Groot Volume, gedragsgestoorde relevante verlichting voor Optogenetics in niet-menselijke primaten
3 oktober 2017
Een protocol bij het bouwen van een weefsel doordringende illuminator voor het leveren van licht via grote volumes met minimale diameter wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van dit protocol is om een tissueilluminator met een groot volume te creëren die goed geschikt is voor optogenetische manipulaties bij niet-menselijke primaten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen, zoals hoe populaties van neuronen in de verschillende hersengebieden bijdragen aan gedrag, en hoe tijdelijk specifieke neuronale ontladingspatronen in één regio een andere regio kunnen beïnvloeden? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het licht gebruikt, en dus optogenetische manipulatie van grote gedragsrelevante hersengebieden mogelijk maakt met minimale weefselschade.
De implicaties van deze techniek reiken tot translationele geneeskunde vanwege de overeenkomsten tussen de menselijke en niet-menselijke primatenhersenen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het enige oefening vereist om de juiste hoeveelheid druk toe te passen bij het trekken van deze vezels. Om deze procedure te beginnen, gebruikt u een paar scherpe schaar om een sectie van 250 micrometer diameter kunststof optische vezel te snijden die minstens 10 centimeter langer is dan de gewenste totale illuminatorlengte.
Vervolgens verwijdert u 15 tot 20 centimeter polyethyleen jas van het ene uiteinde van de kunststof optische vezel met behulp van een 22-gauge draadstripper. Bevestig vervolgens de meest distale drie tot vijf centimeter van het ontmantelde uiteinde van de vezel in een tafelklauw. Houd het ommantelde uiteinde van de vezel in één hand strak vast met een constante, gelijkmatige trekkracht.
De vezel moet evenwijdig aan de vloer zijn, weggetrokken van de vice. Houd deze constante spanning op de vezel gedurende het verwarmen en afkoelen, zodat de vezel recht en strak blijft terwijl deze dunner wordt. Gebruik de laagste instelling van een dubbele temperatuur heteluchtpistool om het ontmantelde gedeelte van de vezel te verwarmen totdat het is verdund tot een diameter van 60 tot 100 micrometer, of ongeveer de diameter van een mensenhaar.
Houd de constante spanning op de vezel vast terwijl u deze laat afkoelen. Als u de spanning niet vasthoudt of de vezel oververhit, kan de vezel krullen en/of breken. Om de constante spanning op de vezel te helpen behouden terwijl u deze verwarmt, gebruikt u uw niet-dominante hand, zodat u niet hoeft los te laten wanneer u de heteluchtpistool gebruikt.
Je kunt de vezel ook zachtjes om je palm wikkelen voor een nog betere grip. Zodra de vezel volledig is afgekoeld en de gewenste diameter is bereikt, knijpt u de vezel drie centimeter vanaf het smalste punt aan beide kanten. Met een snelle, scherpe trek langs de as van de vezel, scheidt u de zijden om een taps toelopende punt te maken.
Bekijk vervolgens de taps toelopende punt onder een dissectiemicroscoop met een lage vergroting. Als de punt gevorkt of gekruld is, gooit u de vezel weg. Zelfs met veel oefening zal ongeveer een derde van de vezels gevorkte of gekrulde uiteinden hebben.
We gooien deze vezels gewoon weg in plaats van te proberen ze te repareren, omdat het zo snel en goedkoop is om er een nieuwe te trekken. Bereid de taps toelopende punt voor om te etch door een stuk lab tape nabij het einde van de punt te plaatsen, waarbij de gewenste lengte van het lichtemissie-uiteinde wordt blootgesteld. Hier zijn de laatste vijf millimeter blootgesteld.
Het tape beschermt de vezel tegen het etsen boven de gewenste lengte van lichtemissie. Vouw vervolgens een klein vierkant van vijf micrometer siliciumcarbide slijpblad tussen de duim en wijsvinger. Plaats het uiteinde van de vezel tussen de twee zijden van het slijpblad en etch de vezel voorzichtig met kleine cirkelvormige bewegingen.
