Name: In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Leer hoe beenmerg-afgeleide macrofagen myeline puin fagocyteren in vitro. Deze methode gebruikt fluorescente labeltechnieken om fagocytosecapaciteit te beoordelen bij neurotrauma-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist bij de FSU College of Medicine voor al zijn werk in videoproductie, bewerken en voice-over.
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01GM100474 en R01GM072611).

De methoden die hier worden beschreven en in deel 2 zijn goedgekeurd door de Florida State University institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en volgt de richtsnoeren uiteengezet in de gids voor zorg en gebruik van proefdieren, 8th edition . Alle dieren die worden gebruikt in dit in dit protocol zijn huis in een speciaal laboratorium dier faciliteit tot gebruik. Geen in vivo experimenten werd uitgevoerd vóór de offeren. Dierlijke nummers waren gebaseerd op experimentele behoefte met behulp van gemiddelde cel- en myeline collecties als een gids om het gebruik te minimaliseren.
Opmerking: Dit protocol beschrijft de generatie van het beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) (afdeling 1), de voorbereiding van fluorescently geëtiketteerde hersenen-afgeleide myeline puin (sectie 2), de algemene procedure voor het analyseren van myeline puin fagocytose (sectie 3), en de algemene procedure voor analyse van myeline puin lipide accumulatie (afdeling 4). Bereiding van het reagens, cel oogsten en manipulatie, myeline collectie en labeling en assay prestaties moeten worden ingevuld in een laminaire luchtstroming bioveiligheid kabinet.
1. generatie van primaire beenmerg-afgeleide macrofagen
<ol>
	<li>Voorbereiding voor volledige macrofaag kweekmedium (CMCM) Opmerking: Macrophage generatie uit beenmerg vereist het gebruik van macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF). Deze voorbereiding maakt gebruik van L929 lymfkliertest fibroblast geconditioneerd media als bron van M-CSF.<ol>
		<li>Genereren L929 lymfkliertest fibroblast geconditioneerd media door kweken cellen in 145 mm gerechten met 50 mL van de hoge glucose (4500 mg/L L-glucose) Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% nieuwe geboren voor kalfsserum (NCS) en penicilline/streptomycine voor 7 dagen.</li>
		<li>Media van culturen in 50 mL conische centrifuge buizen en centrifuge verzamelen gedurende 30 minuten bij 3500 x g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtreer supernatant door een 0,2 µm spuit filter in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 mL. Geconditioneerde media kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden.</li>
		<li>Te hoge glucose DMEM, het toevoegen van 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 lymfkliertest fibroblast geconditioneerd DMEM en 1% penicilline/streptomycine. Media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor 2-3 maanden. Warm tot 37 ° C vóór gebruik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verzameling van primaire beenmergcellen en macrofaag inductie 
	Opmerking: Met dit protocol een muis genereert ongeveer 20 miljoen beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs).<ol>
		<li>Het gewenste aantal van 8-10 week oude muizen met behulp van standaard CO2 verstikking richtsnoeren gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren.</li>
		<li>Het zuiveren van het dier met behulp van 70% (vol/vol) ethanol: H2O, verzadigen van de vacht.</li>
		<li>Snijd een kleine opening in de buik en terug Trek voorzichtig de huid te onthullen van het onderliggende weefsel. Zorg niet doorprikken de peritoneale holte.</li>
		<li>Verwijder beide achterpoten op de heup begint en eindigt bij de enkel. Plaats de verzamelde weefsel in een petrischaal van 100 mm met 5-10 mL steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 1% penicilline/streptomycine. 
		Opmerking: Verwerking van verschillende dieren zorg er bij te houden van de gerechten op het ijs te beperken van de aantasting van het weefsel.</li>
		<li>Spier- en bindweefsel verwijderen door het bot met behulp van een scalpel. Alleen het bovenbeen en het onderbeen worden gebruikt voor het verzamelen van de cel, het kuitbeen kan worden weggegooid.</li>
		<li>Bloot de holte van het merg van de verzamelde botten door het trimmen van een klein deel van elk uiteinde met een scalpel.</li>
		<li>Met behulp van een 25g naald, spoel de holtes van de beenmerg met CMCM in een tube van 50 mL conische centrifuge. De botten zal verschijnen witte zodra ze hebben voldoende gespoeld is.</li>
		<li>Zodra collectie is voltooid, doorroeren aangeblazen met een naald 18g voor 30-90 s tot een enkele celsuspensie gegenereerd. 
		Opmerking: Een optionele rode bloedcellen (RBC) lysis stap kan op dit moment worden uitgevoerd. Het is onlangs gesuggereerd dat intracellulaire ijzergehalte invloed op de effecten van myeline puin op macrophage polarisatie16 hebben kan. Voor informatie over het opnemen van een stap van de lysis van de RBC verwijzen naar Trouplin et al. 17.</li>
		<li>Filtreer de schorsing door een 70 µm steriele cel zeef in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 mL.</li>
