Name: Hydrodynamische Renal bekken injectie voor niet-virale expressie van eiwitten in de nier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer hydrodynamische injectie in het nierbekken voor nier-specifieke eiwitexpressie bij volwassen muizen. Deze methode biedt een reproduceerbare aanpak voor nefrologisch onderzoek naar genfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Een Career Development Award van het Department of Veterans Affairs [BX002797] gesteund L.E.W. en de National Institutes of Health [R01-DK095867] en American Heart Association [15GRNT25700209] gesteund J.C. De National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] en het Vanderbilt Center for Kidney Disease ondersteund M.H.W. Dit materiaal is het resultaat van werk ondersteund met middelen en het gebruik van de faciliteiten van het VA Tennessee Valley gezondheidszorg systeem.

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+the+Intracellular+Fate+of+Plasmid+DNA+and+Transgene+Expression%3A+ZsGreen1+and+Tissue+Clearing+Method+CUBIC+Are+an+Optimal+Combination+for+Multicolor+Deep+Imaging+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues.</a> PLoS One. 11 (1), e0148233(2016).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).</li>
<li>Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2C+lobe-specific+hydrodynamic+gene+delivery+to+swine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver.</a> Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).</li>
<li>Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2Cintravascular+hydrodynamic+gene+delivery+to+skeletal+muscle+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs.</a> Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).</li>
<li>Alino, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+DNA+delivery+to+whole+pig+cardiac+tissue+by+coronary+sinus+retrograde+injection+employing+non-invasive+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization.</a> J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Woodard, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney-specific+transposon-mediated+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo.</a> Sci Rep. 7, 44904(2017).</li>
<li>Liang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutathione+S-transferase+A4+accelerates+obstruction-induced+tubule+damage+and+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis.</a> Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+insulin-like+growth+factor-1+receptor+in+endothelial+cells+against+unilateral+ureteral+obstruction-induced+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).</li>
<li>Corridon, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+facilitate+and+monitor+expression+of+exogenous+genes+in+the+rat+kidney+using+plasmid+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).</li>
<li>Wallace, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kidney+volume+in+mice+with+polycystic+kidney+disease+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging.</a> Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).</li>
<li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li>
<li>Yeikilis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+based+transfection+in+normal+and+fibrotic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats.</a> World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li>
<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen en verklaren geen belangenconflict.

In dit protocol wordt een robuuste methode om reproduceerbare genexpressie specifiek in de nier beschreven. We hebben het percentage van transfected door deze techniek worden in het bereik van 50-100%, afhankelijk van de leeftijd van de muis en de gevoeligheid van de uitlezing van de transgenic muizen gevonden in de handen van een matig ervaren chirurg. Het niveau van de genexpressie luciferase was boven achtergrond maandenlang in muizen piggyBac transposons ontvangen en volledig onderhouden wekenlang bij immuun...

