Name: Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Ontdek een computationele workflow voor de analyse van DNA-modificaties met immunokleuring en confocale microscopie. Deze methode beoordeelt signaalintensiteit en colocalisatie in kernen voor epigenetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het werk werd gesteund door de biotechnologie en biologische Sciences Research Council [BB/N005759/1 tot en met A.R.]. NRFH werd gefinancierd door The Rosetrees Trust en The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. De Zeiss Elyra PS.1-Microscoop, de verwerking computers en software werden gefinancierd door BB/L013827/1 van de BBSRC (multidisciplinair Super resolutie microscopie Facility op de Universiteit van Nottingham subsidie)

1. generatie van Confocal beelden <ol><li>In de voorbereiding voor de analyse van gemodificeerde vorm van cytosine, uitgevoerd door immunohistochemische kleuring zoals beschreven door Abakir et al. 34.</li> <li>uit beeldvorming van dia's uit te voeren met behulp van een microscoop en bestanden opslaan in een indeling van LSM. 
	Opmerking: Wanneer het vergelijken van intensiteit profielen tussen monsters de waarden gebruikt voor laser macht en gewin voor elk kanaal moet worden gehouden over de hele afbeelding procedure te voorzien in rechtstreekse vergelijking in het stadium van de analyse beeld nemen.</li>
</ol> 2. Generatie 2.5D intensiteit percelen <ol><li>de software (zoals Zen zwart) Open en selecteer &#39; Image Processing &#39;.</li>
	<li>Ga naar het menu bestand en selecteer openen. Selecteer de afbeelding die verwerking vereist.</li>
	<li>Klik op &#39; Toon alle &#39; onder de afbeelding alle grafische besturingselementen om zichtbaar te maken. In de onderste helft van het scherm zijn er drie tabbladen; &#39; Afmetingen &#39;, &#39; Display &#39; en &#39; Graphics &#39;, selecteert u de &#39; Graphics &#39; tab.
	<ol><li>Kies de &#39; rechthoek &#39; hulpmiddel om te Selecteer kernen/interessegebied.</li>
		<li>Selecteer &#39; gesneden regio &#39; bijsnijden van de afbeelding. Hierdoor genereert u een nieuwe afbeelding voor de bijgesneden regio in een afzonderlijke tab.</li>
		<li>Ga naar het menu bestand en selecteer Save As. Geef het bestand een naam en sla het op als een bestand LSM of CZI.</li>
	</ol></li> <li>Open software (bijvoorbeeld blauwe Zen) en selecteer de &#39; Zen Desk &#39;.</li>
	<li>Verzenden de bijgesneden afbeelding van Zen zwart blauwe Zen door het bestand te selecteren en te klikken op het menu bestand en selecteer Verzend naar Zen 2012-blauw editie. De bijgesneden afbeelding wordt geopend in het desbetreffende programma. 
	Opmerking: Het afbeeldingsbestand wordt overgebracht omdat de 2.5D intensiteit perceel functie in Zen zwart 2012 meerdere afbeeldingen van het kanaal niet gelijktijdig toont.</li>
	<li>Aan de linker kant van de afbeelding Kies het tabblad geëtiketteerd &#39; 2.5D &#39;, hierdoor visualisatie van de afbeelding in 2.5 D. Klik op &#39; alles weergeven &#39; zichtbaar te maken alle grafische besturingselementen.</li>
	Alter visualisatie instellingen met behulp van vier grijze bars gelegen links en onder de afbeelding <li>. 
	Opmerking: linkerhand bar, de top van het scherm = zoom. Linkerhand bar, onderin het scherm = beurt afbeelding op as. Onderkant van scherm, linkerhand bar = rotatie van beeld. Onderkant van scherm, goede hand bar = uitbreiden en contract schaal bars.</li>
	<li>Zorgen dat rendermodus geselecteerd is oppervlak als dit de beste visualisatie van de individuele pieken geeft.</li>
	<li>Raster afstand veranderen door het veranderen van het percentage, hoe lager het percentage gedefinieerd hoe meer elke individuele piek.</li>
	<li>Om op te slaan van het 2.5D beeld, eerst de bestandenlijst op de rechterkant en de grafische hulpmiddelen onder de afbeelding verbergen door te klikken op de grijze pijl onder het perceel 2.5D (naast &#39; Toon alle &#39;), dit zal het verbergen van de grafische tabbladen, waardoor het beeld uit te breiden om te vullen de scree n. om op te slaan de 2.5D plot, druk op de &#39; PrtSc &#39; toets op het toetsenbord. Dit zal een schermafbeelding van het scherm. Plak de afbeelding in Microsoft Paint en bijsnijden van de afbeelding voordat u opslaat.</li>
</ol> 3. Intensiteit Profiling <ol><li>Open van de software (zoals Zen zwart) en selecteer Image Processing.</li>
	<li>Ga naar het menu bestand en selecteer openen. Selecteer de afbeelding die verwerking vereist.</li>
	<li>Zoals de afbeelding wordt weergegeven op het scherm, aan de linker kant van de afbeelding selecteert u het tabblad geëtiketteerd &#39; profiel &#39;.</li>
	<li>In de onderste helft van het scherm Selecteer (tik) de &#39; alles weergeven &#39; tabblad. Hierdoor kan de toegang tot alle opmaakopties.</li>
	<li>In de onderste helft van het scherm zijn er drie tabbladen; &#39; afmetingen &#39;, &#39; Display &#39; en &#39; ProfileƆ Selecteer &#39; profiel &#39; en selecteer (tik) de &#39; tabel &#39; vak. Selecteer de &#39; pijl &#39; knop.</li>
	<li>Op de afbeelding met de muis te selecteren een beginpunt en sleep de muis over een continu aantal cellen. Laat de muisknop los om het produceren van een complot van de intensiteit van de cellen langs de lijn; Bovendien zal de tabel worden bevolkt door intensiteit meetgegevens voor de pixels langs de lijn voor elke golflengte. 
	Opmerking: De tabel geeft de afstand (µm) op welke pixel intensiteit wordt gelezen voor de rode, groene en blauwe fluorescentie.</li>
	<li>Dit om gegevens te exporteren, klik met de rechtermuisknop op de tabel, selecteer &#39; opslaan tabel &#8230; &#39; en opslaan naar een juiste locatie als een txt-bestand.</li>
	<li>Om op te slaan van de geselecteerde intensiteit profielafbeelding selecteert u het menu bestand en selecteer &#39; exporteren &#8230; &#39;. Kies in het pop-upvenster &#39; Tagged Image File (formaat) &#39; en &#39; inhoud van afbeeldingsvenster - één venster (Data) &#39; gevolgd door te klikken op &#39; Selecteer de bestandsnaam van het en sla &#8230; &#39; Kies een geschikte locatie en klik op &#39; opslaan &#39;.</li>
	<li>Het proces herhalen voor elke individuele intensiteit profiel afhankelijk van het aantal profielen te analyseren en gezichtsvelden.</li>
	<li>Import intensiteit gegevens opgeslagen (zie 3.7) profielen en analyseren in een werkblad gevolgd door statistische analyse.</li>
</ol> 4. Co lokalisatie analyse <ol><li>Open de software en selecteer &#39; beeldverwerking &#39;.</li>
	<li>Ga naar het menu bestand en selecteer openen. Selecteer de afbeelding die verwerking vereist.</li>
	<li>Zoals de afbeelding wordt weergegeven op het scherm, aan de linker kant van de afbeelding selecteert u het tabblad geëtiketteerd &#39; Coloc &#39;.</li>
	<li>In de onderste helft van het scherm Selecteer (tik) de &#39; alles weergeven &#39; tabblad. Hierdoor kan de toegang tot alle opmaakopties.</li>
	<li>In de onderste helft van het scherm er zijn vier tabbladen; &#39; afmetingen &#39;, &#39; Display &#39;, &#39; grafische &#39; en &#39; ColocalizationƆ Selecteer &#39; Colocalization &#39; en vink het vakje voor &#39; tabel &#39; en &#39; Image &#39;.
	<li>Selecteer het derde pictogram langs aan de bovenkant van deze tab (nauwe Bezier tekst wordt weergegeven wanneer de muis zich boven het hulpmiddel) gebruik dan dit hulpmiddel te omsingelen van een enkele kernen, waarden voor deze kernen zal dan verschijnen in de tabel <ol>. 
		Opmerking: Voor elke omringde kernen een scatterplot wordt geproduceerd voor rood versus groene fluorescentie die wordt weergegeven in het deelvenster van de linkerhand op het scherm. De as wordt vervolgens verplaatst om de poort uit cellen afhankelijk van de drempel. Zoals de kernen van belang zijn handmatig geselecteerd in de beelden, is de gating drempels boven het nulpunt aanpassen niet vereist. Alle pixelwaarden intensiteit waargenomen binnen de nucleaire grenzen worden beschouwd als positief signaal.</li>
	</ol></li> <li>Herhaal dit proces door het derde pictogram te selecteren in het tabblad en latere kernen rondom totdat de dataset is voltooid.</li>
	<li>Dit om gegevens te exporteren, klik met de rechtermuisknop op de tabel, selecteer Opslaan tabel en sla op een passende locatie.</li>
	<li>Om op te slaan van het colocalization beeld, selecteer het menu bestand en selecteer &#39; exporteren &#8230; &#39; Kies vervolgens; Tagged Image File (Format) en &#39; inhoud van het venster van de afbeelding &#8211; enkel vliegtuig (Data) &#39; gevolgd door te klikken op &#39; Selecteer de bestandsnaam van het en sla &#8230; &#39;, kies een geschikte locatie en klik op &#39; opslaan &#39;.</li>
	<li>Colocalization gegevens in een werkblad gevolgd door statistische analyse uitzetten.</li>
</ol>