		<li>Zaad verzameld cellen gelijkmatig in 145 mm cel cultuur gerechten met 15-20 mL CMCM. Gebruik ongeveer drie cultuur gerechten per muis opgeofferd. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2culturen.</li>
		<li>Na 72 uur platen eenmaal met steriel PBS wassen tot niet-aanhanger cellen verwijderen, voeg dan 15-20mL verse CMCM. Incubeer culturen voor extra 4 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. Na 7 dagen van totale cultuur zullen de hematopoietische beenmergcellen aanvankelijk geïsoleerd volwassen BMDMs (Figuur 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. productie van Fluorescently geëtiketteerde hersenen-afgeleide myeline puin
Opmerking: Alle reagentia kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
<ol>
	<li>Voorbereiding van myeline puin collectie reagentia
	<ol>
		<li>Bereiden van Tris· Cl-bufferoplossing.<ol>
			<li>Tot 800mL Voeg gedestilleerd gedeïoniseerd H2O (ddiH2van O) 20 mL 1 M Tris· Cl, pH 7,45 (20 mM eindconcentratie) en 20 mL 100 mM nb2EDTA (definitieve concentratie van 2 mM).</li>
			<li>Breng de pH op 7,45. Stel volume tot 1000 mL met ddiH2O. Filter oplossing via een 0,2 µm filtratie eenheid.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiden 1 M sacharoseoplossing.<ol>
			<li>Tot 100 mL van Tris· Cl buffer oplossing, voeg 68.46 g van sucrose. Draai volume om 200 mL met Tris· Cl-bufferoplossing. Filtreer de oplossing door middel van een 0,2 µm filtratie unit.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>200 mL 0.32 M sacharoseoplossing bereid door verdunning van de 1 M-oplossing met de Tris· Cl buffer oplossing 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
		<li>150 mL 0,83 M sacharoseoplossing bereid door verdunning van de 1 M-oplossing met de Tris· Cl buffer oplossing 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Collectie van hersenen-afgeleide ruwe myeline puin 
	Opmerking: De hier beschreven methode van de collectie is voor de isolatie van ruwe myeline puin.<ol>
		<li>Euthanaseren 10-12 muizen 8-10 weken oud met behulp van standaard CO2 verstikking richtsnoeren gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
		<li>Ontleden van de hersenen en plaats ze in een schaal van 100 mm met 10 mL 0.32 M sacharoseoplossing.</li></ol></li></ol>Houd de schotel op het ijs.
		<li>Met behulp van steriele chirurgische schaar gesneden van de hersenen in stukken van ongeveer 5 mm3 in grootte.</li>
		<li>Het weefsel overbrengen in een tube van 50 mL conische centrifuge en voeg ongeveer 30 mL 0.32 M sacharoseoplossing.</li>
		<li>Meng met een steriele hand-held roterende homogenizer, tot een goede oplossing is bereikt.</li>
		<li>Verdun de gehomogeniseerde hersenen tot een eindvolume van 90 mL met 0.32 M sacharoseoplossing.</li>
		<li>Zes polypropyleen ultracentrifuge 38,5-mL dunwandige buizen, Voeg 20 mL 0,83 M sacharoseoplossing.</li>
		<li>Zachtjes de gehomogeniseerde hersenen oplossing aan de bovenkant van de sacharoseoplossing 0,83 M, verzorgen zich niet te mengen de twee lagen toevoegen.</li>
		<li>Evenwicht van elke buis met de sacharoseoplossing 0.32 M.</li>
		<li>Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 45 min bij 4° C met behulp van een geschikte gekoeld vooraf ultracentrifuge rotor. Rotor versnelling en vertraging instelt door hun minimumwaarden om myeline puin verlies.</li>
		<li>Het myeline puin van de interface van de twee sacharose dichtheden verzamelen. 
		Opmerking: puin moet worden weergegeven als een witte band naar het midden van de buis.</li>
		<li>Het ruwe myeline puin te combineren in een tube van 50 mL conische centrifuge en pas het volume aan ongeveer 35 mL met behulp van Tris· Cl-bufferoplossing.</li>
		<li>Meng het ruwe myeline puin met een steriele hand-held roterende homogenizer voor 30-60-s.</li>
		<li>Gelijkmatig verdelen de schorsing tussen 6 schone ultracentrifuge buizen en evenwicht met een juiste hoeveelheid Tris· Cl-bufferoplossing.</li>
		<li>Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 45 min bij 4° C met behulp van een geschikte gekoeld vooraf ultracentrifuge rotor. Rotor versnelling en vertraging aan hun maximale waarden instellen</li>
		<li>Aangezien effen witte pellets nu zichtbaar zijn zal, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 10-15 mL Tris· Cl-bufferoplossing.</li>
		<li>Gelijkmatig verdelen de schorsing tussen 2 schone ultracentrifuge buizen en evenwicht met een juiste hoeveelheid Tris· Cl-bufferoplossing.</li>
		<li>Centrifuge weer bij 100.000 x g voor 45 min bij 4 ° C met behulp van een geschikte vooraf gekoeld ultracentrifuge rotor. Rotor versnelling en vertraging aan hun maximale waarden instellen</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 5-6 mL steriele PBS en verdeel de schorsing tussen een passend aantal vooraf gewogen 1,5 mL micro-centrifuge buizen.</li>
		<li>Centrifuge op 22.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en bepalen het gewicht van de myeline puin pellets.</li>
		<li>Resuspendeer de pellets in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg/mL. 
		Opmerking: tien tot twaalf hersenen is genoeg voor de productie van 10-15 mL 100 mg/mL myeline puin. Myeline puin kunnen winkel bij-80 ° C voor 6 maanden.</li>
	
