Name: Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Leer een celvrije fluorimetrische enzymatische assay voor high-throughput meting van lipide peroxidatie in HDL. Deze methode helpt onderzoekers bij het betrouwbaar bepalen van HDL-functie in cardiovasculaire en metabole ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor het werk van Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman en Srinivasa Reddy voor hun sleutelrol in de ontwikkeling van eerdere iteraties van dit model. T.A.A. wordt ondersteund door een RMIT University Vice-kanselier van postdoctorale Fellowship. AJ en AH worden ondersteund door NHMRC projectsubsidie 1108792. TK wordt ondersteund door NIH grants NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

alle experimenten met behulp van de menselijke biologische monsters werden uitgevoerd met goedkeuring van de ethiek aan de Universiteit van California Los Angeles, Los Angeles en het Comité van de menselijke ethiek van Alfred Hospital, Melbourne.
 Opmerking: er zijn vele variaties van de fluorescerende HDL functie Assay (zie discussie) 32. Hieronder beschrijven we het protocol dat de meest consistente en reproduceerbare resultaten oplevert. Een overzicht van de bepaling is afgebeeld in Figuur 2.
 1. verwerking van het specimen <ol><li>Gebruik verse, niet-hemolyzed serum (kan worden geïnd in serum scheidingsteken buizen) of citraat plasma verkregen na 12-14 uur vasten. Als met behulp van cryopreserved monsters, omvatten passende controlemaatregelen zoals beschreven in dit Protocol.</li>
</ol> 2. Dag 0-voorbereiding voor de assay <ol><li>voorbereiden werken lay-out van het experiment met de juiste besturingselementen, monsters en repliceert. Elk monster ten minste in triplicates uitgevoerd. Een lay-out goed vertegenwoordiger 96 is afgebeeld in Figuur 3.</li>
	<li>Berekenen alle volumes van de reagentia die zal worden gebruikt voor de bepaling op basis van aantal monsters en replicaten. 
	Opmerking: Een extra 10% volumes opnemen in elk bestand werkend om ervoor te zorgen dat er genoeg volume voor elke reagens voor de specifieke experiment is.</li>
	<li>Alle benodigde buizen voor alle verschillende stappen van de assay BV voor de scheiding van HDL, meting van de HDL-C (optioneel) en het fluorochromeassay label.</li>
</ol> 3. Dag 1-voorbereiding van de controles <ol><li>voorbereiding van studie-specifieke gegroepeerde besturingselement <ol><li>maken een controlemonster van gebundelde plasma of serum van alle studie monsters. Als 20 voorbeelden uitvoeren in elke plaat in drievoud, combineren 10 µL van elk monster in een besturingselement 200 µL gebundeld. Een aparte hoeveelheid van deze gebundelde controle geven het klinisch laboratorium de HDL-C waarde van dit besturingselement te bepalen. 
		Opmerking: Gebruik deze gebundelde controle om de bepaling te standaardiseren en rekening voor alle mogelijke bekende (b.v. type matrix serum versus plasma, cycli bevriezen-ontdooien, cryopreservatie) en onbekende verstrengeling die invloed kunnen hebben op de experimentele variabiliteit 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>Voorbereiding van de controle van de kwaliteit van de laboratorium-specifieke (QCs) <ol><li>bereiden een grote voorraad van HDL in elk laboratorium (bijvoorbeeld HDL geïsoleerd van 5 mL plasma van 10 gezonde donoren) en verschillende hoeveelheden van dit cryopreserve voorraad te minimaliseren cycli bevriezen-ontdooien.</li>
		<li>Gebruik ten minste 10 verschillende repliceert uit deze voorraad om te bepalen van de gemiddelde waarde van HDLox. Een acceptabel bereik liggen van de gemeten HDLox waarden voor elk monster van de QC opgenomen in elke bepaling is binnen &#60; 15% van de variatiecoëfficiënt van deze gemiddelde waarde.</li>
		<li>Geven een aparte hoeveelheid van deze gebundelde controle aan het klinisch laboratorium om te bepalen van de HDL-C waarde van dit besturingselement (bijvoorbeeld 40 mg/dL). 
		Opmerking: Een gedetailleerde aanpak van het gebruik van bloed van bloedbanken om deze besturingselementen te maken eerder geweest beschreven 27 , 28 , 32. Gebruik extra QCs zo nodig (bv ene een gezonde donor bekend dat normale HDL-functie en een van een donor bekend dat grotendeels abnormale functie van de HDL.</li>
	</ol></li> <li>Optimalisatie van achtergrond signaal en lege waarden (optioneel) <ol><li>te minimaliseren achtergrond, voeg de juiste hoeveelheid katalase (1-4 U/mL) in het incubatie-medium voor het snel verwijderen van het gevormde H 2 O 2 als gevolg van spontane lucht oxidatie van de buffers. 