<ol><li>Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+II.+The+symmetry+of+methylated+sites+supports+semi-conservative+copying+of+the+methylation+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern.</a> J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).</li>
<li>Youssoufian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+haemophilia+A+give+evidence+for+CpG+mutation+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots.</a> Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).</li>
<li>Holliday, R., Pugh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+modification+mechanisms+and+gene+activity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Monograph+Series%22%5BJournal%5D)">DNA modification mechanisms and gene activity during development.</a> Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).</li>
<li>Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+hypomethylation+of+DNA+and+expression+of+globin+genes+in+Friend+erythroleukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells.</a> European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).</li>
<li>Bird, A. P., Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+I.+The+methylation+pattern+in+ribosomal+DNA+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis.</a> J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).</li>
<li>Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-operation+and+communication+between+the+human+maintenance+and+de+novo+DNA+%28cytosine-5%29+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases.</a> EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).</li>
<li>Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+de+novo+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dissecting de novo methylation.</a> Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).</li>
<li>Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Eckhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+of+human+chromosomes+6%2C+20+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22.</a> Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).</li>
<li>Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+loading%2C+but+not+de+novo+methylation%2C+is+an+oocyte-autonomous+process+stimulated+by+SCF+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling.</a> Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).</li>
<li>Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeting+sequence+directs+DNA+methyltransferase+to+sites+of+DNA+replication+in+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei.</a> Cell. 71 (5), 865-873 (1992).</li>
<li>Jones, P. A., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+differentiation%2C+cytidine+analogs+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation.</a> Cell. 20 (1), 85-93 (1980).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNA+methylation%3A+DNA+Methylation+in+Early+mammalian+Development%22">DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development</a>. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).</li>
<li>Chalitchagorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+pattern+of+LINE-1+methylation+level+in+normal+tissues+and+the+association+with+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis.</a> Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).</li>
<li>Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+and+Dnmt1+functionally+cooperate+during+de+novo+methylation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA.</a> Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+and+sequence+specificity+of+a+eukaryotic+DNA+methylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase.</a> Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).</li>
<li>Dean, W., Santos, F., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+early+mammalian+development+and+following+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology+%28Elsevier%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer.</a> Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).</li>
<li>Wu, S. C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+DNA+demethylation%3A+many+roads+lead+to+Rome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Active DNA demethylation: many roads lead to Rome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+can+be+a+stable+DNA+modification+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals.</a> Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+is+a+predominantly+stable+DNA+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification.</a> Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).</li>
<li>Lurlaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+reveals+a+tissue-specific+role+for+5-formylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine.</a> Genome Biol. 17 (1), 141(2016).</li>
<li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributive+Processing+by+the+Iron+%28II%29%2F%CE%B1-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).</li>
<li>He, Y. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR%3A+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li>
<li>Nagae, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+demethylation+in+CpG-poor+promoters+during+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation.</a> Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+ES+cells+and+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation.</a> Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).</li>
<li>Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+DNA+6mA+methylation+during+early+embryogenesis+of+zebrafish+and+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Wu, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027282">DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PloS one. 5 (12), e15367(2010).</li>
<li>Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-2754-8_8">Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue</a>. , Springer. 125-137 (2016).</li>
<li>Alioui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Carboxylcytosine+is+localized+to+euchromatic+regions+in+the+nuclei+of+follicular+cells+in+axolotl+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary.</a> Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).</li>
<li>Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+two+forms+of+DNA+methylation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Diversity of two forms of DNA methylation in the brain.</a> Front Genet. 5, 46(2014).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).</li>
<li>Lachmanovich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+analysis+of+complex+formation+among+membrane+proteins+by+computerized+fluorescence+microscopy%3A+application+to+immunofluorescence+co-patching+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies.</a> J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).</li>
</ol>