De hydrodynamische staart veneuze injectietechniek uitgegroeid tot een veel gebruikte manier om hoge niveaus van genexpressie in muis lever1,2te bereiken. De nieren zijn ook door deze techniek op een veel lager niveau, ongeveer 100-fold minder3transfected. De injectie van de hydrodynamische renal bekken hier beschreven biedt een eenvoudige manier om te controleren de specificiteit van orgel expressie via fysieke middelen met behulp van de hydrodynamische beginselen die eerder zijn vastgesteld in de lever4,5 , spier6en andere organen7,8. Deze methode transfects cellen in levende dieren in vivo met behulp van druk en snelheid te dwingen vloeistof met DNA in de cellen, gelijktijdig inducerende schade aan het orgaan dat is snel opgelost9. Met behulp van gevestigde chirurgische technieken om te visualiseren van de nier via een flank incisie10 samen met een enkele injectie door insuline spuit, hebben we gevonden succesvol transfectie van verschillende soorten nier cellen, voornamelijk interstitiële fibroblasten, tubuli en verzamelen kanaal11. Dissectie van deze muizen heeft aangetoond dat andere organen niet hoog genoeg om te visualiseren door luciferase imaging technieken11niveau zijn transfected. Aangezien de techniek niet-virale is, toelaat gebruik van plasmide DNA voor Transfectie snel en gemakkelijk voorbereiding van de reagentia die nodig zijn voor de injectie.
We zijn gewend geraakt gelokaliseerde hydrodynamische injecties geven de antioxidant glutathione S-transferase A4, de insuline-achtige groeifactor-1-receptor en het hormoon Erytropoëtine in de nier, allemaal met de verwachte biologische effecten11, 12 , 13. gedetailleerde evaluatie van de wijze van toediening, geïnjecteerde volume, DNA dosering, en promotor keuze geweest uitgevoerde11. Bovendien is zowel de piggyBac transposon systeem en/of cyclophosphamide behandeling te onderdrukken de immune reactie op de transgenic gebleken om op lange termijn gen expressie resultaten11. Andere onderzoekers hebben een renale ader aanpak in rat met succes, het bereiken van hoge transfectie efficiëntie voor perioden van meer dan een maand14gebruikt. Echter, genetische correctie van fenotypen nabootsen van ziekten bij de mens worden gewoonlijk uitgevoerd bij muizen eerst als een bewijs-van-concept aangezien meest zoogdieren genetische modellen Muismodellen. We vergeleken renale veneuze injectie renal bekken injectie en vond dat de injectie in het bekken renal superieur aan de renale ader voor genexpressie (ongeveer tien keer hoger) en survival11 was. Het bekken renal is een ideale route van binnenkomst in de nier, want het is flexibel genoeg om het dulden van schommelingen in de productie van urine en is vaak kunnen handhaven van de structurele integriteit zelfs wanneer uitgezet tijdens hydronephrosis. Bovendien, injectie in het bekken renal toegang hebben tot de nier zonder het piercing de capsule van de nier, waardoor de ingespoten vloeistof zichtbaar door de nieren beter dan intraparenchymal injectie worden bewaard. Andere organen muis beschikt niet over een route van binnenkomst dan de therapieën, maar de urine ruimte van de nieren is een ideale injectieplaats. Bovendien injectie in de renale ader leidde tot lekkage van bloed in de buikholte. Het volume van de totale nier van wild-type muis nieren is geschat door magnetische resonantie beeldvorming worden ongeveer 0.2 cm3, zodat het volume van een één nier ongeveer gelijk aan de hoeveelheid vloeistof die geïnjecteerd door renal bekken hydrodynamische is injectie (100 µL)15. Hierin, hebben wij beschikbaar gesteld alle van de gedetailleerde nuances van het hydrodynamische renal bekken injectie protocol om reproduceerbare transfectie van de nier.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>Verdovingsmiddel - Niet gecontroleerde stof</td></tr><tr><td>BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>Vereiste spuiten</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Apotheker/Dierarts</td><td></td><td>Analgesie - Gecontroleerde stof</td></tr><tr><td>Dynarex Wegwerpdoek Drape</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Plaats over warmtepad</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Gebruik alleen endotoxine-vrij plasmide DNA</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positief Control</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Positieve controle voor endotoxinetest</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Enkele Testfles</td><td>Charles River</td><td>R13500</td><td>Endotoxinetest</td></tr><tr><td>Extra Fijne Micro Dissectie Schaar</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5882</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Fisherbrand Instant Sealing Sterilisatiezak - 9"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>Voor het autoclaveren van chirurgische instrumenten</td></tr><tr><td>Gaymar Warmtepomp</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>Watercirculerende warmtepomp</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>DS-401</td><td>Om chirurgische instrumenten tijdens de operatie te hergebruiken</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5136</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Graefe Weefselforceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5153</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Halsey Naaldhouder, 5" Lengte</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-7841</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Warmtepads - 15" x 21" - minimaal 3 nodig</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>Voor gebruik met Gaymar Warmtepomp</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>Voor beeldvorming en euthanasie</td></tr><tr><td>Isotec Isoflurane Delivery System Vaporisor</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>Voor beeldvorming en euthanasie</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Apotheker/Dierarts</td><td></td><td>Verdovingsmiddel - Gecontroleerde stof</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Laboratoriumdoekjes</td></tr><tr><td>Living Image software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>Voor beeldvorming van levende dieren</td></tr><tr><td>Luciferine</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>Voor beeldvorming van levende dieren</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>Spectrofotometer voor DNA-meting</td></tr><tr><td>Prevantics Wattens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>Voor huidchirurgie voorbereiding</td></tr><tr><td>Prolene 5-0 hechtdraad Taper 30"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Niet-absorbeerbare hechtdraad voor huid</td></tr><tr><td>Puralube Merk Oogzalf</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>Om ogen vochtig te houden tijdens chirurgie</td></tr><tr><td>Trans IT - QR Hydrodynamische Leveringsoplossing</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>Hydrodynamische leveringsbuffer voor het verdunnen van DNA</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 Hechtingen J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Absorbeerbare hechtingen voor spierlaag</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clippers</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Shaver voor huidvoorbereiding</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>Voor beeldvorming van levende dieren</td></tr></tbody></table>

