Name: Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Leer een methode voor site-specifieke glycosylering van recombinante eiwitten door cysteïne thiolen te targeten. Deze techniek evalueert efficiëntie en structurele effecten van glycosylering voor structurele biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door de natuurwetenschappen en de Engineering Research Council of Canada (05239 tot P.B.S.), de Canadese basis voor innovatie/Ontario onderzoeksfonds (aan P.B.S.), Prostate kanker bestrijden Foundation - Telus Ride voor Papa (aan P.B.S.) en Ontario Afgestudeerde beurs (aan Y.J.C. en N.S.).

Eiwit glycosylatie is een posttranslationele wijziging waar suikers covalent aan polypeptiden voornamelijk door middel van banden met aminozuur zijketens zijn gekoppeld. Maar liefst 50% van de zoogdieren eiwitten zijn geglycosyleerde 54, waar de geglycosyleerde eiwitten kunnen vervolgens hebben een breed scala aan effecten wijzigen biomoleculaire bindende affiniteit, beïnvloeden van eiwit vouwen, veranderen van kanaal activiteit, gericht op moleculen voor afbraak en mobiele handel, een paar (herzi...

Opslaan van bediende calcium (Ca2 +) post (SOCE) is de grote pad waarop immuuncellen Ca2 + van de extracellulaire ruimte in het cytosol duren. In T lymfocyten binding T-cel-receptoren gelegen op het plasma-membraan (PM) antigenen die eiwit tyrosine kinases activeren (herzien in 1,2,3). Een cascade van fosforylering leidt tot de activering van fosfolipase-γ (PLCγ) die vervolgens doorgeeft van de hydrolyse van membraan phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2) in diacylglycerol en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3 ). IP-3 is een kleine diffusible boodschapper dat aan IP-3 receptoren (IP-3R) op het endoplasmatisch reticulum (ER) waardoor deze receptor-kanaal opent en toelaat Ca2 + bindt aan de gradiënt van de concentratie van de ER stromen lumen naar het cytosol (herzien in 4). Receptor signalering van G-eiwit gekoppelde en tyrosine kinase receptoren in een verscheidenheid van andere prikkelbaar en niet-prikkelbaar cel typen lood op de dezelfde productie van IP-3 en activering van IP-3Rs.
Als gevolg van de eindige Ca2 + opslagcapaciteit van de ER, de IP-3-gemedieerde release en resulterende toename van cytosolische Ca2 + is alleen voorbijgaande; echter deze uitputting van de ER luminal Ca2 + diep gevolgen stromale interactie molecuul-1 (STIM1), een type-ik transmembraan (TM) eiwit meestal aangetroffen op de ER membraan 5,6,7. STIM1 bevat een lumen-georiënteerde Ca2 + sensing domein bestaat uit een paar van de EF-hand en steriele α-motief (EFSAM). Drie cytosolische georiënteerde spiraalsnoer-spoel domeinen zijn gescheiden van de EFSAM door de één TM domein (herzien in 8). Na ER luminal Ca2 + uitputting ondergaat EFSAM een destabilisatie-coupled oligomerisatie 7,9 waardoor structurele herschikkingen van de TM en spiraalsnoer-spoel domeinen 10. Deze structurele veranderingen uitmonden in een overlapping van STIM1 bij ER-PM kruispunten 11,12,13,14 door middel van interacties met PM-phosphoinositides 15, 16 en Orai1 subeenheden 17,18. Orai1 eiwitten zijn de PM subeenheden die aan formulier Ca2 + kanalen 19,20,21,22 monteren. De STIM1-Orai1-interacties bij ER-PM kruisingen vergemakkelijken een open Ca2 + versie geactiveerd Ca2 + (CRAC) kanaal conformatie waarmee het verkeer van Ca2 + in het cytosol door de hoge concentraties van de extracellulaire ruimte. In de immuun cellen, de aanhoudende cytosolische Ca2 + waterstand via CRAC kanalen veroorzaken de Ca2 +- Calmoduline/calcineurin afhankelijke defosforylerings van de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen, die vervolgens de kern en begint transcriptionele verordening van genen bevordering van T-cel activatie 1,3. Het proces van de CRAC kanaal activering door STIM1 23,24 via agonist-geïnduceerde ER luminal Ca2 + uitputting en de resulterende aanhoudende cytosolische Ca2 + elevatie wordt collectief SOCE 25genoemd. De vitale rol van SOCE in T-cellen is duidelijk door de onderzoeken die aantonen dat erfelijke mutaties in zowel STIM1 als Orai1 leiden strenge gecombineerde immunodeficiency syndromen 3,19,26, tot kunnen 27. EFSAM start SOCE na sensing ER-luminal Ca2 + uitputting via het verlies van Ca2 + coördinatie op de canonieke EF-hand, dat uiteindelijk leidde tot de destabilisatie-coupled zelfstandige vereniging 7, 28,29.
