Name: De Organoid reconstitutie Assay (ORA) voor de functionele analyse van intestinale stam en Niche cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer de organoïde reconstitutie assay voor functionele analyse van intestinale stamcellen en nichecellen. Deze methode maakt celtypespecifieke modificatie en analyse van Lgr5+ en Paneth cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd mogelijk gemaakt door financiële steun van de Nederlandse Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) en het wereld kanker onderzoek middelen International (WCRF; project no. 2014-1181)

Alle procedures werden gedaan volgens lokale dierenwelzijn wetten en richtlijnen.
1. voorbereiding van de instrumenten, cultuurmedia en gerechten
<ol><li>Autoclaaf 1 set van intestinale schaar, normale schaar en pincet in een steriele container.</li>
	<li>Plaats een 96-Wells (platte bodem) schotel in een incubator bij 37 ° C.</li>
	<li>10 mL van volledige voedingsbodem voor te bereiden met de reagentia die zijn vermeld in tabel van materialen.</li>
	<li>Incubeer het volledige medium bij 37 ° C in een waterbad.</li>
	<li>Ontdooi gereconstitueerde kelder membraan door deze te plaatsen in een ijsemmer. De gereconstitueerde kelder membraan wordt vloeibaar bij 4 ° C zijn.</li>
	<li>Vul de 4 petrischalen met koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing of afgekort PBS (4 ° C).</li>
</ol>2. isolatie van kleine intestinale crypten
<ol><li>Offeren bij CO2 inademing een muis - eGFP-IRES-CreERt2 Lgr5op een C57BL6/J-achtergrond. Ontleden van het buikvlies lengterichting met een schaar.</li>
	<li>Houd de maag met de pincet en snijd het textielgedeelte in tweeën.</li>
	<li>Met behulp van de intestinale schaar van nu af aan, trek de darm en plaatst u deze in een petrischaal met PBS. Opmerking: Intestinale schaar hebben een scherpe en een botte tip. Het botte uiteinde van deze schaar is bedoeld om de crypt-villosités architectuur niet te beschadigen tijdens het openen van de darm.</li>
	<li>Start door het plaatsen van het botte uiteinde in de maag en duw het voorzichtig door de pylorus. Ga door met de schaar af te snijden en trekken met de pincet.</li>
	<li>Zodra de hele dunne darm lengterichting wordt geopend, het wassen in koud PBS positie houden met de pincet en spoel het zachtjes in de PBS-oplossing met U-vormige bewegingen.</li>
	<li>Zodra alle restanten van de ontlasting zijn uitgeschakeld, gaat u verder met het afvlakken van de darm op een snijplank, luminal kant naar boven. De luminal kant is gemakkelijk te herkennen door het ontbreken van bloedvaten en door zijn bleke verschijning in vergelijking met het buitenste gedeelte.</li>
	<li>Met een glasplaatje, zachtjes de villi door schrapen de afgevlakte darm te verwijderen. Voer deze stap tweemaal over de gehele lengte van het weefsel.</li>
	<li>Snijd de dunne darm met een steriele chirurgische mes in stukken van 2-5 mm.</li>
	<li>Plaats de kleine intestinale fragmenten in een tube van 50 mL met 10 mL ijs koud PBS.</li>
	<li>Reinig de weefsel fragmenten, verwijderen van alle resterende onzuiverheden waarbij ze op en neer in de PBS. Vloeistof wordt weggeworpen en herhaal deze stap totdat de PBS volledig duidelijk is.</li>
	<li>Voeg toe 15 mL koude PBS, om de totale eindvolume van PBS tot 25 mL. Voeg 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en incubeer gedurende 45 minuten op een roller bij 4 ° C.</li>
	<li>Gooi de PBS/EDTA.</li>