		Opmerking: Aangezien de waarden uit de lege putten (geen HDL) zijn wordt afgetrokken van de waarden van de HDL-monsters en de resultaten worden gerapporteerd ten opzichte van een gebundelde controle (die is opgenomen in de dezelfde 96 goed plaat), we hebben gevonden dat deze stap niet praktisch bren doet t de resultaten. Dus, optimalisatie van het signaal van de achtergrond met katalase kan worden weggelaten, indien nodig.</li>
	</ol></li></ol> 4. Dag 1-scheiding van HDL Cholesterol HDL neerslag met Opmerking: gebruik van een commercieel beschikbare gestandaardiseerde HDL Cholesterol neerslagmiddel reagens te isoleren van apoB uitgeput serum volgens de fabrikant &#39; s instructies. Deze reagentia worden veel gebruikt in colorimetrische testen om te bepalen van de HDL-cholesterolgehalte.
<ol><li>Plasma of serum monster vers gebruiken (of ontdooien).</li>
	<li>Meng gelijke delen (bijvoorbeeld 80 µL) van plasma en HDL Cholesterol Precipiterend reagens (20% w/v polyethyleenglycol in glycine buffer met een pH van 10.0 (25 ° C)).</li>
	<li>Mix goed door omhoog en omlaag pipetteren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 1000-2000 x g gedurende 10 minuten</li>
	<li>Gecombineerd het supernatant (HDL-Fractie).</li>
	<li>Idealiter gebruik onmiddellijk de geïsoleerde HDL voor de fluorochromeassay van HDL lipide peroxidatie. Echter als verschillende monsters worden uitgevoerd in dezelfde dag en andere stappen, zoals meting van de concentratie van HDL-cholesterol ook worden uitgevoerd, dan slaan de geïsoleerde HDL bij 4 ° C en de volgende dag gebruiken voor de functie van fluorochromeHDL Assay.</li>
</ol> 5. Dag 1-Determination of HDL-C in geïsoleerde HDL Opmerking: dit is optioneel als de waarde van de HDL-C van het klinisch laboratorium door HDL-C bedrag wordt gebruikt om te normaliseren HDLox.
<ol><li>Quantify de HDL-cholesterol uit plasma, met behulp van standaard colorimetrische 27 testen. Voeg 50 µL van Cholesterol reagens in elk putje en bepalen de cholesterol concentratie met behulp van een colorimetrische afleesapparaat en een cholesterol standaard voorzien in elke kit.</li>
</ol> 6. Dag 2-bereiding van reagentia <ol><li>HRP bereiden en cholesterol oplossingen van HRP 5 U/mL oplossing (Range 1-10 U/mL).</li>
	<li>Bereiden 20 mM fluorescerende (bijvoorbeeld Amplex rood) oplossingen: een flacon van fluorescerende reagens en DMSO op kamertemperatuur ontdooien. Vóór gebruik, ontbinden fluorescerende reagens (1 mg) in 200 µL van DMSO. Opslaan van de stockoplossing bevroren op &#8804;-20 ° C, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Bereiden van positieve en negatieve controles: gebruik 1 X &#39; reactie buffer &#39; zonder cholesterol en 20 mM H 2 O 2 werkoplossing als een negatieve en positieve controles, respectievelijk.</li>
</ol> 7. Dag 2-fluorescerende Assay <ol><li>toevoegen 50 µL van 1 x reactie buffer als blanco (negatieve controle).</li>
	<li>Optioneel: 20 mM werkende oplossing van H 2 O 2 toevoegen als positieve controle in elke plaat.</li>
	<li>Minimaliseren van experimentele variabiliteit en ervoor zorgen dat toevoeging van reagentia en monsters consequent zijn gedaan en in een tijdig, het uitvoeren van alle toevoegingen voor samples in een afzonderlijke 96 goed ronde onderkant, zuivere, polystyreen of polypropyleen plaat (plaat 1). Gebruik vervolgens een meerkanaalspipet overbrengen van bepaalde volumes naar 3 96-wells-platen (2-4 platen: polypropyleen, platte botTom, zwart) (die hebben dezelfde lay-out) ( Figuur 2, Figuur 3).
	<ol><li>Bijvoorbeeld eerst het toevoegen van 160 µL van geïsoleerde HDL in elk goed/monster van plaat 1 en vervolgens met behulp van een meerkanaalspipet Breng 50 µL van HDL-cholesterol van elk goed/monster in de zwarte 96-wells-platen. Tips tussen elke rij/kolom wijzigen niet gefiltreerd geboden tips te gebruiken voor alle overdrachten.</li>
	</ol></li> <li>Verlaten monsters in de putjes. Gooi niet. Er zijn geen wassen stappen tussen toevoeging van reagentia.</li>
	<li>Toevoegen 50 µL van HRP oplossing 5 U/mL (0,25 U) aan elk putje. 
	NB: Gebruik HRP vóór de toevoeging van het fluorescerende reagens.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Gooi niet monsters na incubatie (geen wassen stappen tussen toevoegingen van reagentia).</li>