	
	<li>Myeline puin fluorescerende labeling
	<ol>
		<li>Bereid de 50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) oplossing vlak voor gebruik.<ol>
			<li>Met behulp van steriele PBS, Verdun een 5 mM stockoplossing van CFSE bereid met 100% dimethylsulfoxide (DMSO) naar een werkende eindconcentratie van 50 µM.</li>
			<li>Filtreer de oplossing door een 0,2 µm spuit filter.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ontdooi het gewenste bedrag van 100 mg/mL myeline puin en resuspendeer met een steriele 29 g naald. 
		Opmerking: bevriezing van het myeline puin zal daardoor afhaken oplossing vereisen resuspensie vóór gebruik.</li>
		<li>Myeline puin overbrengen in een vooraf gewogen 1,5 mL micro-centrifuge buis.</li>
		<li>Centrifugeer bij 14.800 x g gedurende 10 minuten bij 4° C. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de myeline puin in 200 µL van CFSE oplossing per 100 µL myeline puin Ingehuld.</li>
		<li>Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) beschermd tegen licht.</li>
		<li>Centrifugeer bij 14.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 600-800 µL van was buffer (0,2 µm filter gesteriliseerde 100 mM glycine in PBS).</li>
		<li>Centrifugeer bij 14.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Herhaal stappen 2.3.8-2.3.9 tweemaal meer.</li>
		<li>Na de definitieve wash, bepalen van het gewicht van de myeline puin pellet en resuspendeer tot 100 mg/mL met steriel PBS. Opmerking: Gelabelde myeline puin kunnen winkel bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden.</li>
	</ol>
	</li>