	<li>Voeg 10 mL PBS en loskoppelen van de crypten hard waarbij de fragmenten van het weefsel op en neer (ten minste driemaal). De bovendrijvende vloeistof te verzamelen.</li>
	<li>Herhaal stap 2.13 vier keer. Voeg kweekmedium te bereiken een eindvolume van 50 mL.</li>
	<li>Pellet de cellen door middel van centrifugeren (300 x g gedurende 5 minuten).</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 10 mL gestolde voedingsbodem- and -pellet de crypten door middel van centrifugeren (80 x g gedurende 3 minuten).</li>
</ol>3. eencellige voorbereiding
<ol><li>Verwijder het supernatant van de Ingehuld crypten en resuspendeer hen in 1 mL trypsine achtige-enzymen samen met 50 µL DNAse (50 µg/mL).</li>
	<li>Incubeer de cellen in een waterbad bij 32 ° C gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Voeg 10 mL gestolde voedingsbodem. De crypten distantiëren in afzonderlijke cellen door hard pipetteren omhoog en omlaag minstens 5 keer.</li>
	<li>Filtreer de oplossing door een zeef 40 µm (te elimineren bosjes en andere verontreinigingen)- and -pellet van de afzonderlijke cellen bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
</ol>4. Stroom Cytometry en beplating
<ol><li>50 mL 1 x Henks gebufferde zoutoplossing of HBSS/2% foetale koe serum (FCS) oplossing voor te bereiden en resuspendeer de pellet in 1 mL voor elke 106 cellen</li>
	<li>Voeg toe aan de celsuspensie BV421 Lin- (CD31, CD45, TER119) met een concentratie van 1:100, en CD24-APC en CD117-PE zowel bij een concentratie van 1:250 antilichamen voor 30 min.</li>
	<li>Sorteren Lgr5+ stamcellen en Paneth cellen in aparte laag binden buizen. Voor meer informatie over het sorteren van protocollen voor Lgr5+ en Paneth cellen, zie Roth et al. 7 en Schewe et al. 6<ol>
<li>De gesorteerde cellen bij 300 x g gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in 100 µL medium met de onderdelen beschreven in 1.3 centrifuge (Zie de Tabel van de materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>De Paneth cellen (bijvoorbeelddoor chemische of genetische modificatie) te behandelen (n = 2000) of de cellen van de stam van de Lgr5+ (n = 2000).<ol>
<li>Voor de behandeling van cellen, 5 µL van liposoom-gemedieerde transfectiereagens te gebruiken in een totaal volume van 100 µL cultuurmedium en Klein Mengend RNA (siRNA) met een concentratie van 100 nM. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor siRNA of voor de tijd die nodig is voor de gekozen wijziging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen van de cellen tweemaal in 500 µL cultuurmedium.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cellen in 10 µL cultuurmedium.</li>
	<li>Zwembad de twee cellulaire componenten (Paneth of Lgr5+ cellen) in een 20 µl totale volume en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.</li>
	<li>Incubeer mede de Paneth en Lgr5+ cellen voor 10 min op RT.</li>
	<li>10 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen en laat een meniscus van vloeistof om zeker te zijn niet gecombineerd de cel-pellet.</li>
	<li>Voeg 30 µL van gereconstitueerde kelder membraan naar de cellen voor een totaal volume van 40 µL en resuspendeer de cellen plaat in een voorverwarmde 96 goed bord. Na 10 min, voeg 200 µL van volledige medium (Zie de Tabel van de materialen). Verandering medium elke 48 uur.</li>
	<li>Graaf organoid multipliciteit bij dag 5.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten

