Name: Groot Volume, gedragsgestoorde relevante verlichting voor Optogenetics in niet-menselijke primaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer hoe je een grootvolume weefselverlichtingsapparaat bouwt voor optogenetische manipulaties in niet-menselijke primaten. Deze methode minimaliseert weefselschade en vergroot het inzicht in neuronale bijdragen aan gedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LCA erkent financiering van een NDSEG-beurs, de NSF-GRFP en de vrienden van het McGovern Institute. EP erkent financiering de Harry en Eunice Nohara UROP Fonds, de MIT-klasse van 1995 UROP Fonds en het Fonds MIT UROP. ESB erkent financiering van NIH 2R44NS070453-03A1, de prijs van IET Harvey, en de New York stamcel Foundation-Robertson Award. RD erkent financiering van NIH EY017292. Michael Williams hielp het team te organiseren en leveringen vóór het filmen te verzamelen.

Opmerking: alle dierlijke procedures werden overeenkomstig de richtsnoeren van de NIH en goedgekeurd door het Massachusetts Instituut van technologie Committee on Animal Care.
 1. illuminator fabricage <ol><li>gebruik van een paar scherpe schaar te snijden van een deel van 250 µm diameter kunststof optische vezel dat is ten minste 10 cm langer dan de lengte van de gewenste totale illuminator.</li>
	<li>Verwijderen van 15-20 cm van polyethyleen jas van het ene eind van de kunststof optische vezel met behulp van een 22 gauge draad-stripper.</li>
	<li>Beveiligen de distale meeste 3-5 cm van het gestripte deel van de vezel in een bankschroef Tafelklem.</li>
	<li>Houd de dubbelwandige uiteinde van de vezel strak in de ene hand met een constante constante trek. De vezel moet parallel aan de vloer, loodrecht op de vice. Handhaven van deze constante spanning op de glasvezel in de gehele verwarming en koeling (stappen 1.5 en 1.6 hieronder) zodat de vezel rechte en strak blijft zoals het verdunt.</li>
	<li>Met de laagste instelling van een dubbele temperatuur warmte pistool 570/1.000 ° F, verwarm het gestripte deel van de vezel tot het is verdund met een diameter van 60-100 μm, of over de diameter van een mensenhaar.</li>
	<li>Behouden de constante spanning op de glasvezel terwijl het toestaan van de vezel om te koelen. Falen om de spanning kan leiden tot de vezel te krullen.</li>
	<li>Bevestigen de diameter van de verdunde tip onder een Microscoop ontleden. Afwisselend, men kan de remklauwen in plaats daarvan gebruiken.
	<ol><li>Als de vezel niet dun genoeg is, herhaalt u stap 1.4 via 1.6 zoals die nodig zijn om de gewenste tip diameter.</li>
		<li>Optioneel als opnieuw trekken, zet een kleine mark op het smalste gedeelte van de vezel als het zal opnieuw worden verwarmd zodat het midden van de warmte-pistool richt zich op het smalste gedeelte van de vezel.</li>
		<li>Als de vezel te dun is, herbeginnen.</li>
	</ol></li> <li>Zodra de vezel volledig is afgekoeld en de gewenste diameter is bereikt, knijpen de vezel 3 cm vanaf het smalste punt aan beide zijden. Met een snelle, scherpe trekken langs de as van de vezel, scheiden de zijkanten om te maken een taps toelopende tip.</li>
	<li>Onderzoeken de taps toelopende tip onder een laag vermogen (bijvoorbeeld 4 X) over dissectie Microscoop. Als het uiteinde vertakt of gekruld ( Figuur 1f), negeren de vezel.</li>
	<li>Voorbereiden aan de taps toelopende tip etch door het plaatsen van een stukje lab tape in de buurt van het einde van de tip, verlaten de laatste 5 mm blootgesteld. De tape beschermt de vezel tegen ETS boven de gewenste lengte van licht emissie. De lengte van deze tip was geselecteerd op basis van de dikte van primate cortex in de target-regio. Een langere of kortere lengte kan afhankelijk van de gewenste lengte van verlichting worden blootgesteld. Indien een verschillende etsen tip lengte is gewenst, de rand van de lab-tape dichter kan worden verplaatst naar of verder van de taps toelopende tip.</li>
	<li>Vouw een klein (~ 1 inch x 2-inch) vierkant van 5 μm siliciumcarbide kabbelende blad over tussen de duim en wijsvinger. Plaats het uiteinde van de vezel tussen de twee zijden van de kabbelende vel en zachtjes de vezel met behulp van kleine cirkelvormige bewegingen, etch, alsof een BB tussen duim en wijsvinger rollen. Vaak draaien de vezel zodat alle kanten gelijkmatig zijn gegrift. De vezel tip zal verschijnen &#8220; geruwd &#8221; met het blote oog in gebieden die hebben is geëtst, terwijl niet-geëtste gebieden meestal altijd gelijkmatig weergegeven.</li>
	<li>Herhaal stap 1.11 met een 3 μm aluminium oxide lappen blad.</li>
	<li>Brengt een verbindingslijn op het einde van het hulplicht tegenover de geëtste tip. Hierdoor is het hulplicht koppelen aan een optische kabel of laser. 