Glycosylatie is de covalente gehechtheid en de verwerking van oligosaccharide structuren, ook bekend als glycanen, door verschillende biosynthetic stappen in de ER en Golgi (herzien in3332, 30,). Er zijn twee dominante soorten glycosylatie in eukaryoten: N-gekoppelde en O-gekoppeld, afhankelijk van de specifieke aminozuur en Atoom het overbruggen van de koppeling. N- glycosylation, glycanen zijn bevestigd aan de kant keten amide van Asn, en in de meeste gevallen de inleiding stap vindt plaats in de ER als de polypeptide keten pakt de lumen- 34. De eerste stap van N- glycosylation is de overdracht van een veertien-suiker kern structuur bestaande uit glucose (Glc), mannose (Man) en N- acetylglucosamine (GlcNAc) (d.w.z. Glc3Man9GlcNAc2) van een ER membraan lipide door een oligosaccharyltransferase 35,36. Verdere stappen, zoals splitsing of overdracht van glucose residuen, zijn in de ER gekatalyseerd door specifieke glycosidases en glycosyltransferases. Sommige eiwitten die ER verlaten en verhuizen naar het Golgi kunnen verder verwerkte 37te zijn. O- glycosylation verwijst naar de toevoeging van glycanen, meestal aan de kant keten hydroxylgroep van Ser of Thr residuen, en deze wijziging gebeurt volledig in het Golgi-complex 33,34. Er zijn verschillende structuren van het O- glycan die kunnen worden samengesteld uit N- acetylglucosamine fucose, galactose en sialic zuur met elke monosaccharide toegevoegd sequentieel 33.
Terwijl zonder specifieke volgorde is geïdentificeerd als voorwaarde voor vele soorten O- glycosylation, een gemeenschappelijke reeks van consensus is in verband gebracht met de N-wijziging gekoppeld: Asn-X-Ser/Thr/Cys, waarbij X een aminozuur kan zijn behalve Pro 33. STIM1 EFSAM bevat twee van deze consensus N- glycosylation sites: Asn131-Trp132-Thr133 en Asn171-Thr172-Thr173. Inderdaad, vorige studies hebben aangetoond dat EFSAM N- geglycosyleerde bij zoogdiercellen op Asn131 en Asn171 38,39,40,41kan zijn. Eerdere studies van de gevolgen van de N- glycosylation op SOCE geweest elkaar echter suggereren onderdrukt, Potentiation of geen effect door deze posttranslationele wijziging op SOCE activering 38,= "xref" > 39,40,41. Onderzoek over de onderliggende biofysische, biochemische en structurele gevolgen van EFSAM N- glycosylation is dus van vitaal belang voor het begrijpen van de regelgevende gevolgen van deze wijziging. Als gevolg van de eis van hoge niveaus van homogene eiwitten in deze in vitro experimenten, werd een site-selectieve benadering hechten covalent glucose wordt aan EFSAM toegepast. Interessant, veroorzaakt Asn131 en Asn171 glycosylatie structurele veranderingen die convergeren in de kern van de EFSAM en de biofysische eigenschappen ter bevordering van STIM1-gemedieerde SOCE 42te verbeteren.
De chemische bevestiging van glycosyl groepen aan Cys thiolen geweest gevestigde door een baanbrekende werk die eerst gedemonstreerd het nut van dit enzym-vrije benadering voor het begrip van de specifieke effecten van glycosylatie op eiwit functie 43 , 44. meer recentelijk als ten aanzien van STIM1, de Asn131 en Asn171 residuen waren gemuteerd naar Cys en glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] werd gebruikt om covalent glucose te koppelen aan de gratis thiolen 42. Hier beschrijven we deze aanpak die niet alleen mutagenese gebruikt te nemen site specifieke Cys residuen voor wijziging, maar geldt ook oplossing nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie om te snel beoordelen van zowel de efficiëntie van de wijziging en de structurele verstoringen als gevolg van de glycosylatie. Met name deze algemene methodologie is gemakkelijk aan te passen aan het bestuderen van de effecten van beide O- of N- glycosylation van om het even welk recombinantly eiwit geproduceerd.