De ORA kunt de verfijnde functionele analyse van de twee wezenlijke basiscomponenten van de intestinale stamcel niche, namelijk Lgr5+ en Paneth cellen. Deze aanpak heeft eerder gewerkt door ons en anderen met lichte wijzigingen6,10,11. Hier presenteren we de ORA-procedure als een reproduceerbare en gestandaardiseerde laboratorium protocol. Ook wij rapporteren over de gevolgen van Apc Downregulatie in...

Het intestinaal epitheel is is het snelst zichzelf vernieuwende weefsel in het lichaam van zoogdieren en, als zodanig, het object van een overvloed aan studies gericht op de identificatie en functionele karakterisering van de volwassen stamcellen, wonende aan de onderkant van de crypte van Lieberkühn, gereserveerde door expressie van het Lgr5 -gen en afhankelijk van de canonieke Wnt signalen1. Met name zijn de cellen van de stam van de Lgr5+ geflankeerd en ondersteund door gespecialiseerde niche cellen, d.w.z. de Paneth cellen, die ook afhankelijk zijn van de Wnt signalering voor hun rijping2. Samen, deze twee celtypes ten grondslag liggen aan de zelf-vernieuwing van de epitheliale darmwand en het dagelijkse homeostatische evenwicht bewaren: Lgr5+ stamcellen snel verdelen en aanleiding geven tot voorlopercellen en meer gespecialiseerde intestinale epithelial cellen; Paneth cellen essentiële niche factoren (bijvoorbeeld, Dll1, Wnt3, EGF) geven Lgr5+ 2van de cellen van de stam. De capaciteit van intestinale crypten wanneer vergulde ex vivo vormen van georganiseerde en zichzelf vernieuwend structuren organoids, of "mini-guts", genoemd als een experimenteel hulpmiddel om inzicht in processen zoals zelf-vernieuwing is benut en differentiatie in normale en pathologische omstandigheden waaronder kanker4. Organoid culturen zijn verschillende weefsel, met inbegrip van de darm, de alvleesklier, de lever, en de nier, zowel muis als menselijke specimens4vastgesteld. De extractiemethode en de groeifactoren werkzaam te ontwikkelen deze organoid culturen zijn weefsel-specifieke en ontworpen om te rijden meerdere lineage differentiatie en bootsen zo dicht mogelijk de oorspronkelijke cel van de stam-niche in vivo. Organoids wellicht potentiële toepassingen met inbegrip van de behandeling van genetische ziekten, de beoordeling van de therapeutische werking in kanker, de analyse van de drug toxiciteit of de studie van de organogenese in vitro5.
De belangrijkste beperking van organoid culturen als van weefselmonsters tot stand gebracht is over het algemeen een gebrek cel-specificiteit. Bijvoorbeeld, intestinale organoids vastgesteld van hele intestinale crypten niet toestaan de analyse van individuele cellulaire componenten omvatte binnen de bron van het weefsel (bvhele crypten bevatten Lgr5+, Paneth, en voorlopercellen).
Hier beschrijven we een nieuwe methode, hierna aangeduid als ORA, die de voordelen van intestinale organoid culturen met de functionele analyse van de meest fundamentele onderdelen, namelijk stam (Lgr5+) en niche (Paneth) cellen combineert. Dit wordt bereikt door het unieke vermogen van Paneth en Lgr5+ cellen om fysiek te koppelen aan elkaar wanneer mede geïncubeerd en aanleiding tot organoids2,6,10 geven. Wij maakte gebruik van deze functie en vooraf behandeld de twee celtypes individueel alvorens deze te reconstrueren organoids. Daarbij elk onderdeel van de cel kan worden blootgesteld aan bepaalde drug, groeifactor, biochemische remmer, genetische modificatie, of chemische behandeling voorafgaand aan de reconstructie en de vorming van de organoid. Met behulp van de ORA bepaling staat dan ook toe de bepaling van de vraag of een specifieke medicamenteuze behandeling of genetische modificatie een bepaald effect op de cellen van de stam of de wederpartij van hun niche heeft.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Eindconcentratie: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Eindconcentratie: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Eindconcentratie: 10 mM</td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Eindconcentratie: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Eindconcentratie: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Eindconcentratie: 10 µM</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Eindconcentratie: 1 µM</td></tr><tr><td>Recombinant murine R-spondin *</td><td>R&amp;D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Eindconcentratie: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Eindconcentratie: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Low binding tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* De combinatie van deze reagentia vormt het volledige kweekmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de organoid reconstitutie assay (ora) voor de functionele analyse van intestinale stam en niche cellen