3. myeline puin fagocytose Assay
Opmerking: Het volgende is de basismethode voor het observeren van fagocytose van fluorescently geëtiketteerde myeline puin. Toevoeging van andere behandelingen en experimentele omstandigheden moet worden geoptimaliseerd door de onderzoeker.
<ol>
	<li>Voorbereiding van behandeling platen
	<ol>
		<li>Voor elke 145 mm plaat, door volwassen BMDMs in een conische centrifugebuis van met 5-6 mL 10 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 15 mL in de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (dPBS) (pH 7.4) te verzamelen. 
		Opmerking: Gebruik geen trypsine aangezien het de activeringsstatus van de cellen18 veranderen kan.</li>
		<li>Voeg een gelijk volume voorverwarmde CMCM aan elke buis van verzamelde cellen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 180 x g gedurende 8 minuten bij 20 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in de CMCM en graaf.</li>
		<li>Voeg aan elk putje van de plaat van een 24-well cel cultuur, 1 x 105 cellen in 1 mL CMCM.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myeline puin behandeling en analyse
	<ol>
		<li>Voeg toe 10 µL van 100 mg/mL CFSE label myeline puin aan elk putje (definitieve concentratie van 1 mg/mL).</li>
		<li>Incubeer gedurende 1-3 uur bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Wassen plaat 3 keer met steriel PBS niet-overspoeld myeline puin te verwijderen.</li>
		<li>Voeg 400 µL van 4% paraformaldehyde toe aan elk putje. Incubeer gedurende 30 min op RT.</li>
		<li>Wassen plaat 2 keer met steriel PBS.</li>
		<li>Voeg 400 µL van Hoechst 33258 oplossing aan elk putje. Incubeer gedurende 5 min op RT beschermd tegen licht.</li>
		<li>Spoel de platen 2 keer met steriel PBS.</li>
		<li>Voeg 200 µL van gefluoreerde-gel met Tris buffer aan elk putje te verminderen photobleaching.</li>
		<li>Afbeelding cellen met behulp van een omgekeerde epi-belichting fluorescerende staat Microscoop. 
		Opmerking: De excitatie en emissie golflengten van CFSE zijn 494 nm en 521 nm, respectievelijk.</li>
		<li>Het getal CFSE positieve cellen delen door het aantal kernen om te bepalen van de relatieve myeline puin opname.</li>
		<li>Voorafgaand aan de beeldvorming, platen voor maximaal 7 dagen bij 4 ° C beschermd tegen licht worden bijgehouden.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. kwantificering van intracellulaire lipiden Via olie rood-O kleuring
Opmerking: Het volgende is de basismethode voor het observeren van intracellulaire myeline-puin-afgeleide lipiden.Het gebruik van CFSE het label van myeline puin wordt niet aanbevolen voor fluorescerende kwantificering van ORO vlekken als gevolg van spectrale overlap. Toevoeging van andere behandelingen en experimentele omstandigheden moet worden geoptimaliseerd door de onderzoeker.
<ol>
	<li>Voorbereiding van kleuringsvloeistoffen
	<ol>
		<li>0,5% olie rood-O (ORO) kleurstofoplossing voor te bereiden.<ol>
			<li>Voeg langzaam 100 mL voor 100% propyleenglycol (1,2-propaandiol) à 0,5 g van ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) tijdens het roeren.</li>
			<li>Verwarm de oplossing bij 95 ° C gedurende 15 minuten of totdat alle grote deeltjes zijn opgelost. 
			Opmerking: geen warmte meer dan 100 ° C.</li>
			<li>Filtreer de oplossing door een stuk papier van de filter terwijl nog warm in een nieuwe ontvanger.</li>
			<li>Toestaan oplossing voor cool overnachting in RT. oplossing kan worden opgeslagen voor maximaal 1 jaar op RT.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>85% propyleenglycol oplossing voor te bereiden.<ol>
