Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden
7 september 2017
Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.
Het algemene doel van deze techniek is om een computationeel hulpmiddel te bieden voor het beoordelen van de ruimtelijke verdeling en signaalintensiteit van DNA-modificaties, gevisualiseerd door immunokleuring binnen kernen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van epigenetica, waardoor de onderzoeker de nucleaire lokalisatie en relatieve niveaus van DNA-modificaties in verschillende modelsystemen kan onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de DNA-modificaties worden gemeten door bot signaalgrootte en vervolgens verdeling.
Een van de implicaties van deze techniek is dat het ons begrip van potentiële functionele rijen van DNA-modificaties in verschillende biologische systemen vergemakkelijkt. Deze techniek heeft ook de toegevoegde toepassing van computationele analyse van andere epitopen die detecteerbaar zijn door immunohistochemie. Om te beginnen, opent u de LSM-geformatteerde bestanden van het confocale microscoopbeeld.
Selecteer afbeeldingsverwerking en kies vervolgens de gewenste afbeelding voor analyse. Let erop dat bij het vergelijken van intensiteitsprofielen tussen monsters, de laserkracht en versterking consistent moeten zijn om directe vergelijkingen te maken. Klik vervolgens op alles tonen, om alle grafische bedieningselementen zichtbaar te maken, selecteer vervolgens het grafiektabblad en kies de rechthoektool om een gebied te selecteren dat de kernen van belang bevat.
Gebruik vervolgens de opdracht gebied knippen om het gebied van belang te isoleren. Sla nu de afbeelding op onder een nieuwe naam en in een LSM of CZI-formaat en open het bestand opnieuw in de Zen Blue-software. Open de ZEN-desk in Zen Blue en gebruik vervolgens de opdracht naar ZEN sturen in Zen Black om het bestand in Zen Blue te openen.
Activeer vervolgens het tabblad gelabeld 2.5d om visualisatie van de afbeelding in 2.5d mogelijk te maken. Klik op alles tonen, om alle grafische bedieningselementen zichtbaar te maken en pas de instellingen aan met behulp van de vier grijze balken. De balken regelen de zoom, rotatie, askanteling en uitbreiding en samentrekking van schaalbalken.
Selecteer de weergavemodus om de individuele pieken het best te visualiseren, pas vervolgens de grote afstand aan door het percentage te wijzigen. Hoe lager het percentage, hoe duidelijker elke individuele piek. Nu, voordat u de 2.5d-afbeelding opslaat, verbergt u de bestandslijst en de grafische hulpmiddelen door op de grijze pijl onder de 2.5d-plot te klikken.
Sla vervolgens de plot op als schermafbeelding door de printscreen-toets op het toetsenbord te gebruiken. Open de optie afbeeldingsverwerking in de software en open het bestand van belang. Selecteer vervolgens het profieltabblad en selecteer het tabblad alles tonen om toegang te krijgen tot alle opmaakopties.
Vanuit het profieltabblad, kies de tabeloptie en de pijlknop. Gebruik nu de muis om een startpunt te selecteren en teken een lijn over een aaneengesloten aantal cellen waarvoor een intensiteitsplot voor de cellen langs deze lijn wordt gegenereerd, samen met de tabel met intensiteitsmetingen. Let erop dat de tabel ook de afstand geeft waarbij pixelintensiteit rood is voor de rood groene en blauwe fluorescentie.
De eenheid is microns. Om deze gegevens te exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de tabel, selecteert u tabel opslaan en slaat u deze op als tekstbestand. Om het intensiteitsprofiel op te slaan, kiest u de exportoptie, in het pop-upvenster, schakel twee opties, getagd afbeeldingsbestand, formaat en inhoud van afbeeldingsvenster, enkele paneel, gegevens.
Volg vervolgens de instructies om het bestand op te slaan. Herhaal nu dit proces voor elk nodig intensiteitsprofiel. Selecteer in de software afbeeldingsverwerking en kies het beeldbestand van belang.
Selecteer vervolgens het tabblad gelabeld coloc voor co-lokalisatieanalyse en selecteer alles tonen om toegang te krijgen tot alle opmaakopties. Kies vanuit de vier tabbladen in de onderste helft van het scherm co-lokalisatie en kies de tabel en afbeeldingopties. Kies vervolgens het derde pictogram bovenaan het tabblad, geïdentificeerd door de pop-uptekst, gesloten besier.