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Het intestinaal epitheel wordt gekenmerkt door een zeer snelle Verwerkingsfrequentie. Bij zoogdieren, wordt de gehele epitheliale bekleding vernieuwd binnen 4-5 dagen. Volwassen intestinale stamcellen bevinden zich aan de onderkant van de crypten van Lieberkühn, door de expressie van het Lgr5 -gen zijn bestemd en homeostase via hun karakteristieke proliferatieve hoog1behouden. In de dunne darm, Lgr5+ stamcellen zijn vermengd met gespecialiseerde secretoire cellen genaamd Paneth cellen. Paneth cellen afscheiden van antibacteriële stoffen (d.w.z., lysozym en cryptdins/defensinen) en het uitoefenen van een controlerende rol op de darmflora. Meer onlangs, is een nieuwe functie voor Paneth cellen, namelijk hun capaciteit niche steun bieden aan de cellen van de stam van Lgr5+ door middel van verschillende belangrijke liganden zoals Wnt3, EGF en Dll12ontdekt.
Als ex vivo geïsoleerd en in aanwezigheid van bepaalde groeifactoren en componenten van de extracellulaire matrix gekweekt, hele intestinale crypten aanleiding geven tot langlevende en zelf vernieuwen 3D structuren genoemd organoids die sterk lijken op de crypt-villosités epitheliale architectuur van de volwassen dunne darm3. Organoid culturen, als tot stand gebracht van hele crypten, toestaan dat de studie van zelf-vernieuwing en differentiatie van de intestinale stamcel niche, maar zonder een aanpak van de bijdrage van de afzonderlijke onderdelen, namelijk de Lgr5+ en Paneth cellen.
Hier beschrijven we een nieuwe benadering voor de organoid-bepaling die van de mogelijkheid van Paneth profiteert en Lgr5+ cellen vormen van organoids te koppelen wanneer mede gekweekt. Deze aanpak, aangeduid als de "organoid reconstitutie assay" (ORA), kan de genetische en biochemische wijziging van Paneth of Lgr5+ stamcellen, gevolgd door reconstitutie in organoids. Als zodanig, maakt het de functionele analyse van de twee belangrijkste componenten van de intestinale stamcel niche.

De bepaling van de reconstitutie organoid kunt de aparte functionele analyse van de essentiële onderdelen van de niche en cel van de stam van het intestinaal epitheel, hier gedemonstreerd door Klein Mengend RNA (siRNA) van de Apc -gen.
Dit om doel te bereiken, we eerst fluorescerende geactiveerde cell sorting (FACS) om te scheiden van 8000 Lgr5+ cellen en 6000 Paneth cellen van ingeteelde C57BL6/J-mu...

Intestinale organoid culturen van hele crypten gevestigd zijn en laat niet de analyse van zelf-vernieuwing en differentiatie in een cel-specifieke mode. Dit protocol beschrijft reconstitutie van gesorteerde stengel (Lgr5+) en niche (Paneth) cellen, die aanleiding tot organoids geven terwijl het toelaten van hun voorafgaande biochemische en genetische modificatie en de functionaalanalyse.

De Organoid reconstitutie Assay (ORA) voor de functionele analyse van intestinale stam en Niche cellen

