Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden
7 september 2017
Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.
Het algemene doel van deze techniek is om een computationeel hulpmiddel te bieden voor het beoordelen van de ruimtelijke verdeling en signaalintensiteit van DNA-modificaties, gevisualiseerd door immunokleuring binnen kernen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van epigenetica, waardoor de onderzoeker de nucleaire lokalisatie en relatieve niveaus van DNA-modificaties in verschillende modelsystemen kan onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de DNA-modificaties worden gemeten door bot signaalgrootte en vervolgens verdeling.
Een van de implicaties van deze techniek is dat het ons begrip van potentiële functionele rijen van DNA-modificaties in verschillende biologische systemen vergemakkelijkt. Deze techniek heeft ook de toegevoegde toepassing van computationele analyse van andere epitopen die detecteerbaar zijn door immunohistochemie. Om te beginnen, opent u de LSM-geformatteerde bestanden van het confocale microscoopbeeld.
Selecteer afbeeldingsverwerking en kies vervolgens de gewenste afbeelding voor analyse. Let erop dat bij het vergelijken van intensiteitsprofielen tussen monsters, de laserkracht en versterking consistent moeten zijn om directe vergelijkingen te maken. Klik vervolgens op alles tonen, om alle grafische bedieningselementen zichtbaar te maken, selecteer vervolgens het grafiektabblad en kies de rechthoektool om een gebied te selecteren dat de kernen van belang bevat.
Gebruik vervolgens de opdracht gebied knippen om het gebied van belang te isoleren. Sla nu de afbeelding op onder een nieuwe naam en in een LSM of CZI-formaat en open het bestand opnieuw in de Zen Blue-software. Open de ZEN-desk in Zen Blue en gebruik vervolgens de opdracht naar ZEN sturen in Zen Black om het bestand in Zen Blue te openen.
Activeer vervolgens het tabblad gelabeld 2.5d om visualisatie van de afbeelding in 2.5d mogelijk te maken. Klik op alles tonen, om alle grafische bedieningselementen zichtbaar te maken en pas de instellingen aan met behulp van de vier grijze balken. De balken regelen de zoom, rotatie, askanteling en uitbreiding en samentrekking van schaalbalken.
Selecteer de weergavemodus om de individuele pieken het best te visualiseren, pas vervolgens de grote afstand aan door het percentage te wijzigen. Hoe lager het percentage, hoe duidelijker elke individuele piek. Nu, voordat u de 2.5d-afbeelding opslaat, verbergt u de bestandslijst en de grafische hulpmiddelen door op de grijze pijl onder de 2.5d-plot te klikken.
Sla vervolgens de plot op als schermafbeelding door de printscreen-toets op het toetsenbord te gebruiken. Open de optie afbeeldingsverwerking in de software en open het bestand van belang. Selecteer vervolgens het profieltabblad en selecteer het tabblad alles tonen om toegang te krijgen tot alle opmaakopties.
Vanuit het profieltabblad, kies de tabeloptie en de pijlknop. Gebruik nu de muis om een startpunt te selecteren en teken een lijn over een aaneengesloten aantal cellen waarvoor een intensiteitsplot voor de cellen langs deze lijn wordt gegenereerd, samen met de tabel met intensiteitsmetingen. Let erop dat de tabel ook de afstand geeft waarbij pixelintensiteit rood is voor de rood groene en blauwe fluorescentie.
De eenheid is microns. Om deze gegevens te exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de tabel, selecteert u tabel opslaan en slaat u deze op als tekstbestand. Om het intensiteitsprofiel op te slaan, kiest u de exportoptie, in het pop-upvenster, schakel twee opties, getagd afbeeldingsbestand, formaat en inhoud van afbeeldingsvenster, enkele paneel, gegevens.
Volg vervolgens de instructies om het bestand op te slaan. Herhaal nu dit proces voor elk nodig intensiteitsprofiel. Selecteer in de software afbeeldingsverwerking en kies het beeldbestand van belang.
Selecteer vervolgens het tabblad gelabeld coloc voor co-lokalisatieanalyse en selecteer alles tonen om toegang te krijgen tot alle opmaakopties. Kies vanuit de vier tabbladen in de onderste helft van het scherm co-lokalisatie en kies de tabel en afbeeldingopties. Kies vervolgens het derde pictogram bovenaan het tabblad, geïdentificeerd door de pop-uptekst, gesloten besier.
Gebruik dit hulpmiddel om een enkele kern te omcirkelen. Waarden verschijnen dan in de tabel en een spreidingsplot wordt geproduceerd voor rood versus groen fluorescentie. De as van deze plot is beweegbaar en dit regelt de detectiegating.
Alle pixelintensiteiten binnen de kern moeten als positieve signalen worden beschouwd. Omdat de niveaus van DNA-modificaties over de kern variëren, om zwakke signalen in rekening te brengen, gaten we de gegevens niet. We moeten hier benadrukken dat het debatbaar is of de achtergrondwaarden in de analyse moeten worden opgenomen.
Belangrijk is dat de overlappingscoëfficiënt onafhankelijk is van de verschillen in signaalintensiteiten tussen de twee kanalen. Terwijl de correlatiecoëfficiënt van Pearson een lineair verband tussen de signalen veronderstelt. Herhaal nu dit proces van het omcirkelen van kernen om de dataset te voltooien.
