Name: Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Leer een snelle methode voor gen-disruptie in Streptococcus mutans zonder klonen met behulp van fusie-PCR en elektroporatie. Deze techniek versnelt microbiologisch genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap [Grant nummers 16 K 15860 tot T.M. en 15 K 15777 naar N.H.].

1. primer Design <ol><li>bereiden inleidingen voor 2-step fusion PCR en verificatie van de verstoring van de gene. 
	Opmerking: Tabel 1 toont de sequenties van de primer gebruikt in dit protocol. Figuur 1 toont een schematische afbeelding van de 2-step fusion PCR methode gebruikt voor het genereren van S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>Ontwerp inleidingen voor de vervanging van de doel-regio in het genoom met de spectinomycine-resistentie gen (spc r) 7. Dit protocol wordt de hele codering regio van het gtfC-gen vervangen door spc r.</li>
		<li>Omvatten 15 honken ter aanvulling van de bovenste en onderste uiteinden van spc r op de 5 &#39; regio's van reverse-up en down-forward primers, respectievelijk. Evenzo bevatten 15 honken complementair aan de onderkant van de upstream flankerende gebieden van gtfC en de bovenkant van de stroomafwaartse flankerende gebieden van gtfC op de 5 &#39; regio's van spc r-voorwaarts en spc r -omgekeerde inleidingen, respectievelijk ( figuur 1A). 
		Opmerking: Sequenties van up-reverse, down-forward, spc r - forward en spc r - omgekeerde inleidingen worden automatisch bepaald afhankelijk van de plaats van opneming van de verstoring construct.</li>
		<li>De up-forward en down-omgekeerde inleidingen omvat ontwerpen &#62; 1-kb stroomopwaarts en stroomafwaarts flankerende gebieden van de gtfC-gen, respectievelijk. Instellen van de smelttemperatuur (T m) van up-naar voren en omlaag-omgekeerde inleidingen overeenkomstig de smelttemperatuur van up-reverse en down-forward primers, respectievelijk ( figuur 1A). 
		Opmerking: Verwijzen naar de volgende formule om te bepalen van T m: T m (° C) = 2 (* nb + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, waar * N vertegenwoordigt het aantal primer nucleotiden met de opgegeven identiteit (A, T, C en G).</li>
		<li>Ontwerpen genestelde inleidingen (N_up-forward en reverse-N_up) voor de 2 nd PCR ( figuur 1B). 
		Opmerking: Hoewel het paar ultraperifere primer (up-naar voren en omlaag-reverse) kan worden gebruikt als inleidingen voor de 2 nd PCR, genestelde inleidingen (N_up-forward en N_up-reverse) werden ontworpen in dit protocol. Genestelde inleidingen zijn vaak vereist voor de 2 nd PCR, zoals beschreven in de Vertegenwoordiger resultaten.</li>
		<li>Design primers specifiek voor spc r. De inleidingen voor PCR van de kolonie aan het scherm voor verstoring van de gtfC worden gebruikt.</li>
		Verstoring van de <li>design inleidingen voor de verificatie van gtfC. 
		Opmerking: De PCR-producten versterkt met behulp van deze inleidingen straddle de grens tussen gtfC of spc r en stroomopwaarts of stroomafwaarts flankerende gebieden van gtfC. De primer sets &#39; gtfC up-forward en gtfC up-omgekeerde &#39; en &#39; gtfC down-forward en gtfC down-omgekeerde &#39; zijn specifiek voor gtfC, en &#39; gtfC up-forward en spc r 2 -omgekeerde &#39; en &#39; spc r 2-forward en gtfC down-omgekeerde &#39; zijn specifiek voor spc r.</li>
	</ol></li></ol> 2. Genomic DNA-extractie uit S. mutans <ol><li>Streak voorraad S. mutan s UA159 op een hersenen hart infusie (BHI) agarplaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>Halen een één kolonie met een gesteriliseerde tandenstoker en het enten in 5 mL BHI Bouillon. Incubeer de S. mutan s cultuur 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>Centrifuge de cultuur van de bacteriële cel voor de 15 min op 2.000 × g. resuspendeer de pellet cel in 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Centrifuge voor 15 min op 2.000 × g. resuspendeer de pellet cel in 200 µL van PBS.</li>