hydrodynamische renal bekken injectie voor niet-virale expressie van eiwitten in de nier

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Hydrodynamische injectie creëert een lokale, hogedruk omgeving om te transfect verschillende weefsels met plasmide DNA en andere stoffen. Hydrodynamische staart veneuze injectie, bijvoorbeeld, is een gevestigde methode waarbij de lever kan zijn transfected. Dit manuscript wordt beschreven van een toepassing van de beginselen van de hydrodynamische door injectie van de nier van de muis rechtstreeks met plasmide DNA voor nier-specifieke genexpressie. Muizen zijn verdoofd en de nier wordt blootgesteld door een flank incisie gevolgd door een snelle injectie van een plasmide DNA-bevattende oplossing direct in het bekken renal. De naald is op zijn plaats gehouden gedurende tien seconden en de site van de incisie is ingehecht. De volgende dag, live dierlijke imaging, westelijke vlek, of immunohistochemistry kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van genexpressie of andere tests die geschikt is voor de transgenic van keuze worden gebruikt voor detectie van de proteïne van belang. Gepubliceerde methoden te verlengen van genexpressie omvatten transposon-gemedieerde transgenic integratie en cyclofosfamide behandeling om de immuunrespons remmen aan de transgenic.

De chirurgie en injectie techniek zijn eenvoudig uit te voeren, eenmaal beheerst, waarvoor geen belangrijke apparatuur of dure materialen. Als nieuw aan de flank-incisie nier chirurgie, worden één trainingsdag op verschillende muizen gepland voor euthanasie mag waarin de muizen niet herstelde volgende operatie zijn omdat de eerste poging tot deze operatie veel langer dan normaal duurt. Als alternatief, onderzoekers bekend zijn met soortgelijke technieken kunnen vinden het heel simpel. Vol...

Dit protocol beschrijft een methode om te injecteren plasmide DNA in de nier van de muis via de renal bekken te produceren transgenic expressie specifiek in de nier.

Hydrodynamische Renal bekken injectie voor niet-virale expressie van eiwitten in de nier