Geen potentiële belangenconflicten werden bekendgemaakt.

Dit protocol beschrijft de stapsgewijze proces van het genereren van visuele representaties van DNA wijzigingen binnen kernen. Hoewel gevoelige en impactful, beschikken deze technieken een aantal beperkingen.
Het is noodzakelijk om te benadrukken dat de gegevens die zijn gegenereerd op basis van 2.5D percelen, signaal intensiteit profielen en colocalization analyse zijn semi-kwantitatieve in de natuur. Als gevolg van de punt voor punt verlichting van het monster tijdens Beeldacquisitie op de laser confocal microscoop scannen, worden absolute signaal intensiteit van elk kanaal geregistreerd. Echter, dit zijn geen absolute grootheden van 5hmC en 5caC wordt gedetecteerd en enige vertegenwoordigen aanwijzingen voor de aanwezigheid, afwezigheid of de omvang van deze epigenetische merken.
Het repetitieve karakter van signaal amplifications verwarren beperkingen consistent met de omvang van machines toegepast ter verbetering van het signaal onvermijdelijk benaderingen waar fysieke genomic exploitatievorm van deze merken34. De ware genomic lokalisatie van deze merken kan worden verborgen door deze omvangrijke eiwitten, die fysiek gebieden unresolvable zelfs bij optimale resolutie van de confocal grenzen van 200-300 nm34 bezetten. Bovendien, de intensiteit van het signaal van de afzonderlijke kanalen voor elk merk niet te vergelijken met elkaar als gevolg van verschillen in de gevoeligheid van het antilichaam en fluorophore vervoeging34. Echter werpt de informatie verkregen met beeldvorming licht op de organisatie van de ruimtelijke en temporele van de genomic merken.
Voor nauwkeurige kwantificatie van 5hmC en 5caC signalen, zijn kernen gemarkeerd en omringd tegen de DAPI counterstain, duidelijk afbakening van de regio te worden geanalyseerd. Deze procedure opleidingscyclus met de eis voor het kalibreren van gating drempels zoals achtergrondgeluiden wordt genegeerd door het handmatige proces van het selecteren van de kernen1. Een automatisering van dit proces kan worden bereikt in de meest recente software die het mogelijk voor nucleaire segmentatie maakt moet worden uitgevoerd. Terwijl gratis alternatieve softwarepakketten zoals FIJI zijn beschikbaar voor de analyse van de colocalization, nadelen zoals de eis om afbeeldingen te converteren naar binaire 8 bit formaten, afbeeldingen maskeren en invoeren van uitsluiting groottegegevens Schakel regio's van belang limiet de gebruiker-toegankelijkheid van dit programma. Bovendien, introduceert gezien dat de algemene niveaus van 5hmC en 5caC in het genoom in combinatie met hun overheersende locatie op euchromatique gebieden en uitputting van genomic CpG sequenties in het algemeen beperkt, handmatige rondom van kernen gebruiker-bias. Daarom de markering van de kernen automatisch wordt ervan uitgegaan dat alle gebeurtenissen binnen het afgebakende gebied als positief en negeert elke achtergrondpixels die aanwezig kunnen zijn. Dus, analyseren van afbeeldingen op basis van de pixel intensiteit mogelijk meer betekenis. Deze factoren zijn belangrijk bij het overwegen van het gebruik van Mander van colocalization coëfficiënt te analyseren van de mate van ruimtelijke overlapping tussen twee signalen, ongeacht hun signaal intensiteit als zich te verzetten tegen de Pearson-correlatiecoëfficiënt die wordt verondersteld een lineaire relatie tussen signalen.
Over het geheel genomen dragen de hier beschreven technieken het thema van de visuele representatie van biologische gegevens in een intuïtieve indeling. Terwijl de semi-kwantitatieve beeldanalyse krachtige technieken zoals Spectrometrie van de massa in termen van gevoeligheid of enkele basis resolutie genoom kan niet vervangen breed sequencing, biedt aanvullende gegevens waardoor gevolgtrekkingen en hypothesen te zijn uit analyse van beelden met precisie bedacht.