	<li>Extract van genomic DNA uit de suspensie met behulp van een kraal-gewonnen-base genomic DNA extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.
	<ol><li>Overdracht de schorsing naar een 2.0-mL Monster buis bevattende glazen bolletjes (meegeleverd in de kit). Voeg 750 µL van lysis van de oplossing (meegeleverd in de kit) om de celsuspensie.</li>
		<li>Cap strak en symmetrisch plaatsen van de buizen in de houder van de buis van de kraal-kloppend verstoring apparatuur. Proces bij de maximumsnelheid voor 5 min. Centrifuge de kraal-geslagen monsters voor 1 min op 10.000 × g. overbrengen in het supernatant het filter van de spin (meegeleverd in de kit) in een 2.0-mL collectie buis en centrifuge voor 1 min bij 7.000 × g .</li>
		<li>Toevoegen 1.200 µL van DNA-bindende buffer (meegeleverd in de kit) aan het filtraat. 800 µL van het mengsel aan de kolom van de spin (meegeleverd in de kit) overbrengen met een 2.0-mL collectie buis en centrifuge voor 1 min op 10.000 × g.</li>
		<li>Negeren de doorstroom, voeg 200 µL van vooraf wassen buffer (meegeleverd in de kit) naar de spin-kolom de kolom matrix, wassen en Centrifugeer gedurende 1 minuut op 10.000 × g. negeren de doorstroming, 500 µL van was buffer (meegeleverd in de kit) toevoegen aan de spin kolom de kolom matrix wassen en centrifugeren voor 1 min op 10.000 × g.</li>
		<li>Plaats van de spin-kolom in een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis en 100 µL van elutie buffer (meegeleverd in de kit) toevoegen aan de kolom matrix.</li>
		<li>Centrifuge voor 30 s bij 10.000 × g aan de genomic DNA Elueer. Schatten van de DNA-concentratie en zuiverheid door het meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nmusing een spectrofotometer en bevestigen dat de A 260 /A 280 verhouding groter is dan 1.8.</li>
	</ol></li></ol> 3. PCR versterking <ol><li>uitvoeren de 1 st PCR met behulp van de S. mutan s WT genoom en het synthetische spc r-gen als PCR sjablonen (Zie tabel 1). Versterken van de upstream begeleidende regio van het gtfC gen, de stroomafwaartse begeleidende regio of het gtfC-gen, het gen van de spc r met behulp van de drie reeksen inleidingen ( figuur 1A), beschreven als per Tabel 2 en tabel 3. 
	Opmerking: PCR inleidingen, reagentia en versterking cycli zijn samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3, respectievelijk.</li>
	<li>Fractionate elke PCR-product op een 1% agarose gel en accijnzen van de overeenkomstige bands met behulp van een gel band cutter.</li>
	<li>Zuiveren van elke versterkte product van het DNA van de gels met behulp van een spin kolom- en silica gel membraan gebaseerde extractie kit.
	<ol><li>Overdracht de gel segmenten een schone microcentrifuge buis en meng met 500 µL van bindende buffer (meegeleverd in de kit). Incubeer het mengsel bij 55 ° C gedurende 15 minuten totdat de gel-segmenten zijn volledig is opgelost.</li>
		<li>Plaats van de kolom van de spin (meegeleverd in de kit) in een buis van de collectie (meegeleverd in de kit), het monster op de spin kolom te laden en Centrifugeer gedurende 30 s bij 11.000 × g. Gooi de doorstroming, voeg de 600 µL van Wash Buffer (meegeleverd in de kit) naar de kolom Spin te wassen de silica-membraan, en Centrifugeer gedurende 30 s bij 11.000 × g.</li>
		<li>De doorstroming en Centrifugeer gedurende 2 min op 11.000 × g te drogen het kiezelzuur membraan negeren.</li>
		<li>Plaats van de spin-kolom in een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis, voeg 50 µL elutie Buffer (meegeleverd in de kit), en uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten</li>