	<li>Toevoegen 50 µL van fluorochromereagent voor een eindconcentratie van 300 µM. Op dit punt, de totale reactie volume is 150 µL. Meng goed en beschermen tegen licht.</li>
	<li>Beoordelen de fluorescerende uitlezing (in het donker) elke minuut meer dan 120 minuten bij 37 ° C met een fluorescerende afleesapparaat (530/590 nm filters). 
	Opmerking: Gebruik een korter interval van 60 minuten met verse monsters. We hebben gevonden dat 120 minuten durende test geeft meer reproduceerbare gegevens met het gebruik van cryopreserved monsters.</li>
	<li>Opnemen van gegevens met behulp van geschikte software.</li>
</ol> 8. Dag 3-Data analyse <ol><li>fluorescentie (willekeurige eenheden) opnemen op 120 minuten na toevoeging van het fluorescerende reagens voor alle monsters met inbegrip van lege wells en alle besturingselementen.</li>
	<li>Berekening van de gemiddelde waarde van fluorescentie eenheden (op basis van ten minste triplicates) (HDL ox_sample). Neem geen uitschieters (&#62; 2 SDs van de gemiddelde waarde) in aanmerking.</li>
	<li>Aftrekken de achtergrond fluorescentie met behulp van de volgende vergelijking: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg" /></li> <li>normalisatie voor HDL cholesterol (HDL-C): de HDLox lipide peroxidatie waarde voor elk monster (met inbegrip van het gegroepeerde besturingselement) normaliseren door de HDL-C) (mg/dl). Via de sectie voor resultaten, wordt HDL ox gepresenteerd als n (HDL-C) HDLox maatregel aan de aanpassing voor HDL-C. De volgende vergelijking gebruiken: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg" /></li> <li>standaardiseren van de expressie van HDLox lipide peroxidatie waarde van elk monster tegen de waarde van een gebundelde controle. Normaliseren de n (HDL-C) HDLox lipide peroxidatie waarde voor elk monster (gecorrigeerd voor HDL-C) door de n (HDL-C) HDLox lipide peroxidatie waarde van het gegroepeerde besturingselement. Via de sectie voor resultaten, wordt HDL ox gepresenteerd als nHDL ox maatregel aan de aanpassing voor experimentele variabiliteit en HDL-C. De volgende vergelijking gebruiken: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg" /> Opmerking: deze benadering is vergelijkbaar met andere gevestigde experimentele benaderingen om experimentele variabiliteit van metingen, zoals International genormaliseerd ratio (INR) 44 , 45. Deze aanpak is gevalideerd in klinische studies 32 , 33 , 34 , 35, , 36 , 37 , 38 , 39.</li> <li>kwaliteitscontrole van experimentele resultaten met behulp van standaard kwaliteit controlemonsters uitvoeren. Elk laboratorium dient zijn eigen kwaliteitscontroles (QCs) vastgesteld. Ideaal is er een QC voor nHDLox uit een monster met bekende disfunctionele HDL en een QC voor nHDLox uit een monster van gezonde donoren [bv gebruik gepoolde monster van jonge volwassenen die zijn gevestigde bloedbank donoren en hebben geen bekende comorbiditeit en risicofactoren voor hart-en vaatziekten met inbegrip van rookvrije]. Het laatste besturingselement standaardiseert resultaten tussen verschillende laboratoria. De gemiddelde waarden van deze QCs zijn vastgesteld op basis van ten minste 5 wordt gerepliceerd (meestal gebruiken we 10 replicatieonderzoeken voor deze belangrijke stap).
	<ol><li>Check of gemeten QCs in elke assay hebben waarden binnen het verwachte bereik van waarden. Uitgaande van een aanvaardbare maximale experimentele variabiliteit van 15%, moeten alle gemeten experimentele waarden vallen binnen 15% van de bekende gemiddelde waarden van gevestigde QC. De volgende vergelijkingen gebruiken: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg" /> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg" /> Opmerking: als een van de meegeleverde kwaliteitscontrole monsters () normaal versus disfunctionele HDL) geeft HDLox waarden buiten verwachte bereik (opgericht in elk laboratorium) dan herhaal het experiment.</li>
	</ol></li> <li>Uitvoeren van kwaliteitscontrole van experimentele resultaten met behulp van de variatiecoëfficiënt (CV) te kwantificeren van experimentele variabiliteit: Herhaal alle monsters met AVK % &#62; 15%. De volgende vergelijking gebruiken: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg" /> Opmerking: een typische intra-assay (binnen de dezelfde plaat) en de Inter assay (onder verschillende platen) experimentele variabiliteit is &#60; 15%. 2) een typische intra-assay CV is tussen 1-7% en een typische interassay CV tussen 3-10 ligt %.</li>
</ol>