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

Het algemene doel van deze chirurgische procedure is om eiwitexpressie te produceren van plasmide-DNA in de nieren van volwassen muizen. Deze methode is een nieuwe tool om sleutelvraagstukken in de nefrologie aan te pakken, zoals hoe de expressie van een eiwit van belang de nieren van volwassenen beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eiwitexpressie op een reproduceerbare manier produceert, specifiek in de nier, in tegenstelling tot andere methoden die ook genexpressie in andere organen kunnen produceren.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat injectie van de nierbekken vereist zorgvuldige blootstelling en snel moet worden uitgevoerd om het plasma-DNA in de cellen te laten komen. Begin met het resuspenderen van plasmide-DNA in de hydrodynamische afgiftepuffer. Plaats de muis op een met water gecirculeerde hittepad bedekt met een blauwe pad.Gebruik een scheerapparaat dat is ontworpen voor het verzorgen van huisdieren om de linkerkant van de achterkant van de muis van schouder tot billen en flank tot ruggengraat te scheren. Reinig loszittend haar en puin en breng vetzalf in beide ogen aan om hoornvliesuitdroging te voorkomen. Bereid nu 100 microliter bevattend 10 tot 50 microgram verdund plasmide-DNA in een aparte spuit voor elke muis die is verdoofd, en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.De naald moet permanent worden bevestigd zonder veiligheid. Voorafgaand aan het uitvoeren van de operatie, leeg steriele chirurgische gereedschappen zonder aanraking op een steriele lade die op de hittepad is geplaatst. Neem nu de muis op en plaats deze in een verlicht veld van zicht.Verwijder uit de verpakking 3,15% chlorhexidine gluconaat en 70% isopropylalcohol huidantiseptische tampons en plaats deze in de buurt van het dier. Draag steriele chirurgische handschoenen en begin vanaf de incisieplaats, veeg het dier af met een nieuwe chlorhexidine alcohol tampon, drie keer in een cirkelvorkige beweging. Zoek nu de plaats van de incisie.Kneip de huid met een pincet en snijd met een schaar de huidlaag ongeveer een centimeter van de ruggengraat, onder de ribbenkast. Maak nog een centimeter snede in de spierlaag. Localiseer de nier en zonder het aan te raken, stel het voorzichtig bloot uit de buikholte door een gestage, zachte druk op de buik met de vingers uit te oefenen.Het blootleggen van de nier is soms moeilijk. Oefen zachte druk uit op de buik en ruggengraat om schade aan de milt te voorkomen. Als er andere organen dan de nier naar buiten komen, breng ze dan voorzichtig terug in de lichaamsholte met behulp van gesloten pincetten indien nodig.Scheiden vervolgens de nier voorzichtig van het omliggende vet tot het punt waarop het nierbekken zichtbaar is, wat kan worden gezien als een kleine witte stip. Na het visualiseren van het nierbekken, gebruik gesloten pincetten om op de rechterkant van de nier te drukken, zodat het nierbekken in zicht blijft. Grijp vervolgens de geladen insulinesyringe in de rechterhand door deze parallel aan het werkoppervlak vast te houden en steek de naald voorzichtig in het nierbekken.Zodra de naald is ingebracht, injecteer de oplossing snel, binnen drie seconden. Laat de naald ongeveer 10 seconden op zijn plaats blijven om te voorkomen dat de oplossing terugstroomt. Verwijder vervolgens de naald langzaam en voorzichtig en breng het orgaan terug in de buikholte door de plaats van de incisie voorzichtig te strekken met behulp van gesloten pincetten.Nu naai de spierlaag met vijf-o absorbeerbare hechtingen en plaats twee tot vier onafhankelijke knopen. Naai eveneens de huidlaag met vijf-O of zes-O niet-absorbeerbare nylon hechtingen en plaats twee tot vier onafhankelijke knopen. Om de transfectie-efficiëntie te beoordelen, introduceer 10 microgram van een luciferase-expresserend plasmide naar het verdunde DNA voor injectie om levende dierbeeldvorming uit te voeren, de volgende dag.Plaats de eerste kooi met muizen in de kamer en sluit deze af. Zodra verdoofd, injecteer elke muis intra-peritoneal met 100 microliter ontdooid luciferine en noteer de tijd. Selecteer de juiste gebruikers-ID en klik vanuit de bovenste menubalk op verwerving en selecteer automatisch opslaan twee uit het vervolgkeuzemenu.Initialiseer het systeem door op initialiseren te klikken. Wacht tot het initialiseren is voltooid en verander het gezichtsveld naar D, om vijf muizen te beelden. Zorg ervoor dat de dieren in de gewenste volgorde zijn geplaatst en dat hun ruggen naar de camera zijn gericht om de nier te visualiseren.Druk vervolgens vijf minuten na de injectie op verwerven om de afbeelding te maken. Na de verwerving verwijdert u de muizen uit de beeldvormingsmachine. Schakel het gas uit.Reinig de kamer, neuskams en het beeldvormingsplatform. Om de gegevens te analyseren, klikt u na het klikken op ROI-hulpmiddelen op het cirkelpictogram en selecteert u een op het vervolgkeuzemenu om nieuwe ROI in de afbeelding te plaatsen, zoals aangegeven door een rode ovale met vier vierkanten eromheen. Om de grootte van de ROI aan te passen, plaatst u de cursor over een rood vierkant en sleept u deze om het paarse gebied dat de geïnjecteerde nier overlapt te omsluiten.Klik nu met de rechtermuisknop op deze ROI en selecteer dubbele ROI om de ROI in het huidige venster te dupliceren en deze naar de volgende muis te verplaatsen. Nadat alle ROI's vanuit het menu direct boven de afbeelding zijn geplaatst, verandert u de eenheden van tellen naar stralende fotonen. Maak ten slotte een spreadsheet van de metingen door de ROI-gegevens uit de gereedschapspalet te exporteren door op ROI-hulpmiddelen te klikken en vervolgens op het potlood en liniaalpictogram.De specifieke genexpressie van de nier van reporter-plasmiden wordt getoond. Alle muizen werden geïnjecteerd met pTet-plasmide dat versterkte vuurvliejeluciferase tot expressie brengt, terwijl muizen twee, drie en vijf ook werden geïnjecteerd met pEF