		Centrifugeer gedurende 2 min op 11.000 <li>× g tot elueer de versterkte DNA. Schatten van de DNA-concentratie en zuiverheid door het meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nmusing een spectrofotometer en bevestigen dat de A 260 /A 280 verhouding groter is dan 1.8.</li>
	</ol></li> <li>Uitvoeren de 2 nd PCR van 2-step fusie PCR met behulp van de drie ongeveer mengsel fragmenten als PCR sjablonen, volgens tabel 2 en tabel 3. 
	Opmerking: Deze fragmenten werden versterkt en verbinding aan de randen met behulp van de genestelde inleidingen &#39; N_up-forward en N_down-omgekeerde &#39; of de ultraperifere inleidingen &#39; up-forward en down-omgekeerde &#39; ( figuur 1B). PCR de inleidingen, reagentia en versterking cycli zijn samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3, respectievelijk.</li>
	<li>Laden van een tiende van het PCR-reactiemengsel (5 µL) op een 0,8% agarose gel en vergelijk de grootte van de versterkte band met de grootte van de verwachte band te bevestigen van de generatie van de juiste amplicon ( Figuur 1 c).</li>
	<li>Concentreren het resterende laatste PCR-product door ethanol neerslag zonder zuivering.
	<ol><li>Toevoegen 55 µL van ultra pure water om de resterende PCR mengsel aan te passen van het totale volume aan 100 µL.Add een volume eentiende van 3 M Natriumacetaat (10 µL), pH 5.2, gevolgd door 2,5 volumes van 100% ethanol (250 µL). Meng en bevriezen voor 30 min op -80 ° C.</li>
		<li>Centrifuge gedurende 20 minuten bij 15.000 × g bij 4 ° C, om de pellet op de onderkant van de buis controleren en verwijder het supernatant. Wassen van de pellet met 1 mL 70% ethanol, centrifuge voor 5 min bij 15.000 × g bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. De pellet gedurende ongeveer 30 minuten drogen en los met 10 µL van ultra pure water.</li>
	</ol></li></ol> 4. Bekwame cel voorbereiding en Celtransformatie <ol><li>Streak voorraad S. mutan s UA159 op een BHI agarplaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>Halen een één kolonie met een gesteriliseerde tandenstoker en het enten in 5 mL BHI Bouillon. Incubeer de S. mutan s cultuur 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>Overbrengen van 2 mL van de S. mutan s cultuur aan 50 mL BHI Bouillon en incubeer gedurende 6-8 uur bij 37 ° C tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van 0,2-0,4 onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>Centrifugeren van de cellen gedurende 15 minuten staan bij 2.000 × g bij 4 ° C, verwijder het supernatant en wassen van de cellen tweemaal met 40 mL ijskoud water gevolgd door 40 mL 10% glycerol. 
	Opmerking: Resterende stoffen invloed op latere electroporation.</li>
	<li>Gecombineerd het supernatant zorgvuldig met een pipet van Pasteur, als de hechting van de cel pellet in 10% glycerol gereduceerd. Resuspendeer de cellen in 1 mL vers 10% glycerol, breng 50 µL van de schorsing in elke 1.5-mL microcentrifuge buis en opslaan bij-80 ° C tot vlak voor gebruik.</li>
	<li>Mix de 50 µL hoeveelheid ijskoude bevoegde cellen met 5 µL van de verstoring construct hierboven beschreven in punt 3. Voeg het mengsel aan electroporation cuvettes (met een 0,2 cm afstand tussen de elektroden). Dienst van de Staphylococcus aureus-modus (1.8 kV 600 Ω, 10 µF, 1 puls) van het apparaat electroporation naar electroporate.</li>
	<li>Schorten de cellen in 500 µL van BHI Bouillon onmiddellijk na electroporation en voeg 50 µL van de ophanging aan spectinomycine-bevattende BHI-agar platen. 
	Opmerking: Extra incubatie tijd nadat electroporation is niet vereist. Echter incubatie gedurende 1-2 uur na electroporation kunt efficiënter transformatie.</li>
	<li>Broeden de plaat voor 2-6 dagen bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden. 