Methylation van DNA, een goed gedocumenteerde mechanisme geassocieerd met een transcriptionele verordening leidt tot wijziging van cytosine residuen in een 5'-cytosine-fosfaat-guanine-3' (CpG) dinucleotide verband via de toevoeging van een methylgroep (-CH3) aan op de 5 - koolstofatoom van de cytosine pyrimidine ring te vormen 5-methylcytosine (5mC)1. Bij zoogdieren, zijn ongeveer 70% van de CpGs die slechts 1% van hun genoom vormt, aangezien zij zijn uitgeput van deze palindromische sequentie als gevolg van 5mC mutagene neiging om spontaan deaminate aan thymine2gemethyleerd. Aanwezigheid van de methylgroepen op gensequenties promotor weergeven sterke correlatie met transcriptionele repressie in gewervelde dieren3,4,5. Toevoeging van deze methylgroepen wordt gekatalyseerd door zeer geconserveerde DNA methyltransferase (DNMT) enzymen DNMT3a 3b en 3 L en DNMT1 die respectievelijk wijzigen van apr cytosines in DOVO en onderhoud methylering contexten6. DNMT3A/B expressie is verhoogd tijdens de ontwikkeling in embryonale stamcellen en epiblast; echter zijn verminderde expressie wordt waargenomen na pluripotente cel lineage inzet voor somatische lot tijdens differentiatie8. Terwijl het delen van functionele redundantie, display DNMT3a en 3b weefsel-specifieke expressiepatronen, met 3a gedetecteerd gelijkmatig in muis embryo's maar 3b voornamelijk gelokaliseerd op neuroectoderm en chorionic ectoderm weefsels8.
Methylation handtekeningen kunnen worden overgenomen tijdens de mitose en meiose10. Methylation van onderhoud omvat DNMT1 vergemakkelijkt wijziging van CpG cytosine residuen bestaande in hemi-gemethyleerd Palindromen op double-stranded DNA11. DNMT1 bindt DNA replicatie vorken11 en bijgevolg genomic methylering piek tijdens de S-fase van de celcyclus12niveaus. DNMT1 methyleert ongewijzigde cytosines daardoor onderscheiden van nieuw gesynthetiseerd DNA-strengen, bevordering van x-chromosoom inactivering en onderhouden van transcriptionele repressie profielen13. Door middel van erkenning van de hemi-gemethyleerd opeenvolgingen van DNA CpG houdt DNMT1 gevestigde patronen van methylering afgebakend door DOVO methylering bv onderdrukking van lange afgewisseld nucleaire Element 1 (lijn1) de initiatiefnemers van het retrotransposon voor de remming van haar potentieel kankerverwekkend propagatie14. Hoewel bezitten hemi-gemethyleerd DNA preferentiële bindende affiniteit, kunt DNMT1 unmethylated CpG eiland (CGI) sequenties in DNMT3a/b - / - mutantcellen, methylate vervullen een noodsituatie DOVO methylering rol15 . Dus als gevolg van de semi-conservatieve aard van DNA replicatie16, kan onderhoud methylering getrouw recapituleren methylering handtekeningen van bovenliggende dochtercel17.
Echter voor gen moet expressie als dynamisch gemoduleerde, repressieve methylering wijziging worden gewist, die kan worden bereikt door passieve en actieve demethylatie mechanismen18. De tien-elf Translocase (TET) eiwitten die behoren tot een geconserveerde familie van dioxygenase eiwitten zijn geschikt voor iteratieve oxidatie van methylgroepen op apr residuen19. Deze Tet eiwitten, homoloog aan J-Base bindende proteïnen (JBP) ontdekt in de bruceii van de trypanosoom, erkennen en binden van gemodificeerd DNA onderstellen van bijvoorbeeld 5mC en deze residuen 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-formylcytosine (5 fC) en 5 - zuurstof carboxylcytosine (5caC)20. Tet eiwitten vergemakkelijkt oxidatie van 5mC leidt tot verandering van de stapsgewijze conformatie van methyl naar hydroxyl-, carbonyl- en carboxylaat-configuraties, maar 5fC en 5caC wijzigingen kunnen gesynthetiseerd worden rechtstreeks vanuit 5mC oxidatie21, 22 , 23 , 24.
Informatieve indicatie van TET eiwitten activiteit inzicht in hun verordening bestudeert de distributie en de overvloed van oxi-methyl-cytosine merken. Belangrijke 5mC aanwezigheid op apr arme initiatiefnemers is aantoonbaar in tegenstelling tot de unmethylated apr rijke regio's, de laatste is kenmerkend voor apr25eilanden. Over weefsels, hoogste weefsel specifieke methylering wordt waargenomen in de hersenen, testis en bloed terwijl mondelinge mucosa vertonen grootste hypomethylation, geeft een patroon van de differentiële methylering plaatsvinden op weefsel specifieke initiatiefnemers26.
Door gebruik te maken van gevoelige anti-5mC en anti-5hmC antilichamen in selectieve methyl/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP), en de daaropvolgende hoge doorvoer sequencing, Ficz et al. aangetoond hoog 5hmC bezetting op initiatiefnemers, exons en lijn-1 retrotransposon sequenties die gecorreleerd met verminderde 5mC niveaus op deze locaties in muis embryonale stengelgroenten cellen27. Omgekeerd, werd grootste 5mC verrijking waargenomen op repetitieve satelliet sequenties waar 5hmC aanwezigheid was beperkt28. Studies uitgevoerd op menselijke frontale kwab hersenweefsel onthullen veelbetekenend 5hmC verrijking, vier keer hoger dan in muis embryonale stamcellen28. In overeenstemming met eerdere opmerkingen, hoge doorvoer sequentiebepaling van frontale kwab weefsel geïllustreerd meerderheid 55-59% van 5hmC signaal gelokaliseerd op lage dichtheid CpG promotor regio's, 35-38% binnen gene organen en ongeveer 6% bezetting op intergenic regio's. Daarentegen 5mC werd verrijkt bij intergenic regio's (25-26%) en hoger in gen organen (52-55%) maar minder (22-24%) bij promotor29sequenties. Deze studies tonen aan dat overvloed van 5hmC in embryonale stamcellen en somatische weefsel, vooral de hersenen, maar onderzoeken op 5fC en 5caC distributies beperkt zijn.
Interessant is dat onlangs ontdekt in eukaryoten, methylering van adenine residuen op de positie 6 stikstof (N-6) (6mA) display een genomic overvloed profile inverse aan die van 5mC30. Observaties van de Spectrometrie van de massa van de tandem vloeistofchromatografie gekoppeld onthullen 6mA absolute niveaus bestaan in overmaat in zebravis en varkens vroege embryo's in vergelijking met sperma met haar niveaus (0.003% van genomische adenines) gestaag op bevruchting, piek stadium de morula ontwikkelingsstoornissen (33 vouw hoger dan sperma) en het bereiken van de somatische niveaus steady-state 0.004% van genomische adenines31. Immunoprecipitation van DNA-sequenties 6mA verrijkt heeft aangetoond overheersende bezetting (ongeveer 80% verrijking) van dit merk op repetitieve element Regio'sen transcriptionele start sites32. Deze observaties contextualiseren en valideren van de ontdekking van 6mA demethylase-null ede cellen van de stam mbryonic exposeren geaccumuleerde 6mA gemedieerde lijn-1 retrotransposon tot zwijgen brengen t.o.v. transcriptionally actieve elementen in wildtype cellen. Deze gegevens stellen voor een transcriptionele regelgevingstaak voor 6mA33.
Terwijl geconjugeerd biochemische labels gekoppeld aan latere DIP testen geven aan- of afwezigheid van geoxideerde methylcytosine derivaten (oxi-mCs), kunnen niet zij geven ruimtelijke verdeling of kwantificeerbare informatie van deze merken34, 35. een protocol voor gevoelige immunochemical detectie van 5hmC en 5caC was onlangs ontwikkelde36. Deze methode van geconjugeerd fluorophore secundair antilichaam gebaseerde immunokleuring gekoppeld met behulp van scanning laser confocal microscopie bezit het unieke voordeel dat visuele lokalisatie van deze DNA-wijzigingen binnen de cellen, dus nadruk op individuele positief dan wel negatief gekleurd cellen die overeenkomt met de heterogene aanwezigheid van deze merken. De 5hmC en 5caC absolute signaal intensiteit zoals versterkt door de geconjugeerde antilichamen in staat stellen semi-kwantitatieve interpretaties worden voorgesteld over de omvang en de standpunten van deze merken binnen de kern bijvoorbeeld hétérochromatique en euchromatique regio 's 37 , 38. hier een techniek voor de computationele analyse van beelden van de confocal microscopie wordt beschreven. De generatie van 2.5D ruimtelijke verdeling percelen voor het weergeven van verschillende 5hmC en 5caC signaal pieken per pixel en hun locaties binnen kernen wordt gedemonstreerd. Histogram percelen van 5hmC en 5caC signaal intensiteit profielen kunnen illustreren trends in overvloed van deze merken als de toppen en troggen zijn uitgezet als afzonderlijke niet-overlappende kanalen. Tot slot, door de uitvoering van de colocalization-functie, de mate van de nabijheid van een signaal naar de andere kan worden bepaald en als gevolg hiervan, hun respectieve genomic coördinaten kunnen worden geïdentificeerd.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Elyra PS1. Superresolutiemicroscoop uitgerust met LSM780 confocale kop</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Black 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