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Gebruik in stap 1.3.</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1163</td><td>Gebruik in stap 1.6.</td></tr><tr><td>DpnI Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>Gebruik in stap 1.8.</td></tr><tr><td>Presto Mini Plasmid Kit</td><td>GeneAid, Inc.</td><td>PDH300</td><td>Gebruik in stap 1.16.</td></tr><tr><td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>230280</td><td>Gebruik in stap 2.1.</td></tr><tr><td>DH5a E. coli</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>Gebruik in stap 1.9.</td></tr><tr><td>0.22 mm Syringe Filter</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>Gebruik in stap 2.3.</td></tr><tr><td>HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88221</td><td>Gebruik in stap 3.3.</td></tr><tr><td>3,500 Da MWCO Dialysis Tubing</td><td>BioDesign, Inc.</td><td>D306</td><td>Gebruik in stap 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 en 4.6.</td></tr><tr><td>Bovine Thrombin</td><td>BioPharm Laboratories, Inc.</td><td>SKU91-055</td><td>Gebruik in stap 3.9.</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td><td>Gebruik in stap 3.11.</td></tr><tr><td>Glucose-5-MTS</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td><td>G441000</td><td>Gebruik in stap 4.1.</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators</td><td>Sartorius, Inc.</td><td>VS2001</td><td>Gebruik in stap 3.11, 4.2, 4.5 en 4.6.</td></tr><tr><td>PageRuler Unstained Broad Protein Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26630</td><td>Gebruik in stap 3.7, 3.10 en 3.15</td></tr><tr><td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td><td>Gebruik in stap 3.12.</td></tr><tr><td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>29018224</td><td>Gebruik in stap 3.14.</td></tr><tr><td>600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>Gebruik in stap 5.2 en 5.5.</td></tr></tbody></table>

cysteïne thiolen richtend voor in vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromale interactie molecuul-1 (STIM1) is een type-ik transmembraan eiwit gelegen aan het endoplasmatisch reticulum (ER) en plasma membranen (PM). ER-ingezeten STIM1 regelt de activiteit van PM Orai1 kanalen in een proces dat bekend staat als bediende calcium (Ca2 +)-vermelding die is het belangrijkste Ca2 + signalering proces dat de immuunrespons drijft opslaan. STIM1 ondergaat posttranslationele N- glycosylation op twee luminal Asn sites binnen het Ca2 + sensing domein van het molecuul. Echter de biochemische, biofysische, en de biologische effecten van de structuur van N- geglycosyleerde STIM1 waren slecht begrepen totdat onlangs als gevolg van een onvermogen om gemakkelijk verkrijgen van hoge niveaus van homogene N- geglycosyleerde proteïne. Hier beschrijven we de uitvoering van een in vitro chemische aanpak die glucose wordt naar specifieke proteïne sites die van toepassing zijn hecht voor het begrip van de onderliggende effecten van N- glycosylation op eiwitstructuur en mechanisme. Met behulp van de oplossing nucleaire magnetische resonantie spectroscopie beoordelen we beide efficiëntie van de wijziging alsook de structurele gevolgen van de bijlage van de glucose met een enkelvoudige steekproef. Deze aanpak kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van de talloze geglycosyleerde eiwitten in de natuur aangetroffen.