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Gupta, K., et al. Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the intrarenal injection of E. coli into the renal pelvis of an anesthetized rat to induce a localized kidney infection, modeling acute pyelonephritis. It highlights key surgical steps and aseptic techniques necessary for establishing a reproducible in vivo infection model for downstream analysis.

Intrarenal Injection of E. coli into the Renal Pelvis of a Rat

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

In this video, we present the protocol for hydrodynamic injection of plasmids into the renal pelvis of the mouse kidney for nucleic acid transfection. This technique allows organ-specific delivery of plasmids by utilizing the principle of high hydrostatic pressure, which forcefully drives the plasmids into the specific site without causing tissue injury.

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection: A Technique to Directly Deliver DNA into Kidney Cells of Murine Model

In this video, we demonstrate intra-renal drug administration in rats via the renal artery. This method is beneficial in improving drug targeting, drug potency, and minimizing systemic toxicity.

Intrarenal Drug Delivery in Rats: A Method to Deliver Therapeutic Drugs in Rat Kidney via Intra-arterial Injection

Hier presenteren we een protocol om bestemmingskaarten en lijntracers te gebruiken om injecties in individuele blastomeren te richten die aanleiding geven tot de nier van Xenopus laevis embryo's.

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Renal verwondingen opgelopen van nephrotoxins, die drugs, variërend van antibiotica tot chemotherapeutica omvatten, kan leiden tot complexe aandoeningen waarvan de pathogenese blijft onvolledig begrepen. Dit protocol laat zien hoe zebravis kan worden gebruikt voor ziektemodel van deze aandoeningen, die kunnen worden toegepast voor het identificeren van renoprotectieve maatregelen.

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

De toediening van geneesmiddelen voor het herstel van de nierfunctie vereist beheersing van de lokalisatie en verdeling van de therapeutische verbinding. Hier beschrijven we in detail een eenvoudige techniek voor intrarenale toediening van geneesmiddelen bij ratten. Deze procedure kan gemakkelijk worden uitgevoerd zonder sterfte en hoge reproduceerbaarheid.

Intravasculaire Levering van Biologics aan de Rat Kidney

Dit manuscript beschrijft een chirurgisch model bij ratten van pyelonefritis door directe intra-renale infectie met Escherichia coli in de nierbekken. De experimentele procedure kan worden gebruikt om de pathogenese van pyelonefritis te bestuderen, evenals de geassocieerde ontsteking en fibrose.

Intrarenale injectie van Escherichia coli In een Rat Model van Pyelonefritis

Dit manuscript beschrijft een methode voor gerichte levering aan een enkele nier via een katheter die in de infrarenale abdominale aorta in de muis wordt geplaatst.

Directe medicijnafgifte aan de nier via de nierslagader

Hier leveren we exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen aan de nier via staartaderinjectie van een niet-virale vector en polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen. Dit leidde tot significante overexpressie van doelmiRNA in de nier, wat resulteerde in geremde progressie van nierziekte in verschillende muismodellen.

Levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen

Dit rapport beschrijft de gelokaliseerde injectiemethode van AAV-vectoren via het nierbekken voor effectieve en veilige genoverdracht naar de nier van de muis.

Effectieve en veilige genafgifte aan de nier van de muis via langzame retrograde injectie van nierbekken van adeno-geassocieerde virusvectoren

Leer hydrodynamische injectie in het nierbekken voor nier-specifieke eiwitexpressie bij volwassen muizen. Deze methode biedt een reproduceerbare aanpak voor nefrologisch onderzoek naar genfunctie.

Hydrodynamische Renal bekken injectie voor niet-virale expressie van eiwitten in de nier

Meer video's verkennen