorlatende mitochondriën-specifieke kleurstoffen en ten tweede een genetisch gecodeerde mitofagie-reporter. Deze twee technieken vullen elkaar aan en kunnen worden ingezet op basis van specifieke behoeften, waardoor flexibiliteit en precisie mogelijk zijn bij het kwantitatief aanpakken van mitochondriale kwaliteitscontrole.

Complementaire benaderingen om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te ondervragen

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor het in beeld brengen van de mitochondriale morfologie in meerdere weefsels van C. elegans tijdens veroudering.

Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering

Een methode wordt beschreven voor de menselijke retinoblastoom tumoren verspreiden in muizen. Tumorcellen worden rechtstreeks geïnjecteerd in de ogen van het immuunsysteem van deficiënte muizen. Secundaire tumoren zijn met succes gebruik van beide cellen direct geoogst van menselijke tumoren en beschaafde tumorspheres.

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

We beschrijven hier hoe je multi-electrode matrix recordings van menselijke epileptische corticale weefsel uit te voeren. Epileptische weefsel resectie, slice voorbereiding en multi-electrode matrix recordings van interictale en ictal gebeurtenissen worden gedemonstreerd in detail.

Multi-electrode array Opnamen van Human Epileptische Postoperatieve Cortical Tissue

Leer mitofagie-detectiemethoden in menselijke cellen, C. elegans en muizen voor neurodegeneratief onderzoek. Deze technieken helpen bij het begrijpen van mitochondriale dysfunctie en het ontwikkelen van nieuwe therapieën.

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Meer video's verkennen