	Opmerking: S. mutans Δ gtfB wordt geconstrueerd zoals hierboven beschreven. De hele codering regio van het gtfB-gen is vervangen door de erythromycine resistentie gen 8 in S. mutans Δ gtfB. Elke stam S. mutans is gekweekt in BHI Bouillon bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
</ol> 5. Verificatie van Gene verstoring en opslag <ol><li>Kies willekeurige kolonies en enten ze in het mengsel van PCR uit te voeren volgens tabel 2 en tabel 3 PCR van de kolonie. PCR de inleidingen, reagentia en versterking cycli zijn samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3, respectievelijk.</li>
	<li>Laden het reactiemengsel PCR op een 1% agarose gel te bevestigen de spc r-specifieke DNA band.</li>
	<li>Halen de positieve kolonie met een gesteriliseerde tandenstoker en subcultuur cellen in 10 mL spectinomycine-bevattende BHI bouillon voor 2 dagen bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>Het controleren van de generatie van S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>De celsuspensie gelijkelijk verdelen. Uittreksel genomic DNA van de cellen die hierboven beschreven (stappen 2.3. aan 2.5.5.). Uitvoeren van PCR met genomic DNA als de PCR-sjabloon, gebruikend inleidingen voor de verificatie van verstoring van de gtfC (tabel 1) volgens tabel 2 en tabel 3. 
		Opmerking: De PCR inleidingen, reagentia en versterking cycli zijn samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3, respectievelijk.</li>
		<li>Laden van de PCR-mix op een 2% agarose gel en vergelijk de grootte van de versterkte band met de grootte van de verwachte band te bevestigen van de generatie van de passende amplicon .</li>
		<li>De resterende celsuspensie gedurende 15 minuten staan bij 2.000 × g Centrifugeer bij 4 ° C. resuspendeer de pellet cel in 5 mL PBS.</li>
		<li>Centrifuge voor 15 min bij 2.000 × g bij 4 ° C. resuspendeer de pellet in 1,5 mL BHI bouillon met 25% glycerol en op te slaan in-80 ° CvdR -20 ° C. de cel</li>
	</ol></li></ol> 6. Fenotypische analyse <ol><li>Streak elke S. mutan s stam op een BHI agarplaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>Halen een één kolonie met een gesteriliseerde tandenstoker en het enten in 2 mL BHI bouillon met of zonder een juiste antibioticum. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>20 µL van de overnachting cultuur schorsing in BHI bouillon met 1% of 5% sacharose zonder antibiotica in een reageerbuis glas 2 mL beënten; cultuur van de cellen met de proefbuis in een geneigd positie 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.</li>
	<li>Vortex de glazen reageerbuizen voor 10 s en decanteren cultuur schorsingen. Wassen van de reageerbuisjes driemaal met gedestilleerd water. Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% Coomassie briljante blauw (CBB) om de biofilms vlek op de buiswand, en vervolgens Incubeer gedurende 1 min.</li>
	<li>De kleurstofoplossing decanteren, de reageerbuisjes driemaal met gedestilleerd water wassen en drogen van de reageerbuisjes.</li>
	<li>Evalueren zowel de kleur-dichtheid en de uitbreiding van het CBB gekleurd-biofilm visueel om te bepalen van het vermogen van biofilm-vormende in een fenotypische analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2(2002).</li>
<li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li>
<li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het huidige protocol, moeten de inleidingen voor de 1st PCR worden ontworpen om het versterken van ongeveer 1 kb stroomopwaarts en stroomafwaarts flankerende gebieden van de regio van de doelgroep in het genoom. Dergelijke lange flankeren de opeenvolgingen van zijn nodig ter verbetering van de efficiëntie van homologe recombinatie.
De sequenties van de inleidingen (up-reverse, down-forward, spcr-vooruit, en spcr-reverse) in dit protocol wer...