			<li>Voeg 85 mL 100% propyleenglycol tot 15 mL ddiH2O. Roer tot het gemengd. Oplossing kan worden opgeslagen voor maximaal 1 jaar op RT.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voorbereiding van behandeling platen
	<ol>
		<li>Voorbereiden van een plaat van de 24-well volgens de methode beschreven in punt 3.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myeline puin behandeling
	<ol>
		<li>Voeg 10 µL van 100 mg/mL myeline puin aan elk putje (definitieve concentratie van 1 mg/mL).</li>
		<li>Incubeer gedurende 1-3 uur bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Wassen plaat 3 keer met steriel PBS tot het verwijderen van niet-verteerde myeline puin. Opmerking: Op dit punt, platen of onmiddellijke fixatie kunnen ondergaan of verse CMCM kan worden toegevoegd, en cellen terug naar incubatie voor extra tijd punten.</li>
		<li>Voeg 400 µL van 4% paraformaldehyde toe aan elk putje. Incubeer gedurende 30 min op RT.</li>
		<li>Wassen plaat 2 keer met steriel PBS dan procced te bevlekken.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO kleuring en analyse
	<ol>
		<li>Wassen van vaste plaat 3 keer met ddiH2O.</li>
		<li>Voeg 400 µL van 100% propyleenglycol aan elk putje en incubeer gedurende 5 min op RT. 
		Opmerking: dit zal verminderen overdracht van ddiH2O.</li>
		<li>Gecombineerd de propyleenglycol en Voeg 400 µL van ORO oplossing aan elk putje.</li>
		<li>Incubeer gedurende 8 minuten bij 60 ° C.</li>
		<li>De ORO-oplossing gecombineerd. Vervolgens 400 µL van 85% propyleenglycol toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 5 minumintes op RT.</li>
		<li>Wash plaat 3 keer met ddiH2O.</li>
		<li>Voeg 400 µL van Hoechst 33258 oplossing aan elk putje. Incubeer gedurende 5 min op RT, beschermd tegen licht.</li>
		<li>Spoel de platen 2 keer met steriel PBS.</li>
		<li>Voeg 200 µL van gefluoreerde-gel met Tris buffer toe aan elk putje.</li>
		<li>Afbeelding cellen met behulp van een omgekeerde epi-belichting fluorescerende staat Microscoop. ORO kan worden beeld met behulp van een standaard Texas rood of DsRed filter set.</li>
		<li>Relatieve lipide retentie te kwantificeren door bepalen de ORO positieve gebied in elk afbeeldingsveld en het te delen door het aantal kernen.</li>
		<li>Handhaven platen voor 7 dagen bij 4 ° C beschermd tegen licht.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li>
<li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li>
<li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+the+importance+of+being+eaten%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+spinal+cord+injury%3A+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li>
<li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve%3A+an+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li>
<li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+activates+FAK%2FAkt%2FNF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380(2010).</li>
<li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li>
<li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition%3A+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain%3A+method+of+myelin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li>
<li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li>
<li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li>
<li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow-derived+Macrophage+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48(2016).</li>
<li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).</li>
<li>Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