immunokleuring voor dna wijzigingen: computationele analyse van confocal beelden

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Voor decennia, is 5-methylcytosine (5mC) als de enige wijziging van het DNA met een functionele betekenis in metazoans gedacht. De ontdekking van enzymatische oxidatie van 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) alsmede opsporing van N6-methyladenine (6mA) in het DNA van meercellige organismen verstrekt extra graden van complexiteit aan de epigenetische onderzoek. Volgens een groeiend lichaam van experimenteel bewijs, kunnen deze nieuwe DNA-wijzigingen specifieke rollen spelen in verschillende cellulaire en ontwikkelingsbiologie processen. Nog belangrijker is, zoals sommige van deze merken (e. g. 5hmC, 5fC en 5caC) tentoonstelling weefsel- en ontwikkelings fase-specifieke voorval in gewervelde dieren, vertegenwoordigt Immunochemie een belangrijk instrument waardoor beoordeling van ruimtelijke verdeling van DNA wijzigingen in verschillende biologische contexten. De methoden voor computationele analyse van DNA wijzigingen gevisualiseerd door immunokleuring gevolgd door confocale microscopie worden hier beschreven. In het bijzonder de generatie van 2,5 dimensie (2.5 D) signaal intensiteit percelen, signaal intensiteit profielen, kwantificering van de kleuring van de intensiteit in meerdere cellen en bepaling van signaal colocalization coëfficiënten worden weergegeven. Deze technieken mogelijk collectief, operationele bij de beoordeling van de niveaus en de lokalisatie van deze DNA-wijzigingen in de kern, die bijdragen tot het ophelderen van hun biologische rol in metazoans.