Gene functie analyse betekent meestal dat een fenotypische vergelijking tussen een wild-type stam en een stam die een bepaald gen van belang heeft is verstoord. Deze verstoring van de gen techniek is gebruikt voor gene functie analyses in een breed scala van taxa, van bacteriën tot zoogdieren. De constructie van een gen-verstoring is noodzakelijk voor de generatie van de gen-verstoord stam; Deze constructie deoxyribonucleic acid (DNA) bestaat uit de antibioticaresistentie marker gene gesmolten aan de upstream- en downstream flankerende gebieden van het target-gen, en is opgenomen in het genoom via homologe recombinatie. De stam van gen-verstoord kan worden geïsoleerd met behulp van selectieve media met het antibioticum. De conventionele methode gebruikt voor de bouw van de gen-verstoord stam vereist complexe stappen, zoals de versterking van het target-gen door de polymerase-kettingreactie (PCR), Afbinding van het gen in een geschikte plasmide, spijsvertering met beperking enzymen en regeling te voegen van het antibioticum-resistentie marker-gen. Dit proces is tijdrovend, het nemen van enkele dagen tot enkele weken, afhankelijk van het succes van elke stap. Het ontwerp van verstoring constructies is bovendien afhankelijk van de restrictie-enzym-sites van de target-gen. U kunt deze problemen oplossen, zijn PCR-gebaseerde DNA splicing methoden1,2 voor het ontwerp van gen-verstoord mutanten van Dictyostelium discoideum3 en Synechocystis sp. PCC68034 gemeld. In de huidige studie, een methode ontwikkeld voor het genereren van een gen-verstoord streptokokken stam in een relatief snelle, facile en goedkope manier, gebruik makend van een gemodificeerde PCR-gebaseerde methode (aangewezen 2-step fusion PCR) voor de bouw van de verstoring Construct en electroporation voor genetische transformatie.
De fusie van de 2-step die PCR genomic DNA, de resistentie tegen antibiotica marker gene als een PCR-sjabloon en vier paar op de juiste wijze vereist ontworpen oligonucleotide inleidingen. In de eerste stap (1st PCR), een 1-kb upstream begeleidende regio van het target-gen, een stroomafwaartse begeleidende regio 1-kb van het doel worden-gen, en het antibioticum-resistentie marker-gen versterkt door PCR. De 5' regio's zowel de omgekeerde primer en de voorwaartse primer, voor versterking van de upstream en downstream bevatten flankerende gebieden, respectievelijk 15 honken complementair aan de uiteinden van het marker-gen. De 5' regio's zowel voorwaartse als terugwaartse inleidingen voor marker gene amplificatie omvatten ook 15 honken complementair aan het ondereinde van de upstream begeleidende regio van het target-gen en de bovenkant van de stroomafwaartse begeleidende regio van het target-gen, respectievelijk. Dus bevatten de drie versterkte fragmenten overlappende 30-basenpaar regio's op de site van de fusie. In de tweede stap (2nd PCR), wordt PCR uitgevoerd met genestelde PCR inleidingen met behulp van de drie fragmenten versterkt door de 1st PCR als sjablonen. De complementaire regio's van de sjablonen zijn bovendien aan elkaar gekoppeld via de 2nd PCR. Tot slot, de constructie voor homologe recombinatie is geïntroduceerd in de stam van de wild-type door electroporation. Verstoring van de succesvolle gen kan worden geverifieerd door PCR met behulp van specifieke primers. Hoewel de structuur van de verstoring wordt versterkt met behulp van HiFi-polymerase van DNA, zijn extra enzymatische reacties, zoals DNA afbinding of spijsvertering van DNA, niet nodig voor het genereren van de constructie. Daarnaast kan een verwijderde of geconserveerde regio op het genoom flexibel worden gekozen volgens primer ontwerp.
In het huidige werk, werd verwijdering van de gehele codering regio van het gtfC -gen, dat glucosyltransferase in Streptococcus mutans codeert, uitgevoerd om aan te tonen van de snelle, gemakkelijke gene verstoring methode in een streptokokken soorten. Bovendien, een gtfB-verstoord stam was gegenereerd op dezelfde manier. De glucosyltransferases die zijn gecodeerd door zowel de gtfC als de gtfB bijdragen tot verwekkende tandheelkundige biofilm ontwikkeling5,6. De biofilm-vormende capaciteiten van het wild-type stam (S. mutans WT), gtfC-verstoord stam (S. mutans ΔgtfC), en gtfB-verstoord stam (S. mutans ΔgtfB) werden geëvalueerd voor vergelijkende fenotypische analyses. Dit protocol de toepassing van een methode in twee stappen voor de verstoring van het gen voor een extra vissoort wordt uitgebreid en kan worden gewijzigd voor studies van de genfunctie in een breder scala van taxa.