De hier beschreven procedures gebruiken zowel vers geïsoleerde ruwe CNS myeline puin en primaire beenmerg-afgeleide macrofagen. Verklein dierlijke uitgaven en raden we beide hersenen en beenmergcellen worden geoogst uit elke muis op het moment van offer. Twee onderzoekers samen te werken kunnen gelijktijdig beide materialen voorbereiden. U kunt ook kunnen hersenen worden opgeslagen bij-80 ° C in PBS aangevuld met antibiotica voorafgaand aan myeline puin isolatie. Het is onze ervaring dat de hersenen in deze voorwaarden v...

Beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) zijn een belangrijke schakel tussen de aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Als antigeen presentatie van cellen (APCs), ze kunnen communiceren met lymfocyten via beide antigeen presentatie en cytokine release1,2,3. Echter als professionele fagocyten is hun primaire functie om ziekteverwekkers, leeftijd cellen, en cellulaire puin1,4te ontruimen. Na een dwarslaesie (SCI), aanzienlijke hoeveelheden van myeline puin is gegenereerd op basis van stervende oligodendrocyten, het celtype verantwoordelijk voor CNS axon myelinisering5. Wij en anderen hebben aangetoond dat Goedkeuringvande myeline puin primair de verantwoordelijkheid is van het BMDMs5,6,7te infiltreren. Echter binnen dwarslaesie is sites engulfment van myeline puin gesuggereerd deze normaal anti-inflammatoire cellen naar een pro-inflammatoire staat5,8,9moeten worden verschoven. Als belangrijkste bemiddelaars van neuro-ontsteking in het ruggenmerg gewonde zijn BMDMs belangrijke klinische doelstellingen.
Om te helpen onderzoeken van de invloed van BMDMs in het gewonde ruggenmerg, hebben we een in vitro model direct bestuderen hoe BMDMs reageren op myeline puin. Ter verbetering van biologische relevantie, worden zowel primaire lymfkliertest BMDMs en vers geïsoleerde myeline puin gebruikt in deze onderzoeken. Als zodanig, de methoden die hier gepresenteerd detail ook de isolatie en de cultuur van primaire lymfkliertest BMDMs, en een gemodificeerde sacharose kleurovergang techniek die gebruikt wordt om te isoleren lymfkliertest CNS afgeleid myeline puin10,11,12. Myeline puin kan gemakkelijk worden aangeduid met een fluorescente kleurstof, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), te volgen die de internalisering door BMDMs. CFSE is geschikt voor deze toepassing omdat het niet-cytotoxische, en de smalle fluorescerende spectrum vergunningen multiplexing met andere tl sondes13,14. Na fagocytose, myeline puin lipiden zijn de lysosomen vervoerd en verpakt als neutrale lipiden in intracellulaire lipide druppels5. Om te kwantificeren deze intracellulaire lipide-accumulatie, presenteren we een olie Red O (ORO) kleuring van de methode die is geoptimaliseerd voor kwantitatieve beeldanalyse. Deze eenvoudige kleuringstechniek produceert robuuste reproduceerbare resultaten en kwantificering15. Deze methoden vergemakkelijken de studie van myeline puin fagocytose en lipide retentie met beperkte gespecialiseerde apparatuur.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Hoge glucose met L-glutamine, natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Oplossing</td></tr><tr><td>New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>Verenigde Staten Oorsprong</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L cel, L-929, afgeleide van Stam L]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Cel Lijn van Geconditioneerde Media Bereiding</td></tr><tr><td>24-well Cel Cultuur Platen</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cel Cultuur Schaal</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polystyreen, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE Cel Proliferatie Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO voor Reconstitutie Meegeleverd</td></tr><tr><td>Fluoro-gel met Tris Buffer&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialen</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Buizen</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Dünnwand, Polypropyleen, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, Zwevende Emmer, Titanium</td></tr><tr><td>Hand Held Roterende Homogenisator</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) zijn rijpe leukocyten, die een essentiële fysiologische rol als professionele fagocyten staat van clearing een scala aan deeltjes te dienen. Normaal BMDMs zijn beperkt van het centrale zenuwstelsel (CNS), maar na een blessure, ze gemakkelijk kunnen infiltreren. Eenmaal binnen de gewonde weefsel van de CNS, BMDMs zijn de primaire celtype verantwoordelijk voor de goedkeuring van letsel-afgeleide cellulaire puin, met inbegrip van grote hoeveelheden van lipide-rijke myeline puin. De neuropathologische vertakkingen van BMDM infiltratie en myeline puin fagocytose binnen de CNS zijn complex en niet goed begrepen. De protocollen die hier beschreven, toestaan voor de studie direct in vitro van BMDMs in het kader van CNS letsel. We dekken lymfkliertest BMDM isolatie en cultuur, myeline puin voorbereiding en testen om te beoordelen BMDM myeline puin fagocytose. Deze technieken robuuste kwantificeerbare resultaten zonder de noodzaak van aanzienlijke gespecialiseerde apparatuur of materialen, maar kunnen gemakkelijk worden aangepast aan de behoeften van onderzoekers.