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Het algemene doel van de organoïd-reconstitutietest is de functionele analyse van de twee belangrijkste componenten van de intestinale stamcelnich Lgr5 positief in de Paneth-cellen door middel van hun genetische of biochemische modificatie gevolgd door reconstituitie in zelfvernieuwende organoïden. Deze methode maakt het mogelijk om belangrijke specifieke vragen in het gebied van intestinale stamcellen te beantwoorden, zoals genetische of biochemische modificatie in stam- en nichecellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat, in tegenstelling tot andere tests die hele crypten gebruiken, het gesorteerd stam- en nichecellen gebruikt, waardoor celtype-specifieke analyse mogelijk is.Videodemonstratie van deze methode is cruciaal, vooral als het gaat om de stappen van weefseldissociatie en celbehandeling. Als deze stappen niet goed worden uitgevoerd, zullen ze leiden tot een slechte cellevensvatbaarheid, vooral na fact sorting. Begin deze procedure met de voorbereiding van materialen en het opofferen van een Lgr5-muis op een C57BL/6J-achtergrond zoals beschreven in het tekstprotocol.Dissecteer het peritoneum longitudinaal met een paar schaar. Houd de maag vast met de pincetten en snijd deze vanaf dit punt dwars doormidden met intestinale schaar. Trek de darm eruit en plaats hem in een petrischaal met PBS.Begin door de stompe punt in de maag te plaatsen en deze voorzichtig door de pylorus te duwen. Ga verder met snijden met de schaar en trekken met de pincetten. Zodra de hele dunne darm longitudinaal is geopend, was deze in koud PBS door hem met de pincetten vast te houden en hem voorzichtig te spoelen in de PBS-oplossing met U-vormige bewegingen.Zodra alle ontlastingresten zijn verwijderd, gaat u door met het platmaken van de darm op een snijplank, lumenaalzijde omhoog. De lumenaalzijde is gemakkelijk te herkennen aan het ontbreken van bloedvaten en door zijn bleke uiterlijk in vergelijking met de buitenkant. Verwijder voorzichtig de villi met een glazen schuifje door de vervlakte darm te schrapen.Voer de stap twee keer uit over de hele lengte van het weefsel. Snijd vervolgens de dunne darm met een steriele chirurgische kling in stukjes van twee tot vijf millimeter. Plaats de darmfragmenten in een buis van 50 milliliter met 10 milliliter ijskoud PBS.Reinigt de weefselfragmenten en verwijder eventuele resterende onzuiverheden door ze op en neer te pipetteren in de PBS. Gooi de supernatant weg en herhaal de stap totdat de PBS volledig helder is. Voeg vervolgens 15 milliliter koud PBS toe om het totale eindvolume van PBS op 25 milliliter te brengen.Voeg twee millimolair EDTA toe en incubeer gedurende 45 minuten op een roller bij vier graden Celsius. Gooi na het weggegooien van de PBS EDTA 10 milliliter PBS toe en los de crypten op door de weefselfragmenten hardop op en neer te pipetteren. Verzamel vervolgens de supernatant.Herhaal deze stap vier keer. Voeg kweekmedium toe om een eindvolume van 50 milliliter te bereiken. Pel de cellen door centrifugatie.Resuspendeer ten slotte de pellet in 10 milliliter kweekmedium voordat de crypten worden gepelleteerd door centrifugatie. Voor een single-cell bereiding, gooi eerst de supernatant van de gepelletede crypten weg en resuspendeer ze in één milliliter trypsinachtige enzymen samen met 50 microliter DNase. Incubeer de cellen in een waterbad bij 32 graden Celsius gedurende twee minuten.Na het toevoegen van 10 milliliter kweekmedium, disloceert de crypten in enkele cellen door minstens vijf keer hardop op en neer te pipetteren. Filter de oplossing door een 40-micron zeef om klonten en andere onzuiverheden te elimineren. Pel vervolgens de enkele cellen bij 300 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten.Voor flowcytometrie, resuspendeer de pellet in één milliliter van een X Hank's buffered zout oplossing met 2% foetaal runderserum voor elke miljoen cellen. Voeg aan de celsuspensie Brilliant Violet 421 gelabelde antilichamen voor lijnmarker CD31, CD45 en Ter119 toe in een concentratie van een-op-100. Voeg ook anti-CD24 APC en anti-CD117 PE toe in een concentratie van een-op-250.Sorteer na 30 minuten Lgr5-positieve stamcellen en Paneth-cellen in afzonderlijke laag-bindende buisjes. Centrifugeer de gesorteerde cellen bij 300 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten. Resuspendeer vervolgens de cellen in 100 microliter medium met de componenten die in het tekstprotocol worden beschreven.Gebruik voor de behandeling van de cellen vijf microliter liposoom-gemedieerde transfectiereagens in een totaal volume van 100 microliter kweekmedium en kleine interfererende RNA bij een concentratie van 100 nanomolair. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius voor kleine interfererende RNA, of gedurende de tijd die nodig is voor de gekozen modificatie. Was de cellen twee keer in 500 microliter kweekmedium.Na centrifugatie van de cellen bij 300 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten, resuspendeer ze in 10 microliter kweekmedium. Combineer vervolgens de twee cellulaire componenten in een totaal volume van 20 microliter voordat ze worden gecentrifugeerd bij 300 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Co-incubeer de Paneth en Lgr5-positieve cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder 10 microliter van de supernatant en laat ze in een ski van vloeistof zodat de cellenpellet niet wordt aangezogen. Voeg vervolgens 30 microliter gereconstitueerde basementmembraan toe aan de cellen voor een totaal volume van 40 microliter. Resuspendeer de cellen en plaats ze in een voorverwarmde 96-well plate.Voeg na 10 minuten 200 microliter compleet medium toe. Ververs het medium om de 48 uur. Tel tenslotte de organoïd-multipliciteit op dag vijf.Kleine interfererende RNA-gemedieerde knockdown van het muis APC-gen in Lgr5-positieve stamcellen en de resulterende activering van de canonieke Wnt/beta-catenine signaalroute beïnvloedt positief de organoïd-multipliciteit in vergelijking met hun onbehandelde tegenhangers of de scrambled sequentie controle. De samenstelling van Wnt-activering redt ook