<table><tbody><tr><td>Streptococus mutans</td><td>Stamm in het lab.</td><td></td><td>Wild-type stam (Stam UA159)</td></tr><tr><td>Genoom DNA extractie kit</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Bead-beating disrupatie apparaat</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Synthetische genen</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Op bestelling</td><td>Spectinomycine- en erytromycine-resistentie gen</td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Op bestelling</td><td>35 basen lang</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>Hoog-fideliteit DNA polymerase</td></tr><tr><td>Gel extractie kit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>DNA extractie uit agarose gel</td></tr><tr><td>Gel band snijder</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Electroporatie cuvet</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>0.2-cm opening</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Anaërobe kweek systeem</td></tr><tr><td>Hersenhart infusie bouillon</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Bacterie kweek media</td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Erytromycine</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Voor biofilm ontwikkeling</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Voor biofilm kleuring</td></tr></tbody></table>

generatie van een gen-verstoord streptococcus mutans stam zonder gene klonen

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typische methodes voor de opheldering van de functie van een bepaald gen omvatten vergelijkende fenotypische analyses van de wild-type stam en een stam die het gen van belang heeft is verstoord. Een gen-verstoring DNA constructie met een geschikt antibioticaresistentie marker-gen is nuttig voor de generatie van gen-verstoord stammen van bacteriën. Conventionele bouwwijze, waarvoor gene klonen stappen, betrekken echter ingewikkeld en tijdrovend protocollen. Hier, wordt een relatief facile, snelle en kosteneffectieve methode voor gerichte gene verstoring in Streptococcus mutans beschreven. De methode maakt gebruik van een 2-step fusion polymerase-kettingreactie (PCR) om de verstoring van de constructie en electroporation voor genetische transformatie te genereren. Deze methode vereist geen een enzymatische reactie, dan PCR, en bovendien biedt meer flexibiliteit in termen van het ontwerp van de verstoring van de constructie. Werkgelegenheid van electroporation vergemakkelijkt het opstellen van bevoegde cellen en verbetert de efficiency van de transformatie. De huidige methode kan worden aangepast voor de generatie van gen-verstoord stammen van verschillende diersoorten.

Figuur 2 toont dat de omvang van elk product uit de 1st PCR, zoals waargenomen op de 1% agarose gel, was in goede overeenkomst met de voorspelde grootte van ongeveer 1 kb. Figuur 3 toont de analyse van de Elektroforese van het gel van de producten van de 2nd PCR. Figuur 4 toont S. mutans kolonies getransformeerd met de verstoring van de constructie, en een analyse van d...

We beschrijven een facile, snelle en relatief goedkope methode voor het genereren van gen-verstoord Streptococcus mutans stammen; Deze techniek kan worden aangepast voor de generatie van gen-verstoord stammen van verschillende diersoorten.