Behandeling van BMDMs met CFSE het label van myeline puin moet opleveren duidelijk internalisering (Figuur 2). Terwijl een tijd van 3 uur interactie voldoende voor BMDMs is om het phagocytose voldoende toegevoegde myeline puin voor robuuste downstream detectie, kan intracellulaire accumulatie worden waargenomen met zo weinig als 1 uur van interactie. Echter, sommige myeline puin kan nog wel aanwezig op het celoppervlak na het wassen. Dit kan worden veroorzaakt door onvoldoende wassen of deel...

We presenteren de methoden voor de beoordeling van de fagocytische capaciteit van primaire lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van fluorescently geëtiketteerde myeline puin en intracellulaire lipide druppel kleuring.

In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Het algemene doel van dit protocol is om de fagocytose van hersenafgeleide myelinedebris door beenmergafgeleide macrofagen te beoordelen. Dit protocol is ontworpen om sleutelvragen op het gebied van neurotrauma te beantwoorden. Het voordeel van deze methode is dat deze een efficiënte en relatief kosteneffectieve analyse van macrofagenrespons in vitro mogelijk maakt, met name de fagocytische capaciteit van beenmergafgeleide macrofagen voor myelinedebris.Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om de effecten van externe modulatoren te onderzoeken. Nadat de muis is verzadigd met 70% ethanol, maak een opening in de buikhuid. Trek de huid naar achteren om de benen voor dissectie zichtbaar te maken.Zorg ervoor dat u de buikholte niet puncteert tijdens dit proces. Zodra deze zichtbaar zijn, verwijder de benen door bij de enkel en heup te snijden. Plaats de benen in ijskoud PBS aangevuld met antibiotica.Herhaal dit voor het andere been. Was het weefsel in vers ijskoud PBS aangevuld met antibiotica om eventuele deeltjes die zich tijdens de dissectie aan het weefsel hebben gehecht, los te maken. Een zachte schraapbeweging langs de spier zal een groot deel van het ongewenste weefsel losma

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

We beschrijven hoe om te visualiseren macrophage- C. neoformans (Cn) interacties in real time, met bijzondere nadruk op het proces van niet-lytische exocytose middels digitale lichtmicroscopie. Met deze techniek individueel geïnfecteerde macrofagen kunnen worden bestudeerd om verschillende aspecten van dit verschijnsel bepalen.

Visualiseren Non-lytische Exocytosis van Cryptococcus neoformans Van Macrofagen behulp Digital Light Microscopy

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar.

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.

Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen

Het huidige protocol is opgesteld om het effect van herhaalde magnetische stimulatie op het vermogen van microglia om myelineresten te fagocytoseren te beoordelen. Hiervoor is een in vitro microglia en myeline-puin co-cultuursysteem opgezet.

Beoordeling van microgliale fagocytose van myelinepuin in vitro onder herhaalde magnetische stimulatie

Leer hoe beenmerg-afgeleide macrofagen myeline puin fagocyteren in vitro. Deze methode gebruikt fluorescente labeltechnieken om fagocytosecapaciteit te beoordelen bij neurotrauma-onderzoek.

In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

Meer video's verkennen