Roteer de vezel regelmatig zodat alle kanten gelijkmatig worden geëtst. Vervolgens verwijdert u ongeveer vijf millimeter van de polyethyleen jas van het tegenovergestelde uiteinde van de illuminator met behulp van een 22-gauge draadstripper. Snijd vervolgens het tegenovergestelde uiteinde vlak af met een heet mes om het oppervlak glad te maken.
Bevestig een connector aan het uiteinde van de illuminator tegenover de geëtste punt. Dit stelt de illuminator in staat om verbinding te maken met een optisch kabel of laser. Daarna polijst u het tegenovergestelde uiteinde vlak met opeenvolgende fijnere slijpbladen.
Vervolgens steekt u het platte tegenovergestelde uiteinde in een 260 micrometer binnendiameter roestvrijstalen ferrule totdat het gelijk is met het uiteinde van de ferrule. Bevestig visueel dat het tegenovergestelde uiteinde glad en gelijkmatig is gepolijst met een vezelmicroscoop. Plak de ferrule verticaal op de rand van de tafel met de kleinere opening van de ferrule naar beneden wijzend.
Vul vervolgens een enkele milliliter spuit met plastic epoxy en bevestig een stompe 18-gauge naald aan de spuit. Gebruik vervolgens de naald om epoxy in de ferrule aan te brengen. Vul de ferrule volledig met epoxy.
Steek de vezel in de ferrule zodat deze gelijk is met de bodem van de ferrule. Als dat nodig is, veegt u eventueel overtollig epoxy van het gepolijste oppervlak van de vezel af met een natte, pluisvrij doek voordat u het droogt. Bereid in deze stap vóór elke test sessie een torenmicrodrive voor.
Bevestig vervolgens een 25-gauge geleidingsbuis met een afgeschuinde punt aan de onderste klem op de aandrijving. Bevestig de illuminator met groot volume in de bovenste klem op dezelfde aandrijving. Deze klem is bevestigd aan de aandrijfmotor.
Trek vervolgens de illuminator met groot volume volledig door de geleidingsbuis en bevestig dat de punt van de illuminator verder uitsteekt dan de punt van de geleidingsbuis. Alternatief kan lab tape op de vezel worden aangebracht, zodat de tape, in plaats van de vezel zelf, wordt geklemd om de vezel te beschermen. Week vervolgens de geleidingsbuis en illuminator in een antiseptische oplossing voor sterilisatie.
Plaats een aangepast gesteriliseerd raster met een gat van een millimeter tussen de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de constructie van een weefselpenetrerende illuminator, ontworpen voor optogenetische manipulaties bij niet-menselijke primaten. De techniek is erop gericht om grote hersenvolumes te belichten terwijl weefselschade wordt geminimaliseerd, wat onderzoek naar neuronaal gedrag en interacties faciliteert.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Optogenetica
- Neurobiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van neuronale populaties is cruciaal voor de neurowetenschap.
- Optogenetica maakt een precieze controle van de neuronale activiteit mogelijk.
- Niet-menselijke primatenmodellen zijn relevant voor de translationele geneeskunde.
- Het minimaliseren van weefselschade is essentieel voor ethische onderzoekspraktijken.
Doel van de studie
- Maak een illuminator met een groot volume voor optogenetische studies.
- Onderzoek hoe verschillende hersengebieden bijdragen aan gedrag.
- Verken de impact van neuronale vuurpatronen over verschillende regio's heen.
Gebruikte methoden
- Het afsnijden van een sectie plastic optische vezel op de gewenste lengte.
- Het uitoefenen van de juiste druk bij het trekken aan de vezels.
- Het gebruiken van scherpe scharen voor nauwkeurige sneden.
- Het samenstellen van de illuminator voor een optimale lichtlevering.
Belangrijkste resultaten
- De illuminator brengt effectief licht over naar grote hersenvolumes.
- Tijdens de procedure wordt een minimale beschadiging van het weefsel bereikt.
- Faciliteert optogenetische manipulatie in gedragsstudies.
- Biedt inzichten in neuronale interacties en gedragingen.
Conclusies
- Het protocol verbetert de mogelijkheden voor optogenetisch onderzoek.