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

Hier beschrijven we een techniek om de barrière-integriteit van kleine darmorganoïden te kwantificeren. Het feit dat de methode is gebaseerd op levende organoïden maakt het sequentiële onderzoek van verschillende barrière-integriteit modulerende stoffen of combinaties daarvan op een tijdopgeloste manier mogelijk.

Onderzoek naar darmbarrière afbraak in levende organoïden

Dit protocol maakt het mogelijk om menselijke pluripotente cellen te differentiëren tot darmorganoïden. Het protocol bootst de normale menselijke ontwikkeling na door cellen te differentiëren in een populatie van definitief endoderm, endoderm van de dikke darm en vervolgens darmepitheel. Dit maakt het protocol geschikt voor het bestuderen van zowel darmontwikkeling als toepassingen voor ziektemodellering.

Generatie van hiPSC-afgeleide darmorganoïden voor ontwikkelings- en ziektemodelleringstoepassingen

Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.

Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

Hier presenteren we een protocol om darmorganoïden van ratten te genereren en deze te gebruiken in verschillende stroomafwaartse toepassingen. Ratten zijn vaak een geprefereerd preklinisch model, en het robuuste intestinale organoïdesysteem voorziet in de behoefte aan een in vitro systeem om in vivo studies te begeleiden.

Generatie en manipulatie van darmorganoïden van ratten

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC's) zijn een nieuwe stamcel klasse voor het skelet weefselregeneratie vergelijkbaar met mesenchymale stamcellen (MSC's). PSC's kunnen worden geïsoleerd door FACS (fluorescentie geactiveerde cel sortering) uit vetweefsel verkregen tijdens standaard liposuctie procedures, dan gecombineerd met een osteoinductief steiger om botvorming te...

Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

Leer de organoïde reconstitutie assay voor functionele analyse van intestinale stamcellen en nichecellen. Deze methode maakt celtypespecifieke modificatie en analyse van Lgr5+ en Paneth cellen mogelijk.

De Organoid reconstitutie Assay (ORA) voor de functionele analyse van intestinale stam en Niche cellen

Meer video's verkennen