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Het algemene doel van deze procedure is om gerichte gen-gedisrupteerde Streptococcus mutans stammen te genereren met behulp van een tweestaps fusie PCR en elektroporatie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie, zoals hoe een gen van belang werkt.Het grote voordeel van deze techniek is dat er geen enzymatische reactie anders dan PCR nodig is en dat de voorbereiding van competente cellen voor elektroporatie vrij eenvoudig is.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de Streptococcus mutans gen-disruptietechniek, kan deze ook worden toegepast op andere microbiële soorten zoals Staphylococcus aureus.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat ze niet bekend zijn met de effectiviteit van geneste primers voor de tweede PCR.Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Doctor Ayako Okada, een onderzoeksdocent uit ons laboratorium.Om deze procedure te beginnen, strekt u S.mutans UA159-stam op een hersenhartinfusie of BHI-agarplaat en incubeert u de plaat een nacht bij 37 graden Celsius onder anaërobe omstandigheden.Op de volgende dag gebruikt u een gesteriliseerde tandenstoker om een enkele kolonie te plukken en deze in vijf milliliter BHI-bouillon te inoculeren.Incubeer de S.mutans-cultuur een nacht bij 37 graden Celsius onder anaërobe omstandigheden.Centrifugeer vervolgens de cultuur gedurende 15 minuten bij 2000 keer G.Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet in vijf milliliter PBS.Centrifugeer opnieuw gedurende 15 minuten bij 2000 keer G.Suspendeer de resulterende celpellet in 200 microliter PBS.Extract genomisch DNA uit de suspensie met behulp van een bead-beating-gebaseerd genomisch DNA-extractiekit.Breng eerst de celsuspensie over naar een monsterbuis van twee milliliter met daarin glazen kralen.Voeg vervolgens 750 microliter lysoplossing toe aan de celsuspensie.Doe de buisjes goed dicht en plaats ze symmetrisch in de buishouder van het bead-beating-apparaat.Verwerk gedurende vijf minuten op de maximale snelheid.Centrifugeer de bead-beaten monsters gedurende één minuut bij 10.000 keer G.Breng het supernatant over naar een spinkolom in een twee-milliliter-verzamelbuis en centrifugeer gedurende één minuut bij 7000 keer G.Voeg 1200 microliter DNA-bindende buffer toe aan het filtraat en breng 800 microliter van het mengsel over naar de spinkolom in een twee-milliliter-verzamelbuis.Centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 keer G.Gooi het doorstroomwater weg.Voeg 200 microliter voorwasbuffer toe aan de spinkolom om de kolommatrix te wassen en centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 keer G.Gooi het doorstroomwater weg, voeg 500 microliter wasbuffer toe aan de spinkolom om de kolommatrix te wassen en centrifugeer opnieuw.Plaats elke spinkolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg 100 microliter elutiebuffer toe aan de kolommatrix.Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 10.000 keer G om het genomische DNA te elueren.Schat de DNA-concentratie en zuiverheid in door de absorptie te meten bij 260 nanometer en 280 nanometer met behulp van een spectrofotometer.De eerste PCR wordt uitgevoerd met behulp van het S.mutans wild type-genoom en het synthetische streptomycine-resistentiegen als PCR-sjablonen.Er worden drie sets primers gebruikt om respectievelijk de stroomopwaartse flankerende regio van het glycosyltransferase C of gtfC-gen, de stroomafwaartse flankerende regio van het gtfC-gen en het spectinomycine-resistentiegen te versterken.Fractieer elk PCR-product op een 1% agarosegel.De grootte van elk product van de eerste PCR moet ongeveer één KB zijn.Gebruik een gelbandsnijder om de overeenkomstige banden uit te snijden en zuiver elke versterkte DNA-product zoals beschreven in het tekstprotocol.De volgende stap is om de drie ongeveer gelijke molaire fragmenten als PCR-sjablonen te gebruiken om de tweede PCR uit te voeren.Deze fragmenten worden versterkt en gespleten met behulp van geschikte primers om de disruptieconstructie te produceren.Aangezien het succes van deze procedure afhankelijk is van de versterking van de disruptieconstructie door de tweede PCR, is het belangrijk om het tweede PCR-product te bevestigen door middel van elektroforese.Laad 1/10 van de PCR-reactiemix op een 0,8% agarosegel om te bevestigen dat het gegenereerde amplicon de voorspelde bandsgrootte heeft.In dit voorbeeld gaven geneste primers veel betere versterking.Breng het resterende PCR-mengsel over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg 55 microliter ultrapuur water toe om het totale volume op 100 microliter aan te passen.Voeg 1/10 volume van drie molar natriumacetaat pH 5,2 toe, gevolgd door 2,5 volumes van 100% ethanol en meng.Vries gedurende 30 minuten bij minuus 80 graden Celsius.Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 15.000 keer G bij vier graden Celsius.Controleer na het centrifugeren op de pellet op de bodem van de buis.Gooi het supernatant weg.Was de pellet met één milliliter 70% ethanol en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 15.000 keer G bij vier graden Celsius.Gooi het supernatant weg en laat de pellet gedurende ongeveer 30 minuten drogen.Los tenslotte de pellet op met 10 microliter ultrapuur water.Competente S.mutans UA159-cellen waren eerder bereid en opgeslagen als 50 microliter aliquoten bij minuus 80 graden Celsius.Meng elk 50 microliter aliquot ijskoud competente cellen met vijf microliter van de disruptieconstructie.Voeg het mengsel toe aan elektroporatiecuvettes met een afstand van 0,2 centimeter tussen de elektroden.Voer elektroporatie uit met behulp van de Staphylococcus aureus-modus van het elektroporatieapparaat.Direct na elektroporatie, suspendeert u de cellen in 500 microliter BHI-bouillon en brengt u 50 microliter van de suspensie aan op spectinomycine-bevattende BHI-agarplaten.Incubeer de platen gedurende twee tot zes dagen bij 37