Gebruik dit hulpmiddel om een enkele kern te omcirkelen. Waarden verschijnen dan in de tabel en een spreidingsplot wordt geproduceerd voor rood versus groen fluorescentie. De as van deze plot is beweegbaar en dit regelt de detectiegating.
Alle pixelintensiteiten binnen de kern moeten als positieve signalen worden beschouwd. Omdat de niveaus van DNA-modificaties over de kern variëren, om zwakke signalen in rekening te brengen, gaten we de gegevens niet. We moeten hier benadrukken dat het debatbaar is of de achtergrondwaarden in de analyse moeten worden opgenomen.
Belangrijk is dat de overlappingscoëfficiënt onafhankelijk is van de verschillen in signaalintensiteiten tussen de twee kanalen. Terwijl de correlatiecoëfficiënt van Pearson een lineair verband tussen de signalen veronderstelt. Herhaal nu dit proces van het omcirkelen van kernen om de dataset te voltooien.
Vervolgens, om de gegevens te exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de tabel en volgt u de opties om de gegevens op te slaan. Om een co-lokalisatie-afbeelding op te slaan, gebruikt u de exportopdracht met de twee opties, getagd afbeeldingsbestand, formaat en inhoud van afbeeldingsvenster enkele paneel, gegevens, en volg vervolgens de opties om het bestand op te slaan. De ruimtelijke verdeling van twee geoxideerde derivaten van vijf methylcytosine werd onderzocht in differentiërende haphadique progenitoren, met behulp van het beschreven protocol.
Rode en groene signalen vertegenwoordigen de twee verschillende DNA-modificaties. De signalen zijn goed gedefinieerd met beperkte overlapping. In overeenstemming met de verwachtingen, komen de profielen van de twee signaalintensiteiten en de overeenkomstige cel niet sterk met elkaar overeen.
Het duidelijke patroon suggereert dat tap-afhankelijke oxidatie van vijf methylcytosine verschillende geoxideerde derivaten kan genereren in specifieke chromatine-regio'
Overzicht
Dit artikel presenteert een semi-kwantitatieve workflow voor het visualiseren van onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs) en hun ruimtelijke distributie binnen celkernen. De methode maakt het mogelijk om de signaalintensiteit en colokalisatie van DNA-modificaties te beoordelen, wat bijdraagt aan het begrip van hun functionele rollen in de epigenetica.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Epigenetica
- DNA-modificaties
- Immunokleuringstechnieken
Achtergrond
- 5-methylcytosine en de geoxideerde derivaten ervan spelen een cruciale rol bij de genregulatie.
- Inzicht in hun ruimtelijke distributie kan aanwijzingen geven over hun functionele implicaties.
- Bestaande methoden kunnen deze modificaties mogelijk onvoldoende visualiseren.
- Deze studie introduceert een computationele tool om de visualisatie en analyse te verbeteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het beoordelen van de ruimtelijke distributie van DNA-modificaties.
- Het analyseren van de signaalintensiteit en colocalisatie van verschillende geoxideerde derivaten.
- Het faciliteren van het begrip van de functionele rollen van deze modificaties in biologische systemen.
Gebruikte methoden
- Immunokleuring van DNA-modificaties in kernen.
- Confocale microscopie voor beeldacquisitie.
- Beeldbewerking met Zen Blue-software voor visualisatie.
- Co-lokalisatieanalyse van signaalintensiteiten.
Belangrijkste resultaten
- Er werden verschillende ruimtelijke patronen van geoxideerde derivaten waargenomen in diverse celtypen.
- Co-lokalisatieanalyse onthulde significante veranderingen tijdens de differentiatie.
- Kwantificering toonde verschillen in signaalniveaus tussen de cellijnen aan.
- De methode demonstreerde potentieel voor bredere toepassingen binnen epigenetisch onderzoek.
Conclusies
- De ontwikkelde workflow verbetert de visualisatie van DNA-modificaties.
- De bevindingen suggereren verschillende functionele rollen voor diverse geoxideerde derivaten.