Dit protocol en de kwantitatieve analyse zijn relevant voor de patent PCT/US2015/018147.

Het protocol hier beschreven biedt een krachtige tool om belangrijke onderzoeksvragen met betrekking tot de rol van HDL functie in atherosclerose en ziekten bij de mens te beantwoorden. De assay kwantificeert de HDL lipide-peroxidegehalte per mg HDL-C met behulp van enzymatische versterking (HRP). Deze aanpak voorkomt bekende beperkingen van voorafgaande HDL functie tests (bv de cholesterol efflux assay) met inbegrip van aanzienlijke heterogeniteit met betrekking tot de soorten cellen gebruikt, soort uitlezing gemeld, ge...

Atherosclerotische cardiovasculaire ziekte (CVD) is de belangrijkste oorzaak voor overlijden wereldwijd1,2. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat lage niveaus van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol over het algemeen omgekeerd geassocieerd met het risico voor de ontwikkeling van atherosclerose1,2 zijn. Hoewel verscheidene studies een atheroprotective rol voor HDL1,2 ondersteunen, is het mechanisme waarmee HDL de initiatie en de vooruitgang van atherosclerose verzwakt complexe 3,4. Dus is er gesuggereerd dat de complexe structuur en functie van HDL in plaats van absolute niveau atherosclerose 5,6,7,8nauwkeuriger kunnen voorspellen. Verschillende HDL eiwitten en lipiden compositorische wijzigingen die afbreuk doen aan HDL functie optreden in inflammatoire toestanden zoals atherosclerose. Deze i) verminderen de cholesterol efflux potentiële 9, ii) afname van de anti-inflammatoire en verhoging van de HDL-geassocieerde pro-inflammatoire eiwitten 6,7, iii) daling antioxidant factor niveaus en activiteit en HDLs mogelijkheid voor de remming van de oxidatie van Low Density lipoproteïne (LDLox)10 en iv) verhogen lipide butylhydroperoxide inhoud en redox activiteit (HDLox)9,11. Robuuste testen die evalueren van de functies van de pleotropic van HDL (zoals cholesterol efflux, antioxidant functie) kunnen aanvulling bepaling van HDL-HDL-C in de kliniek.
HDL functie wordt meestal beoordeeld door cel-gebaseerde methoden zoals de cholesterol efflux assay8,12,13,14. Deze methoden hebben grote beperkingen, met inbegrip van aanzienlijke heterogeniteit met betrekking tot de soorten cellen gebruikt, soort uitlezing gemeld, gebrek aan standaardisatie en storende effecten van triglyceriden 7,15. Deze nadelen opleveren moeilijkheden voor grote klinische studies16. Cel-gratis testen kunnen krachtiger maatregelen van HDL functie ten opzichte van cel-gebaseerde testen geven. De cholesterol efflux is een van de belangrijkste functies van HDL hebt, maar het kan alleen worden bepaald door de cel-gebaseerde testen. Andere benaderingen om HDL functie zoals proteomics17,18,19,20,21,22,23, 24 en cel-gebaseerde monocyt chemotaxis vitrotests van HDL functie 17,22,25 niet zijn gestandaardiseerd en kan niet worden gebruikt in grootschalige menselijke studies.
HDL is een belangrijke antioxidant atheroprotective effect5,6,7,8. De antioxidant functie van HDL is in aanwezigheid van LDL in vorige cel gratis fluorimetrische analyses 26vastgesteld. Deze biochemische fluorimetrische methoden van HDL anti-oxidant functie werden oorspronkelijk ontwikkeld door Mohamad Navab en Alan Fogelman en hun collega's-26. Hoewel veel menselijke studies deze methoden gebruikt hebben om te bepalen van HDL functie 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipide (HDL)-lipide (LDL) en lipide-fluorescerende interacties kunnen reproduceerbaarheid van deze cel gratis niet-enzymatische biochemische tests van HDL functie27,28beperken.
