Detectie van Mitochondria membraanpotentiaal CLIC4 Knockdown-geïnduceerde HN4 cel Apoptosis om te studeren In Vitro

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen in het cytobiologische veld, inclusief het begrijpen van apoptose en mitochondriaal falen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de onderzoekers gemakkelijk en op de juiste manier het real-time monitoren van het mitochondriaal membraanpotentieel via rodamine-123 in één cel kunnen uitvoeren. Kweek een HN4-cellijn van plaveiselcelcarcinoom van hoofd en nek zoals beschreven in het tekstprotocol.

Een dag voor de transfectie, plaats 0,5 miljoen cellen in twee milliliter per putje van kweekmedium zonder antibiotica in zes-putjesplaten. Verdun voorzichtig 100 picomol CLIC4 klein interfererend RNA of versplinterd klein interfererend RNA in 250 microliter verminderd serummedium. Verdun vervolgens vijf microliter liposoomreagens in 250 microliter verminderd serummedium en incubeer gedurende vijf minuten.

Combineer het verdunde kleine interfererende RNA met het verdunde liposoomreagens en meng voorzichtig. Voeg het mengsel toe aan elke put met cellen in medium. Meng voorzichtig door de plaat heen en weer te schudden.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een CO2-incubator. Vervang het medium met normaal groeimedium vier uur na transfectie. Blijf de cellen nog 20 uur incuberen voordat u doorgaat met de rodamine-123-labelingsprocedure.

Na behandeling met CLIC4 klein interfererend RNA van HN4-cellen in zes-putjesplaten, gebruik pincetten om ronde deksels op de bodem van nieuwe 12-putjesplaten te leggen. Pipet 150 microliter van 100 microgram per milliliter polylysine op het midden van elk deksel in de 12-putjesplaten. Verwijder na twee minuten het polylysine grondig door te pipetteren.

Verwijder vervolgens het kweekmedium van de HN4-cellen in de schaal en voeg een milliliter van 0,25% trypsine toe om de cellen los te maken. Voeg na zes minuten twee milliliter kweekmedium toe om de trypsine te neutraliseren. Meng de HN4-cellen voorzichtig vijf keer door te pipetteren en zaai de cellen op ronde deksels.

Plaats de cellen in een incubator bij 37 graden Celsius met 5%CO2. Voeg na acht uur incubatie twee micromol per liter rodamine-123 toe en meng het medium voorzichtig om en neer meerdere keren om een gelijkmatige verdeling in het medium te garanderen. Incubeer de HN4-cellen gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius.

Gebruik pincetten om de deksels te verwijderen en breng ze kort over in voorverwarmde NPSS-buffer om de resterende vloeistof eraf te wassen. Plaats de deksels op de bodem van de 500 microliter roestvrijstalen kamer met een vervangbaar glasdeksel van 25 millimeter dat op zijn plaats is verzegeld door een O-ring. Bevestig de deksels op hun plaats door de deksel op de kamer vast te draaien.

Voeg 450 microliter voorverwarmde NPSS-buffer toe aan de geassembleerde kamer. Plaats vervolgens het bad onder het visuele veld van de fluorescentiemicroscoop of confocale laserscanningfluorescentiemicroscoop. Zet de fluorescentiemicroscoop aan volgens de instructies van de fabrikant.

Open de beeldvormingssysteemsoftware en selecteer de nieuwe knop in de opdrachtbalk om een nieuw experiment te beginnen. Pas het visuele veld en de focus aan om de locatie van de cellen in het witte licht te vinden. Schakel vervolgens het licht uit en druk op de knop om het witte licht te sluiten.

Klik op de focusknop in de opdrachtbalk en selecteer start focussen om de fluorescentie in te schakelen. Vind de locatie van de cellen opnieuw via de microscoop met een 507 nanometer excitatie en 529 nanometer langpass emissiegolflengte. Pas het visuele veld en de focus opnieuw aan indien nodig.

Selecteer een visuele veld dat slechts 20 tot 30 gescheiden HN4-cellen bevat. Zodra een duidelijk visuele veld is bereikt, klikt u op sluiten focussen in de focusbalk. Klik vervolgens op één verwerven in de opdrachtbalk om een set afbeeldingen te verwerven.

Klik vervolgens op regio's in de opdrachtbalk en klik op de OK-knop om de meetregio's te bewerken. Om te passen op verschillende vormen van individuele cellen, selecteert u het traceringsgebiedsgereedschap. Cirkel het gebied van één enkele cel in en dubbelklik wanneer u klaar bent.

Herhaal de procedure totdat alle cellen zijn omcirkeld. Klik op klaar en selecteer afbeeldingen opslaan om de opgeslagen locatie te vinden. Klik op nul klok en druk snel op F4 om de verandering van fluorescentie-intensiteit te beginnen te monitoren.

Noteer de real-time verandering van fluorescentie-intensiteit eenmaal elke vijf seconden gedurende vijf minuten. Wanneer de baseline stabiel wordt, voegt u 50 microliter NPSS gemengd met 0,5 microliter 100 millimol per liter ATP toe aan de kamer via een pipetter. Zet de confocale laserscanningfluorescentiemicroscoop aan volgens de instructies van de fabrikant en open de gebundelde software.

Klik onder het menu verwerven op objectief om de 63X 1.4 numerieke apertuur olie objectieflens te selecteren. Observeer het specimen en vind een duidelijk visuele veld onder het lichtveld. Druk op de lichtselectieknop om over te schakelen naar de fluorescentiemodus en selecteer de juiste fluorescentiefilters om de locatie van de cel in het donker via de microscoop te vinden.

Druk op sluiter om het specimen te beschermen wanneer de observatie is voltooid. Pas onder het menu verwerven de geschikte PMT-kanaal aan en klik op bereiken om de ingestelde optische baan te activeren. Klik op het configuratiemenu en kies laser om het vereiste lasertype te bepalen.

Klik op live om real-time beelden te krijgen en zorg ervoor dat het visuele veld slechts 20 tot 30 gescheiden HN4-cellen bevat. Selecteer vervolgens XYT in de verwervingsmodus in het verwervingssubmenu onder het menu verwerven. Stel vijf seconden in voor het tijdsinterval en 20 minuten voor de duur.

Klik op toepassen wanneer alle parameters zijn ingesteld. Gebruik onder het menu kwantificeren de tool polylijn tekenen om het opnamegebied van elke cel in te cirkelen. Selecteer lijnprofiel en