De eerste stap van deze aanpak vereist de mutagenese van de kandidaat-glycosylation residuen Cys residuen die kunnen worden gewijzigd met behulp van de EFSAM glucose-5-MTS. heeft geen endogene Cys residuen, dus geen speciale overwegingen moeten worden gemaakt voorafgaand aan de mutagenese. Native Cys residuen moeten echter worden gemuteerd naar niet-wijzigbare residuen vóór het uitvoeren van de beschreven chemie. Om minimaal de inheemse structuur in te voeren, is het raadzaam voor het uit...

Biochemische en structurele analyses van geglycosyleerde eiwitten vereist relatief grote hoeveelheden van homogene monsters. Hier presenteren we een efficiënte chemische methode voor site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten gezuiverd van bacteriën door zich te richten van reactieve Cys thiolen.

Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Het algemene doel van deze procedure is om cysteïneresidu's in eiwitten te integreren door middel van plaatsgerichte mutagenese op van nature geglycoseerde locaties en in-vitro glucose-aanhechting en beoordelingsbenaderingen te gebruiken om de efficiëntie en structurele effecten van glycosylering te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van Structurele Biologie, zoals wat de structurele gevolgen zijn van eiwitglycosylering en hoe deze modificaties de onderliggende functionele mechanismen beïnvloeden? De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze gemakkelijk kan worden aangepast om glycosylering te bestuderen of te hanteren.Het is zeer efficiënt en zowel structuurverstoringen als efficiëntie kunnen snel worden beoordeeld. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van ziekten, omdat veranderde glycosyleringspatronen zijn geassocieerd met verschillende kankers en neurodegeneratieve stoornissen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de effecten van van nature geglycoseerde eiwitten, kan deze ook zeer nuttige informatie verschaffen over hoe het veranderen van glycosyleringspatronen kan bijdrage

targeting-cysteine-thiols-for-vitro-site-specific-glycosylation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Werkwijze voor het oplosmiddel toegankelijkheid van de thiolgroep van cysteine ​​residuen van...

Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op<em&gt; Maïs rayado fino virus</em&gt; Virus-achtige deeltjes, geproduceerd in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plants and Cross-linking van peptiden aan VLP

Bacterieel hechting aan gasthercelten is een sleutelstap tijdens gastheerkolonisatie en infectie. Dit protocol beschrijft de generatie van polymeer-gekoppelde recombinante adhesines als biomimetische materialen die analyse van de bijdrage van individuele adhesines aan deze processen mogelijk maken, onafhankelijk van andere bacteriële factoren.

Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

Dit artikel beschrijft methoden voor door de gebruiker bepaalde spinlabeling en reconstituur van pentamere ligand-gebonden kanalen voor studies met Elektronen Paramagnetische Resonantie. Dit protocol kan worden aangepast voor elk membraaneiwit. De hier beschreven reconstituurmethode kan ook worden gebruikt voor patch-clamp metingen van macroscopische en enkele-kanaalstromen in een gedefinieerd lipidensysteem.

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Dit protocol geeft de belangrijkste stappen voor de bioconjugatie van een cysteïne bevattend eiwit een maleïmide, zoals zuivering reagens, reactieomstandigheden, bioconjugaat zuivering en karakterisering bioconjugaat.

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

Hier wordt een protocol voor hoogwaardige FRET-experimenten op het molecuulniveau voorgesteld. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om drie conformatieve staten in het ligand-bindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het bepalen van precieze afstande is de eerste stap in de richting van het opbouwen van structurele modellen op basis van FRET-experimenten.

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

Genetische code uitbreiding wordt toegepast voor de introductie van een onnatuurlijk aminozuur met een biorthogonale functionele groep op een drager eiwit op een gedefinieerde site. De biorthogonale functie wordt verder gebruikt voor de plaatsselectieve koppeling van een koolhydraatantgeen om een homogeen glycoconjugaatvaccin te bieden.

Homogene Glycoconjugaat geproduceerd door gecombineerde onnatuurlijke aminozuur integratie en click-chemie voor vaccindoeleinden

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Leer een methode voor site-specifieke glycosylering van recombinante eiwitten door cysteïne thiolen te targeten. Deze techniek evalueert efficiëntie en structurele effecten van glycosylering voor structurele biologie.

Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Meer video's verkennen