Om te bepalen van de ruimtelijke verdeling van 5hmC en 5caC in het onderscheiden van hepatische progenitoren immunostained dia's voor deze DNA-wijzigingen werden beeld met behulp van een microscoop.
Eerste analyse van de ruimtelijke spreiding van deze oxi-mCs werd uitgevoerd door middel van de generatie van 2.5D intensiteit percelen (figuur 1A, 1B). De rode en groene pieken bleek goed gedefinieerd met de beperkte aanwezigheid van Oranje pieken die slechts een kleine overlapping van de signalen van de 5caC en de 5hmC aangeeft. In overleg met deze resultaten samenvallen de profielen voor 5hmC en 5caC intensiteiten in de corresponderende cel niet sterk met elkaar (Figuur 1 c). Dit illustreert dat 5caC en 5hmC verschillende patronen van nucleaire distributie in hepatische progenitoren suggereren dat Tet-afhankelijke oxidatie van 5mC leidt tot generatie van verschillende geoxideerd derivaten van deze DNA-wijziging in specifieke chromatine vertonen regio's.
Om te vergelijken de niveaus van 5caC en 5hmC in Daoy medulloblastoom en BXD-1425EPN Ependymoom cellen, werd immunokleuring voor deze oxi-mCs uitgevoerd op beide monsters onder dezelfde proefomstandigheden. Intensiteiten van 5caC en 5hmC signalen werden vervolgens vergeleken in 20 profielen gegenereerd over 3-5 cellen opgenomen voor elke regel van de cel (figuur 2A-2D). De kwantificering van de resultaten bleek dat BXD-1425EPN cellen aanzienlijk lagere niveaus van zowel 5hmC als 5caC immunokleuring ten opzichte van Daoy cellen (figuur 2D vertonen).
Gezien de twee kanalen rood (5hmC) en groen (5caC) die kan worden aangeduid als de R- en G respectievelijk van de Pearson correlatiecoëfficiënt (PCC) beschrijft de mate van overlapping van de ruimtelijke en co segregatie van R &#38; G uitgaande van beide merken bestaan in een lineaire relatie met elkaar, aangeduid door R statistiek34. Kwadratuur van de PCC-waarde, aangeduid door R2 maakt het meten van groene signaal intensiteit variatie die wordt beïnvloed door rood signaal intensiteit34. Dit is overbodig voor onze 5caC vs 5hmC co lokalisatie analyse.
Om te onderzoeken de ruimtelijke verdeling van 5caC en 5hmC in ongedifferentieerde (Undiff) hiPSCs en hepatische endoderm 24 uur (HE24) na inductie, werd colocalization analyse van deze DNA-wijzigingen uitgevoerd op dezelfde confocal afbeeldingen, met R-waarden voor 20 kernen geanalyseerd voor elke regel van de cel (figuur 3A-3 C).
De kwantificering van deze resultaten aangetoond dat de mate van colocalization beduidend hoger is (P &#60; 0.05) in HE24 in vergelijking met Undiff (Figuur 3 c). Dit is te wijten aan de beperkte omvang van 5caC aanwezigheid en dus zijn beperkte signaalsterkte in Undiff cellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig1.jpg"> 
Figuur 1: immunohistochemische kleuring van hepatische endoderm voorlopercellen tijdens 72 uur post inductie van differentiatie. (A) is mede van kleuring van 5hmC (rood), 5caC (groen) en DAPI nucleaire teller vlek (blauw). De witte onderbroken pijl 'B' duidt de richting van de profilering bemonsterd door de kern, geïllustreerd in 1 C. Schaal staaf vertegenwoordigt 5 µm. rode kanaal: 800 krijgen, laser van 1%. Groene kanaal: 750 krijgen, laser 2,4%. DAPI kanaal: 750 krijgen, laser van 2,6%. (B) 2.5 D intensiteit plot van 5hmC, 5caC en DAPI signalen. Individuele pieken vertegenwoordigen absolute signaal intensiteiten voor elke pixel. Samengevoegde weergaven en afzonderlijke kanalen worden weergegeven. (C) de profielen van de intensiteit van de 5hmC, de 5caC en de DAPI signalen in hepatische progenitoren tijdens 72 uur post inductie van differentiatie. Piek intensiteit werden geregistreerd langs de afmetingen van de witte onderbroken pijl 'B' en langs de x-as van intensiteit profiel worden aangeduid met een zwarte onderbroken pijl. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig2.jpg"> 
Figuur 2: analyse van 5hmC en 5caC signaal intensiteit in Daoy medulloblastoom en BXD-1425EPN Ependymoom cellijnen. (A) immunefluorescentie kleuring van 5hmC (rood) en 5caC (groen) in Daoy en BXD-1425EPN cellen. Beelden werden gemaakt met 63 x olie-immersie objectief, zowel op dezelfde instellingen. Samengevoegde weergaven en afzonderlijke kanalen worden weergegeven. Schaal staven 10 µm. rode kanaal: 746 krijgen, laser van 1%. Groene kanaal: 750 krijgen, laser 2,4%. Individuele Daoy (B) en (C) BXD-1425EPN cellen zijn in aangrenzende cijfers uitgebreid. Schaal bars voor (B) en (C) vertegenwoordigen 5 µm. (D) gemiddelde fluorescentie intensiteit van 5hmC vs 5caC signalen in Daoy en BXD-1425EPN cellen (n = 20, SD). Betekenis werd beoordeeld met behulp van een F-toets en Two-sample t-test sterretjes duiden statistisch significant p-waarden van ** als p &#60; 0.01 en *** als p &#60; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig3.jpg"> 
Figuur 3: analyse van de Colocalization van 5hmC en 5caC absolute signalen in ongedifferentieerde hiPSCs (Undiff) ten opzichte van hepatische endoderm 24 uur na gedifferentieerde voorlopercellen (HE24). Confocale microscopie beelden van (A) gedifferentieerdeproductie hiPSCs en (B) HE24 cellen gekleurd voor 5hmC (rood), 5caC (groen) en DAPI (blauw). Cellen werden beeld met 63 X olie onderdompeling lens op identieke instellingen. 