- Het heeft aanzienlijke implicaties voor het begrijpen van de hersenfunctie.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten voor translationeel onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt optogenetische manipulatie mogelijk van grote, gedragsrelevant hersenvolumes bij niet-menselijke primaten met minimale weefselschade, ter ondersteuning van translationeel neurowetenschappelijk onderzoek. Door licht af te leveren over weefselvolumes van ~10 mm³, slaat het een brug tussen preklinische doelvalidatie en gedragsfenotypering in een fylogenetisch relevant model. De aanpak vermindert het biologische risico bij het minimaliseren van risico's van doelwitten (target de-risking) door circuit-niveau onderzoek mogelijk te maken met een verbeterde ruimtelijke specificiteit ten opzichte van conventionele glasvezeloptica.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de bijdrage van neuronale populaties aan gedrag via verspreide hersencircuits te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt causale validatie van doelen door middel van temporeel precieze optogenetische modulatie in ethologisch relevante contexten.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in het doelmechanisme door neuronale activiteitspatronen te koppelen aan gedragsoutputs in een translationeel voorspellend model.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd lichtafgiftesysteem voor een consistente optogenetische dosering over verschillende experimentsessies heen.
- Operationele waarde: Faciliteert reproduceerbare gedragsassays door stabiele, groot-volume illuminatie zonder beperkingen door elektrodekoppeling.
- Assay-gereedheid: Maakt high-fidelity optogenetische controle mogelijk in vrij bewegende proefpersonen, ter ondersteuning van longitudinale gedragsscreening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van anatomische en fysiologische overeenkomsten tussen de hersenen van niet-menselijke primaten en mensen om de voorspellende validiteit van target engagement te verbeteren.
- Preklinische risicoreductie: Maakt beoordeling mogelijk van de effecten van targetmodulatie op complexe gedragingen die relevant zijn voor neuropsychiatrische ziektemodellen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door de effectiviteit van targetmodulatie aan te tonen in een gedragsmatig complexe, gyrencefale soort.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in discovery-workflows door targetvalidatie op circuitniveau mogelijk te maken na de initiële targetidentificatie en voorafgaand aan lead-optimalisatie, in het bijzonder voor CNS-targets waarvoor bevestiging van het gedragstype noodzakelijk is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurde analyse van neurale circuits die betrokken zijn bij ziekte-gerelateerd gedrag.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde optogenetische perturbatie mogelijk in gedragstesten voor de validatie van het effect van verbindingen.
- Analytics: Genereert kwantificeerbare gedragsmatige en elektrofysiologische read-outs (bijv. foutpercentages, onderdrukking van neuronale vuren, LFP-artefacten) om target engagement te beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt moleculaire target-modulatie met gedragsuitkomsten op systeemniveau in een model met een hoge translationele relevantie voor menselijke cognitie.
- Enterprise Hergebruik: Vertegenwoordigt een schaalbaar platform voor herhaaldelijk gebruik over meerdere targets en gedragsparadigma's na de initiële fabricage en kwaliteitscontrole.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door celtype-specifieke controle over grote neuronale populaties tijdens gedrag mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde fabricage, QC-kalibratie en sterilisatieprocedures.
- Strategische waarde: Vermindert risico's bij de verdere ontwikkeling van targets door causaal bewijs te leveren voor relaties tussen targets en gedrag in een preklinisch model.
- Impact op portfolio: Informeert de risicogewogen prioritering van targets door de functionele relevantie van targets in complexe gedragsdomeinen te valideren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische technieken, het hanteren van glasvezels en steriele procedures voor neurale implantatie.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder microdrives, geleidingsbuizen, sterilisatiekamers en laserkoppelingssystemen.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor neurowetenschappen, engineering en dierenzorg voor een consistente productie en het gebruik van illuminatoren.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende doeldieptes (oppervlakkige versus diepe structuren) en illuminatievolumes op basis van de experimentele doelen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals variabele succespercentages bij het trekken van vezels en de vorming van de tip, waardoor batchfabricage en kwaliteitscontrole (QC) screening noodzakelijk zijn.