Recente interesse heeft gericht op de functionele gevolgen van HDL oxidatie die is het resultaat van oxidatie van lipiden en eiwitten binnen HDL 27,29,30. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat oxidatie van HDL schaadt HDL functie 27,29,30. HDL is een belangrijke rol in de peroxide lipidentransport en hoge hoeveelheid lipide-peroxiden is gerelateerd aan de abnormale functie van de HDL. Dus kan HDL lipide peroxidegehalte worden gebruikt om te bepalen van HDL functie 9,17,20,31 en gezien de bekende beperkingen van voorafgaande tests van HDL functie7, 15,27,32, ontwikkelden we een alternatieve fluorimetrische methode HDL lipide peroxidegehalte (HDLox) 32 kwantificeert. Deze methode is gebaseerd op het enzym horseradish peroxidase (HRP) en de fluorescerende Amplex rood dat de lipide peroxidegehalte per HDL-C 32mg (zonder cholesterol oxidase) kunnen kwantificeren. De biochemische principe van de test is afgebeeld in Figuur 1. We hebben aangetoond dat deze fluorescentie gebaseerde benadering niet over de beperkingen van de voorafgaande HDL functie tests27,28 beschikt. Deze bepaling is verder verfijnd en gestandaardiseerd in ons laboratorium, zodat het op betrouwbare wijze kan worden gebruikt in grootschalige menselijke studies zelfs met cryopreserved plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. de uitlezing van deze bepaling wordt geassocieerd met uitlezingen van gevalideerde cel-gebaseerde tests, surrogaat maatregelen van hart-en vaatziekten, systemische ontsteking, immuun disfunctie en bijbehorende risico van cardiovasculaire en metabole fenotypes 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. hier, beschrijven we deze eenvoudige, maar robuuste methode voor het meten van HDL lipide peroxidegehalte (HDLox). Deze test kan worden gebruikt als een instrument om belangrijke onderzoeksvragen met betrekking tot de rol van HDL functie in ziekten bij de mens te beantwoorden waar systemische ontstekingen en oxidatieve stress geoxideerde vetten hebben een belangrijke rol (zoals atherosclerose)32.

<table><tbody><tr><td>Experimentele Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL PEG (Polyethyleen Glycol) Precipiterend Reagens</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red reagens.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le;&ndash;20&deg;C &bull; Bewaar in een droge plaats &bull; Beschermen tegen licht</td></tr><tr><td>DMSO.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le;&ndash;20&deg;C &bull; Bewaar in een droge plaats &bull; Beschermen tegen licht</td></tr><tr><td>Paardenradijs Peroxidase (HRP)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le;&ndash;20&deg;C &bull; Bewaar in een droge plaats &bull; Beschermen tegen licht</td></tr><tr><td>Cholesterol Esterase.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le;&ndash;20&deg;C &bull; Bewaar in een droge plaats &bull; Beschermen tegen licht</td></tr><tr><td>Cholesterol Referentiestandaard</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le;&ndash;20&deg;C &bull; Bewaar in een droge plaats &bull; Beschermen tegen licht</td></tr><tr><td>Resorufin fluorescentie Referentiestandaard</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le;&ndash;20&deg;C &bull; Bewaar in een droge plaats &bull; Beschermen tegen licht</td></tr><tr><td>5x Reactie Buffer.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le;&ndash;20&deg;C &bull; Bewaar in een droge plaats &bull; Beschermen tegen licht</td></tr><tr><td>HDL Cholesterol Geautomatiseerd Reagens</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Kunststof gereedschap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well platen (polypropyleen, platte bodem, helder).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>96-well platen (polypropyleen, platte bodem, zwart).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, steriel</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Multikanaals Pipetten, 8-kanaals, 125&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>&nbsp;14-387--955</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 software</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Plate reader</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische assay voor high-throughput meting van lipide peroxidatie in high density lipoproteïne