20 omringde kernen illustreren de cellen bemonsterd voor analyse van de colocalization. Schaal staven 20 µm. rode kanaal: 800 krijgen, laser van 1%. Groene kanaal: 750 krijgen, laser 2,4%. DAPI kanaal: 750 krijgen, laser van 2,6%. (C) Colocalization analyse van de aanwezigheid van 5caC signaal binnen het bereik van de nabijheid van de 5hmC in undiff en HE24 (n = 20, SD). Betekenis werd beoordeeld met behulp van een F-toets en Two-sample t-test sterretjes duiden statistisch significant p-waarden van * p &#60; 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Het algemene doel van deze techniek is om een computationeel hulpmiddel te bieden voor het beoordelen van de ruimtelijke verdeling en signaalintensiteit van DNA-modificaties, gevisualiseerd door immunokleuring binnen kernen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van epigenetica, waardoor de onderzoeker de nucleaire lokalisatie en relatieve niveaus van DNA-modificaties in verschillende modelsystemen kan onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de DNA-modificaties worden gemeten door bot signaalgrootte en vervolgens verdeling.Een van de implicaties van deze techniek is dat het ons begrip van potentiële functionele rijen van DNA-modificaties in verschillende biologische systemen vergemakkelijkt. Deze techniek heeft ook de toegevoegde toepassing van computationele analyse van andere epitopen die detecteerbaar zijn door immunohistochemie. Om te beginnen, opent u de LSM-geformatteerde bestanden van het confocale microscoopbeeld.Selecteer afbeeldingsverwerking en kies vervolgens de gewenste afbeelding voor analyse. Let erop dat bij het vergelijken van intensiteitsprofielen tussen monsters, de laserkracht en versterking consistent moeten zijn om directe vergelijkingen te maken. Klik vervolgens op alles tonen, om alle grafische bedieningselementen zichtbaar te maken, selecteer vervolgens het grafiektabblad en kies de rechthoektool om een gebied te selecteren dat de kernen van belang bevat.Gebruik vervolgens de opdracht gebied knippen om het gebied van belang te isoleren. Sla nu de afbeelding op onder een nieuwe naam en in een LSM of CZI-formaat en open het bestand opnieuw in de Zen Blue-software. Open de ZEN-desk in Zen Blue en gebruik vervolgens de opdracht naar ZEN sturen in Zen Black om het bestand in Zen Blue te openen.Activeer vervolgens het tabblad gelabeld 2.5d om visualisatie van de afbeelding in 2.5d mogelijk te maken. Klik op alles tonen, om alle grafische bedieningselementen zichtbaar te maken en pas de instellingen aan met behulp van de vier grijze balken. De balken regelen de zoom, rotatie, askanteling en uitbreiding en samentrekking van schaalbalken.Selecteer de weergavemodus om de individuele pieken het best te visualiseren, pas vervolgens de grote afstand aan door het percentage te wijzigen. Hoe lager het percentage, hoe duidelijker elke individuele piek. Nu, voordat u de 2.5d-afbeelding opslaat, verbergt u de bestandslijst en de grafische hulpmiddelen door op de grijze pijl onder de 2.5d-plot te klikken.Sla vervolgens de plot op als schermafbeelding door de printscreen-toets op het toetsenbord te gebruiken. Open de optie afbeeldingsverwerking in de software en open het bestand van belang. Selecteer vervolgens het profieltabblad en selecteer het tabblad alles tonen om toegang te krijgen tot alle opmaakopties.Vanuit het profieltabblad, kies de tabeloptie en de pijlknop. Gebruik nu de muis om een startpunt te selecteren en teken een lijn over een aaneengesloten aantal cellen waarvoor een intensiteitsplot voor de cellen langs deze lijn wordt gegenereerd, samen met de tabel met intensiteitsmetingen. Let erop dat de tabel ook de afstand geeft waarbij pixelintensiteit rood is voor de rood groene en blauwe fluorescentie.De eenheid is microns. Om deze gegevens te exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de tabel, selecteert u tabel opslaan en slaat u deze op als tekstbestand. Om het intensiteitsprofiel op te slaan, kiest u de exportoptie, in het pop-upvenster, schakel twee opties, getagd afbeeldingsbestand, formaat en inhoud van afbeeldingsvenster, enkele paneel, gegevens.Volg vervolgens de instructies om het bestand op te slaan. Herhaal nu dit proces voor elk nodig intensiteitsprofiel. Selecteer in de software afbeeldingsverwerking en kies het beeldbestand van belang.Selecteer vervolgens het tabblad gelabeld coloc voor co-lokalisatieanalyse en selecteer alles tonen om toegang te krijgen tot alle opmaakopties. Kies vanuit de vier tabbladen in de onderste helft van het scherm co-lokalisatie en kies de tabel en afbeeldingopties. Kies vervolgens het derde pictogram bovenaan het tabblad, geïdentificeerd door de pop-uptekst, gesloten besier.Gebruik dit hulpmiddel om een enkele kern te omcirkelen. Waarden verschijnen dan in de tabel en een spreidingsplot wordt geproduceerd voor rood versus groen fluorescentie. De as van deze plot is beweegbaar en dit regelt de detectiegating.Alle pixelintensiteiten binnen de kern moeten als positieve signalen worden beschouwd. Omdat de niveaus van DNA-modificaties over de kern variëren, om zwakke signalen in rekening te brengen, gaten we de gegevens niet. We moeten hier benadrukken dat het debatbaar is of de achtergrondwaarden in de analyse moeten worden opgenomen.Belangrijk is dat de overlappingscoëfficiënt onafhankelijk is van de verschillen in signaalintensiteiten tussen de twee kanalen. Terwijl de correlatiecoëfficiënt van Pearson een lineair verband tussen de signalen veronderstelt. Herhaal nu dit proces van het omcirkelen van kernen om de dataset te voltooien.Vervolgens, om de gegevens te exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de tabel en volgt u de opties om de gegevens op te slaan. Om een co-lokalisatie-afbeelding op te slaan, gebruikt u de exportopdracht met de twee opties, getagd afbeeldingsbestand, formaat en inhoud van afbeeldingsvenster enkele paneel, gegevens, en volg vervolgens de opties om het bestand op te slaan. De ruimtelijke verdeling van twee geoxideerde derivaten van vijf methylcytosine werd onderzocht in differentiërende haphadique progenitoren, met behulp van het beschreven protocol.Rode en groene signalen vertegenwoordigen de twee verschillende DNA-modificaties. De signalen zijn goed gedefinieerd met beperkte overlapping. In overeenstemming met de verwachtingen, komen de profielen van de twee signaalintensiteiten en de overeenkomstige cel niet sterk met elkaar overeen.Het duidelijke patroon suggereert dat tap-afhankelijke oxidatie van vijf methylcytosine verschillende geoxideerde derivaten kan genereren in specifieke chromatine-regio'