- Deze techniek kan worden toegepast in diverse biologische contexten voor diepere inzichten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode stelt biopharma R&D-teams in staat om de ruimtelijke distributie en signaalintensiteit van DNA-modificaties in nucleaire contexten kwantitatief te beoordelen, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie bij de validatie van epigenetische targets. Door computationele analyse van immuungekleurde confocale beelden te bieden, wordt het voorspellend vertrouwen vergroot in vroege discovery-fasen, waar inzicht in de lokalisatie van nieuwe epigenetische markeringen de toetsing van therapeutische hypothesen ondersteunt. De workflow faciliteert crossfunctionele samenwerking door gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve resultaten die kunnen worden toegepast op diverse modelsystemen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de visualisatie van weefsel- en ontwikkelingsstadiumspecifieke aanwezigheid van DNA-modificaties bij vertebraten.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door kwantitatieve meting van signaalintensiteit en distributiepatronen in celkernen.
- Voorspellende waarde: Draagt bij aan portefeuilletriage door het verstrekken van gegevens over de lokalisatie van geoxideerde derivaten van 5-methylcytosine die specifieke rollen kunnen spelen in cellulaire processen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door het genereren van 2.5D signaalintensiteitsplots en intensiteitsprofielen voor meerdere cellen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via consistente laservermogens en gain-instellingen tijdens microscopie, wat directe vergelijkingen tussen monsters mogelijk maakt.
- Screening-gereedheid: Benadrukt schaalbaarheid en hergebruik van het platform door de toepasbaarheid aan te tonen voor andere epitopen die detecteerbaar zijn via immunohistochemie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Bespreekt de relevantie voor ziekten door onderzoek naar veranderingen in signaalcolocalisatie tijdens differentiatie in hiPSC's en pediatrische hersentumorcellijnen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Beschrijft hoe de kwantificering van signaalniveaus in Daoy-medulloblastoom- en BXD-ependymoomcellen de besluitvorming bij preklinische validatie ondersteunt.
- Mechanistische risicovermindering: Richt zich op de voorspellende waarde door aan te tonen hoe verschillende ruimtelijke patronen van geoxideerde derivaten tap-afhankelijke oxidatie in specifieke chromatinegebieden kunnen weerspiegelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie door kwantitatieve beelddata te leveren die hypothesetesten en pathway-verduidelijking in epigenetisch onderzoek ondersteunen.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing ondersteunt door middel van ruimtelijke distributieanalyse van DNA-modificaties gevisualiseerd door immunokleuring.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via signaalintensiteitsprofielen en tabelexports die een kwantitatieve vergelijking van de kleuringsintensiteit tussen cellen mogelijk maken.
- Analytics: Benadrukt colocalisatiecoëfficiënten en scatterplots die teams helpen om condities te vergelijken en relaties tussen verschillende DNA-modificaties te beoordelen.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door analyse van signaalveranderingen tijdens differentiatie in stamcel- en tumormodellen.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit door de aanvullende toepassing voor computationele analyse van andere epitopen te vermelden die detecteerbaar zijn via immunohistochemie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in target-validatie door beoordeling van nucleaire lokalisatie en relatieve niveaus van DNA-modificaties.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via consistente beeldinstellingen en exporteerbare datatabellen voor vergelijking tussen groepen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het mogelijk maken van evaluatie van DNA-modificatieniveaus in verschillende experimentele groepen, zoals ongedifferentieerde versus gedifferentieerde hiPSCs.
- Portfolio-impact: Risico-gecorrigeerde prioritering door kwantificering van signaalverschillen tussen cellijnen, zoals lagere signalen in BXD versus Daoy-cellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in confocale microscopie en immunokleuring voor DNA-modificaties.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten Zen Blue-software voor 2,5D-visualisatie, profielanalyse en colocalisatie-tools.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams omvatten het handhaven van consistente lasersterkte en gain bij het vergelijken van intensiteitsprofielen tussen monsters.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen worden ondersteund door de toepassing van de methode bij differentiërende haphadic-progenitoren, Daoy-medulloblastoom, BXD-ependymoom en hiPSCs.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak om overbelichting te voorkomen en scangebieden te controleren op luchtbellen of onvoldoende immersie, wat kan leiden tot lokaal fluorescentieverlies.