generation-gene-disrupted-streptococcus-mutans-strain-without-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Een efficiënte genoom-brede enkel gen mutatie methode is vastgesteld aan de...

Genoom-brede gendeleties in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Door High Throughput PCR

Source: Lea-Smith, D. J., et al. Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates a method for generating antibiotic-marked mutants in cyanobacteria. The protocol begins with culturing cyanobacteria, followed by centrifugation and washing steps that preserve surface pili. A plasmid carrying an antibiotic resistance gene flanked by homologous sequences is then introduced. During incubation, the plasmid is internalized via pili...

Generation of Antibiotic-Marked Mutants in Cyanobacteria via Homologous Recombination

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

Het introduceren van meerdere genomische veranderingen in cyanobacteriën is een essentieel hulpmiddel bij de ontwikkeling van stammen voor industrieel en fundamenteel onderzoek. We beschrijven een systeem voor het genereren van ongemarkeerde mutanten in de model cyanobacteriënsoort Synechocystis sp. PCC6803 en gemarkeerde mutanten in Synechococcus sp. PCC7002.

Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Hier beschreven is een eenvoudige methode voor de zuivering van een genproduct in Streptococcus mutans. Deze techniek kan voordelig zijn bij de zuivering van eiwitten, met name membraan eiwitten en hoge moleculaire massa-eiwitten, en kan worden gebruikt met verschillende andere bacteriesoorten.

Zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in Streptococcus mutans

Hier beschrijven we een eenvoudig en reproduceerbaar Protocol van muismodel van infectie om de verzwakking van de genetisch gemodificeerde stammen van Pseudomonas aeruginosa te evalueren in vergelijking met de Amerikaanse Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-goedgekeurde Escherichia coli voor commerciële toepassingen.

Generatie van in-frame Gendeletie mutanten in Pseudomonas aeruginosa en testen op virulentie demping in een eenvoudig muis model van infectie

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Leer een snelle methode voor gen-disruptie in Streptococcus mutans zonder klonen met behulp van fusie-PCR en elektroporatie. Deze techniek versnelt microbiologisch genetisch onderzoek.

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Meer video's verkennen