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Lage high-density lipoproteïne (HDL-C) cholesterolgehalte zijn een van de meest krachtige onafhankelijke negatieve voorspellers van atherosclerotische cardiovasculaire ziekte (CVD). De structuur en functie van HDL in plaats van HDL-C kunnen nauwkeuriger voorspellen atherosclerose. Verschillende HDL eiwitten en lipiden compositorische wijzigingen die afbreuk doen aan HDL functie optreden in inflammatoire toestanden zoals atherosclerose. HDL functie wordt meestal bepaald door cellen gebaseerde testen zoals cholesterol efflux assay maar deze testen hebben talrijke nadelen gebrek aan standaardisatie. Cel-gratis testen kunnen krachtiger maatregelen van HDL functie ten opzichte van cel-gebaseerde testen geven. HDL oxidatie schaadt HDL functie. HDL is een belangrijke rol in de peroxide lipidentransport en hoge hoeveelheid lipide-peroxiden is gerelateerd aan de abnormale functie van de HDL. Lipide-sonde interacties moeten worden beschouwd wanneer het interpreteren van de resultaten van de niet-enzymatische fluorescentie testen voor het meten van de lipide oxidatieve staat. Dit motiveerde ons een cel-vrije biochemische enzymatische methode voor de beoordeling van HDL lipide peroxidegehalte (HDLox) dat aan HDL dysfunctie bijdraagt te ontwikkelen. Deze methode is gebaseerd op het enzym horseradish peroxidase (HRP) en de fluorescerende Amplex rood dat (zonder cholesterol oxidase) de lipide peroxidegehalte per mg HDL-C. kwantificeren kan Hier is een protocol describedfor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie waarbij de fluorescerende reagens gebruikt. Assay variabiliteit kan worden verminderd door strikte standaardisatie van experimentele omstandigheden. Hogere HDLox waarden worden geassocieerd met verlaagde HDL anti-oxidant functie. De uitlezing van deze bepaling wordt geassocieerd met uitlezingen van gevalideerde cel-gebaseerde tests, surrogaat maatregelen van hart-en vaatziekten, systemische ontstekingen, immuun disfunctie en bijbehorende risico van cardiovasculaire en metabole fenotypen. Deze technische aanpak is een robuuste methode te beoordelen van HDL functie in ziekten bij de mens waar systemische ontstekingen en oxidatieve stress geoxideerde vetten een belangrijke rol (zoals atherosclerose hebben).

50 µL van elk monster HDL worden toegevoegd aan elk putje zoals in stap 7.3. 50 µL van HRP oplossing 5 U/mL (0,25 U) zijn vervolgens toegevoegd aan elk putje zoals in stap 7.5. Monsters worden gedurende 30 minuten bij 37 ° C als in stap 7.6 geïncubeerd. 50 µL van fluorescerende reagens worden vervolgens toegevoegd in elk putje zoals in stap 7.7 (eindconcentratie van 300 µM). De fluorescerende uitlezing (in het donker) wordt vervolgens beoordeeld voor elke minuut meer dan 120 minuten bij 3...

Hier beschrijven we een fluorimetrische cel-vrije biochemische bepaling voor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie. Deze snelle en reproduceerbare kwantitatieve analyse kan worden gebruikt om te bepalen van HDL functie in grootschalige studies en kan bijdragen aan ons begrip van HDL functie in ziekten bij de mens.