Vervolgens, om de gegevens te exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de tabel en volgt u de opties om de gegevens op te slaan. Om een co-lokalisatie-afbeelding op te slaan, gebruikt u de exportopdracht met de twee opties, getagd afbeeldingsbestand, formaat en inhoud van afbeeldingsvenster enkele paneel, gegevens, en volg vervolgens de opties om het bestand op te slaan. De ruimtelijke verdeling van twee geoxideerde derivaten van vijf methylcytosine werd onderzocht in differentiërende haphadique progenitoren, met behulp van het beschreven protocol.
Rode en groene signalen vertegenwoordigen de twee verschillende DNA-modificaties. De signalen zijn goed gedefinieerd met beperkte overlapping. In overeenstemming met de verwachtingen, komen de profielen van de twee signaalintensiteiten en de overeenkomstige cel niet sterk met elkaar overeen.
Het duidelijke patroon suggereert dat tap-afhankelijke oxidatie van vijf methylcytosine verschillende geoxideerde derivaten kan genereren in specifieke chromatine-regio'
Overzicht
Dit artikel presenteert een semi-kwantitatief werkproces voor het visualiseren van nieuw ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs) en hun ruimtelijke verdeling binnen kernen. De methode maakt het mogelijk om de signaalintensiteit en colocaliserende eigenschappen van DNA-modificaties te beoordelen, wat bijdraagt aan het begrip van hun functionele rollen in epigenetica.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Epigenetica
- DNA-modificaties
- Immunokleurtechnieken
Achtergrond
- 5-methylcytosine en zijn geoxideerde derivaten spelen cruciale rollen in gen-regulatie.
- Het begrijpen van hun ruimtelijke verdeling kan inzichten opleveren in hun functionele implicaties.
- Bestaande methoden kunnen deze modificaties mogelijk niet adequaat visualiseren.
- Deze studie introduceert een computationeel hulpmiddel om visualisatie en analyse te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het beoordelen van de ruimtelijke verdeling van DNA-modificaties.
- Om de signaalintensiteit en colocaliserende eigenschappen van verschillende geoxideerde derivaten te analyseren.
- Om het begrip van de functionele rollen van deze modificaties in biologische systemen te bevorderen.
Gebruikte methoden
- Immunokleur van DNA-modificaties in kernen.
- Confocale microscopie voor beeldacquisitie.
- Beeldverwerking met behulp van Zen Blue-software voor visualisatie.
- Co-localisatie-analyse van signaalniveaus.
Belangrijkste resultaten
- Er werden verschillende ruimtelijke patronen van geoxideerde derivaten waargenomen in verschillende celtypen.
- Co-localisatie-analyse onthulde significante veranderingen tijdens differentiatie.
- Kwantificering toonde verschillen in signaalniveaus tussen cellijnen.
- De methode toonde potentieel voor bredere toepassingen in epigenetisch onderzoek.
Conclusies
- De ontwikkelde werkwijze verbetert de visualisatie van DNA-modificaties.
- De bevindingen suggereren verschillende functionele rollen voor verschillende geoxideerde derivaten.
- Deze techniek kan worden toegepast op verschillende biologische contexten voor diepere inzichten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the spatial distribution and signal intensity of DNA modifications in nuclear contexts, supporting mechanistic de-risking in epigenetic target validation. By providing computational analysis of immunostained confocal images, it enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding the localization of novel epigenetic marks informs therapeutic hypothesis interrogation. The workflow supports cross-functional collaboration through standardized, reproducible quantitative outputs that can be applied across diverse model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing tissue- and developmental stage-specific occurrence of DNA modifications in vertebrates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of signal intensity and distribution patterns in nuclei.
- Predictive Value: Contributes to portfolio triage by providing data on the localization of oxidized derivatives of 5-methylcytosine that may play specific roles in cellular processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating 2.5D signal intensity plots and intensity profiles for multiple cells.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent laser power and gain settings during microscopy, enabling direct comparisons between samples.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by demonstrating applicability to other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through examination of signal colocalization changes during differentiation in hiPSCs and pediatric brain tumor cell lines.
- Risk-Adjusted Advancement: Describes how quantification of signal levels in Daoy medulloblastoma and BXD ependymoma cells supports decision-making in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by showing how distinct spatial patterns of oxidized derivatives may reflect tap-dependent oxidation in specific chromatin regions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing quantitative imaging data that supports hypothesis testing and pathway clarification in epigenetics research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing through spatial distribution analysis of DNA modifications visualized by immunostaining.
- Screening: Describes assay readiness via signal intensity profiles and table exports that enable quantitative comparison of staining intensity across cells.
- Analytics: Highlights colocalization coefficients and scatter plots that help teams compare conditions and assess relationships between different DNA modifications.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through analysis of signal changes during differentiation in stem cell and tumor models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability by noting its added application to computational analysis of other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through assessment of nuclear localization and relative levels of DNA modifications.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via consistent imaging settings and exportable data tables for cross-group comparison.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of DNA modification levels in different experimental groups, such as undifferentiated vs. differentiated hiPSCs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantification of signal differences between cell lines, such as lower signals in BXD vs. Daoy cells.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy and immunostaining for DNA modifications.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include Zen Blue software for 2.5D visualization, profile analysis, and colocalization tools.
- Cross-team standardization requirements involve maintaining consistent laser power and gain when comparing intensity profiles between samples.
- Adaptation considerations across model systems are supported by the method’s application in differentiating haphadic progenitors, Daoy medulloblastoma, BXD ependymoma, and hiPSCs.
- Practical limitations include the need to avoid overexposure and inspect scanning areas for air bubbles or insufficient immersion that can cause local fluorescence loss.
