Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Het algemene doel van deze procedure is om gerichte gen-gedisrupteerde Streptococcus mutans stammen te genereren met behulp van een tweestaps fusie PCR en elektroporatie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie, zoals hoe een gen van belang werkt.Het grote voordeel van deze techniek is dat er geen enzymatische reactie anders dan PCR nodig is en dat de voorbereiding van competente cellen voor elektroporatie vrij eenvoudig is.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de Streptococcus mutans gen-disruptietechniek, kan deze ook worden toegepast op andere microbiële soorten zoals Staphylococcus aureus.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat ze niet bekend zijn met de effectiviteit van geneste primers voor de tweede PCR.Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Doctor Ayako Okada, een onderzoeksdocent uit ons laboratorium.Om deze procedure te beginnen, strekt u S.mutans UA159-stam op een hersenhartinfusie of BHI-agarplaat en incubeert u de plaat een nacht bij 37 graden Celsius onder anaërobe omstandigheden.Op de volgende dag gebruikt u een gesteriliseerde tandenstoker om een enkele kolonie te plukken en deze in vijf milliliter BHI-bouillon te inoculeren.Incubeer de S.mutans-cultuur een nacht bij 37 graden Celsius onder anaërobe omstandigheden.Centrifugeer vervolgens de cultuur gedurende 15 minuten bij 2000 keer G.Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet in vijf milliliter PBS.Centrifugeer opnieuw gedurende 15 minuten bij 2000 keer G.Suspendeer de resulterende celpellet in 200 microliter PBS.Extract genomisch DNA uit de suspensie met behulp van een bead-beating-gebaseerd genomisch DNA-extractiekit.Breng eerst de celsuspensie over naar een monsterbuis van twee milliliter met daarin glazen kralen.Voeg vervolgens 750 microliter lysoplossing toe aan de celsuspensie.Doe de buisjes goed dicht en plaats ze symmetrisch in de buishouder van het bead-beating-apparaat.Verwerk gedurende vijf minuten op de maximale snelheid.Centrifugeer de bead-beaten monsters gedurende één minuut bij 10.000 keer G.Breng het supernatant over naar een spinkolom in een twee-milliliter-verzamelbuis en centrifugeer gedurende één minuut bij 7000 keer G.Voeg 1200 microliter DNA-bindende buffer toe aan het filtraat en breng 800 microliter van het mengsel over naar de spinkolom in een twee-milliliter-verzamelbuis.Centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 keer G.Gooi het doorstroomwater weg.Voeg 200 microliter voorwasbuffer toe aan de spinkolom om de kolommatrix te wassen en centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 keer G.Gooi het doorstroomwater weg, voeg 500 microliter wasbuffer toe aan de spinkolom om de kolommatrix te wassen en centrifugeer opnieuw.Plaats elke spinkolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg 100 microliter elutiebuffer toe aan de kolommatrix.Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 10.000 keer G om het genomische DNA te elueren.Schat de DNA-concentratie en zuiverheid in door de absorptie te meten bij 260 nanometer en 280 nanometer met behulp van een spectrofotometer.De eerste PCR wordt uitgevoerd met behulp van het S.mutans wild type-genoom en het synthetische streptomycine-resistentiegen als PCR-sjablonen.Er worden drie sets primers gebruikt om respectievelijk de stroomopwaartse flankerende regio van het glycosyltransferase C of gtfC-gen, de stroomafwaartse flankerende regio van het gtfC-gen en het spectinomycine-resistentiegen te versterken.Fractieer elk PCR-product op een 1% agarosegel.De grootte van elk product van de eerste PCR moet ongeveer één KB zijn.Gebruik een gelbandsnijder om de overeenkomstige banden uit te snijden en zuiver elke versterkte DNA-product zoals beschreven in het tekstprotocol.De volgende stap is om de drie ongeveer gelijke molaire fragmenten als PCR-sjablonen te gebruiken om de tweede PCR uit te voeren.Deze fragmenten worden versterkt en gespleten met behulp van geschikte primers om de disruptieconstructie te produceren.Aangezien het succes van deze procedure afhankelijk is van de versterking van de disruptieconstructie door de tweede PCR, is het belangrijk om het tweede PCR-product te bevestigen door middel van elektroforese.Laad 1/10 van de PCR-reactiemix op een 0,8% agarosegel om te bevestigen dat het gegenereerde amplicon de voorspelde bandsgrootte heeft.In dit voorbeeld gaven geneste primers veel betere versterking.Breng het resterende PCR-mengsel over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg 55 microliter ultrapuur water toe om het totale volume op 100 microliter aan te passen.Voeg 1/10 volume van drie molar natriumacetaat pH 5,2 toe, gevolgd door 2,5 volumes van 100% ethanol en meng.Vries gedurende 30 minuten bij minuus 80 graden Celsius.Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 15.000 keer G bij vier graden Celsius.Controleer na het centrifugeren op de pellet op de bodem van de buis.Gooi het supernatant weg.Was de pellet met één milliliter 70% ethanol en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 15.000 keer G bij vier graden Celsius.Gooi het supernatant weg en laat de pellet gedurende ongeveer 30 minuten drogen.Los tenslotte de pellet op met 10 microliter ultrapuur water.Competente S.mutans UA159-cellen waren eerder bereid en opgeslagen als 50 microliter aliquoten bij minuus 80 graden Celsius.Meng elk 50 microliter aliquot ijskoud competente cellen met vijf microliter van de disruptieconstructie.Voeg het mengsel toe aan elektroporatiecuvettes met een afstand van 0,2 centimeter tussen de elektroden.Voer elektroporatie uit met behulp van de Staphylococcus aureus-modus van het elektroporatieapparaat.Direct na elektroporatie, suspendeert u de cellen in 500 microliter BHI-bouillon en brengt u 50 microliter van de suspensie aan op spectinomycine-bevattende BHI-agarplaten.Incubeer de platen gedurende twee tot zes dagen bij 37