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Het algemene doel van deze experimentele methode is om de functie van high density lipoprotein te bepalen met behulp van een biochemische celvrije test die het lipideperoxidegehalte van een specifieke hoeveelheid HDL meet. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in verschillende medische vakgebieden, zoals de rol van HDL-functie bij cardiovasculaire ziekten en metabole afwijkingen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een celvrije biochemische methode is die kan worden gebruikt om de HDL-functie betrouwbaar te bepalen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de rol van HDL-functie bij cardiovasculaire ziekten en metabole afwijkingen, kan deze ook worden toegepast op andere ziektestudies, zoals ontstekingsziekten. Om deze procedure te beginnen, bereidt u het werkindeling voor de 96-wellplaat voor, inclusief de juiste controles, monsters en replica's, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereken het volume aan reagentia dat nodig is op basis van het aantal monsters en replica's.Gebruik een permanente stift om buisjes te labelen voor elke stap in de test. Combineer vervolgens 10 microliter uit elk monster om een gepoolde controlemonster te maken. Maak een tweede gepoold controlemonster voor het klinische laboratorium om de HDL-C-waarde te bepalen.Na het bereiden van een grote voorraad HDL, cryo-bewaar verschillende aliquoten om vries-doodcycli te minimaliseren. Pool minstens 10 verschillende replica's om een gepoolde kwaliteitscontrole te maken. Bepaal vervolgens de gemiddelde waarde van HDLox zoals beschreven in het tekstprotocol.Maak een tweede gepoolde kwaliteitscontrole voor het klinische laboratorium om de HDL-C-waarde te bepalen. Om te beginnen, ontdooi een verse plasma- of serummonster. Meng gelijke volumes plasma en HDL-cholesterolprecipiterend reagens.Pipet omhoog en omlaag meerdere keren om goed te mengen. Centrifugeer gedurende 10 minuten met een snelheid van tussen de 1000 en 2000 keer G. Aspirant de supernatant na dit.Bewaar de geïsoleerde HDL op vier graden Celsius totdat u klaar bent om de fluorochroom HDL-functietest uit te voeren. Als de HDL-C-waarde van het klinische laboratorium wordt gebruikt om HDLox te normaliseren, kwantificeer dan het HDL-C uit plasma zoals beschreven in het tekstprotocol. Om te beginnen, meng cholesterol en HRP, zodat de bereide oplossingen vijf eenheden per milliliter HRP bevatten.Ontdooi een flesje fluorochroomreagens en een flesje DMSO tot kamertemperatuur. Nadat ze zijn ontdooid, lost u een milligram fluorochroomreagens op in 200 microliter DMSO. Bewaar deze oplossing op een temperatuur onder min 20 graden Celsius, beschermd tegen licht.Voeg vervolgens 50 microliter 1X reactiebuffer toe aan de monsterplaat als negatieve controle. Voeg 50 microliter werkoplossing van 20 millimolair waterstofperoxide toe als positieve controle. Zet vervolgens een verse ronde bodem 96-wellplaat klaar om als voorbereidingsplaat te worden gebruikt.Voeg 200 microliter geïsoleerde HDL toe aan elke put van deze voorbereidingsplaat. Gebruik een multikanaals pipet om 50 microliter HDL van de voorbereidingsplaat over te brengen naar de experimentele platen, zoals beschreven in het tekstprotocol, met het aantal experimentele platen gelijk aan het aantal replica's in de test. Voeg vervolgens 50 microliter bereide HRP-oplossing toe aan elke put.Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, voeg vervolgens 50 microliter fluorochroomreagens toe aan elke put, voor een totaal volume van 150 microliter per put. Meng goed en bescherm tegen licht. Gebruik een fluorescente platenlezer om de fluorescente aflezing te beoordelen bij 37 graden Celsius, in het donker, elke minuut gedurende 120 minuten.Noteer de gegevens met behulp van geschikte software en bereken vervolgens de gemiddelde waarde van fluorescentie-eenheden zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt een celvrije biochemische fluorometrische test ontwikkeld om de HDL-lipideperoxide-inhoud per milligram HDL-C te kwantificeren. Dit wordt bereikt door enzymatische versterking met behulp van HRP.Een fluorescente platenlezer wordt vervolgens gebruikt om de fluorescentie in het donker te meten, elke minuut gedurende 120 minuten. Representatieve gegevens voor een patiënt die bekend is met disfunctioneel HDL worden hier getoond, vergeleken met de gepoolde controle. Het disfunctionele HDL blijkt lipideperoxideniveaus te hebben die twee keer zo hoog zijn als die van het gepoolde HDL van gezonde deelnemers.Vervolgens wordt de HDL geïsoleerd en HDLox bepaald bij 50 gezonde proefpersonen en 100 HIV-geïnfecteerde patiënten. De HIV-geïnfecteerde patiënten hebben gemiddeld 60% hoger HDL-peroxidegehalte per milligram HDL-C dan de gezonde proefpersonen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan zes uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om alle reagentia en controles van tevoren voor te bereiden, consistent en nauwkeurig te zijn en altijd de juiste experimentele controle in elke experimentele plaat op te nemen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de HDL kunt isoleren, de lipideperoxide-inhoud van een specifiek aantal HDL kunt bepalen en hoe u informatie over de HDL-functie kunt verzamelen. Vergeet niet dat het werken met biospecimens uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals handschoenen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