immunostaining-for-dna-modifications-computational-analysis-confocal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).

Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het evalueren van DNA-schadehersteleiwitten in van patiënten afgeleide eierstokkankerorganoïden. Hier zijn uitgebreide plating- en kleuringsmethoden opgenomen, evenals gedetailleerde, objectieve kwantificeringsprocedures.

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Het handhaven van de integriteit van het oöcytengenoom is noodzakelijk om de genetische getrouwheid in het resulterende embryo te waarborgen. Hier presenteren we een nauwkeurig protocol voor het detecteren van DNA-dubbelstrengsbreuken in vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren.

Detectie van DNA-dubbelstrengsbreuken in eicellen van muizen

Deze methode beschrijft een immunofluorescentieprotocol en kwantificeringspijplijn voor het evalueren van eiwitdistributie met gevarieerde nucleaire organisatiepatronen in menselijke T-lymfocyten. Dit protocol biedt stapsgewijze begeleiding, beginnend bij de monstervoorbereiding en doorlopend door de uitvoering van semi-geautomatiseerde analyse in Fiji, eindigend met gegevensverwerking door een Google Colab-notebook.

Een veelzijdige pijplijn voor het analyseren van dynamische veranderingen in kernlichamen in verschillende celtypen

Ontdek een computationele workflow voor de analyse van DNA-modificaties met immunokleuring en confocale microscopie. Deze methode beoordeelt signaalintensiteit en colocalisatie in kernen voor epigenetisch onderzoek.

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

Meer video's verkennen