cell-free-biochemical-fluorometric-enzymatic-assay-for-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De novo lipogenese en β-vetzuuroxidatie vormen belangrijke metabole routes in hepatocyte, trajecten die zijn verstoord in verschillende metabole stoornissen, met inbegrip van vette lever ziekte. Hier laten we de isolatie van muizen primaire hepatocyten en beschrijven kwantificering van β-vetzuuroxidatie en lipogenese.

Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

We beschrijven een op fluorescentie gebaseerde assay om fosfolipide-scrambling in grote unilamellaire liposomen gereconstitueerd met opsine te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Dit protocol biedt een efficiënte aanpak voor het meten van LDL cholesterol opname met real-time toestroom tarieven met behulp van een levende cel imaging systeem in verschillende celtypen. Deze techniek biedt een platform voor het scherm van de farmacologische activiteit van verbindingen op het gebied van LDL toestroom terwijl monitoring voor cel morfologie en vandaar potentiële cytotoxiciteit.

LDL Cholesterol opname Assay met behulp van levende cellen Imaging analyse met mobiele gezondheidsmonitoring

Meting van in vitro cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument als een biomarker voor atherosclerose. In de huidige studie, optimaliseren wij en een fluorescerende NBD-cholesterol efflux methode standaardiseren en ontwikkelen van een hoge-doorvoer-analyse met behulp van 96-wells-platen.

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-geëtiketteerden Cholesterol Efflux Assay

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Degeneratieve oogziekten die de retinale pigmentepitheellaag van het oog aantasten, hebben een monogene en polygene oorsprong. Verschillende ziektemodellen en een softwaretoepassing, LipidUNet, zijn ontwikkeld om ziektemechanismen te bestuderen, evenals mogelijke therapeutische interventies.

LipidUNet-Machine Learning-gebaseerde methode voor karakterisering en kwantificering van lipideafzettingen met behulp van iPSC-afgeleid retinaal pigmentepitheel

We beschrijven een methode voor het gebruik van cyclodextrine om de uitwisseling tussen lipiden van het plasmamembraan met exogene lipiden te bemiddelen. Deze techniek kan worden gecombineerd met experimenten die transmembraaneiwitten bestuderen, die zich anders gedragen in lipidevlotachtige omgevingen dan in niet-vlotachtige omgevingen.

Lipidenuitwisselingstest in levende cellen

Dit protocol beschrijft een in vitro test voor het meten van de cellulaire lipideopname in endotheelcellen na stimulatie met BODIPY-C12 en BODIPY-C16 fluorescerende analogen van verzadigde vetzuren met lange en zeer lange ketens. Deze methode is efficiënt en kan worden aangepast aan andere celtypen en biedt een nuttige benadering voor het bestuderen van het lipidenmetabolisme.

Kwantificering van de opname van endotheliale vetzuren met behulp van fluorescerende vetzuuranalogen

Hierin beschrijven we de protocollen om de hoeveelheid fluorescerende fosfolipide te meten die specifiek uit lipidedonordeeltjes wordt verwijderd door lipoproteïne met hoge dichtheid (HDL) die aanwezig is in volledig menselijk plasma of serum. We hebben aangetoond dat deze metriek van HDL-functionaliteit incidentele hart- en vaatziekten voorspelt.

Lipoproteïne-specifieke fosfolipide-effluxtest met hoge dichtheid

Leer een celvrije fluorimetrische enzymatische assay voor high-throughput meting van lipide peroxidatie in HDL. Deze methode helpt onderzoekers bij het betrouwbaar bepalen van HDL-functie in cardiovasculaire en metabole ziekten.

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne (Video) | JoVE Journal

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

Meer video's verkennen