	Opmerking: Deze methode verschilt van de voorkeursmethode voor de vaststelling van glas / kiezelzuur optische vezels in ferrules. Omdat de metalen verlengstuk moeilijker dan de kunststof optische vezel is, polijsten van de vezel en verlengstuk als een eenheid na het lijmen kan beschadigen de kunststof optische vezel als kleine scherven van metaal geproduceerd tijdens het polijsten kunt zich insluiten in flat-gekloofd vezel.
	<ol><li>Verwijderen van ongeveer 5 mm van de polyethyleen jas van het andere uiteinde van het hulplicht met behulp van een 22 gauge draad-stripper.</li>
		<li>Knippen van de andere kant plat met een warme mes om het oppervlak glad.</li>
		<li>Pools van het andere uiteinde plat met achtereenvolgens fijnere lappen bladen: 5 µm, 3 μm, 1 μm en 0,3 µm.</li>
		<li>Invoegen de flat tegenover uiteinde in een verlengstuk van de RVS van 260 µm-binnendiameter, totdat het spoelen met het einde van de verlengstuk.</li>
		<li>Visueel te bevestigen dat het tegenovergestelde einde soepel en gelijkmatig met een fiber-Microscoop gepolijst is.</li>
		<li>Verwijderen van de vezel van het verlengstuk en tape het verlengstuk verticaal aan de rand van een tabel met de vezel die naar beneden wijst.</li>
		<li>Vul een spuit van 1 mL met kunststof epoxy en hechten een botte 18 gauge naald op de injectiespuit.</li>
		<li>Gebruik de naald te passen epoxy beneden in de verlengstuk. Het verlengstuk volledig te vullen met epoxy.</li>
		<li>De vezel invoegen het verlengstuk.</li>
		<li>Veeg alle overtollige epoxy van gepolijste oppervlak van de vezel met een natte pluisvrije doekje vóór het drogen indien nodig. Anders, overtollige epoxy kan worden verwijderd na 12-24 h.</li>
		<li>Bewaren de vezel zachtjes tot kalibratie en plaats een stofkap boven het verlengstuk.</li>
	</ol></li></ol> 2. Illuminator kalibratie en kwaliteitscontrole Opmerking: deze methoden voor kalibratie beoordelen voor niet-lineariteit op verschillende afstanden van de tip van de vezel lichtopbrengst. Ongelijke lichtverdeling meestal het gevolg van een &#8220; hobbelige &#8221; of &#8220; golvende &#8221; taper.
<ol><li>Maken een lichte afscherming membraan voor de bovenkant van de integrerende bol met behulp van licht absorberende folie ( Figuur 2). 
	Opmerking: Draag handschoenen wanneer behandeling licht absorberende folie om te voorkomen dat de huid oliën van het creëren van licht reflecterende vlekken.
	<ol><li>Vouw een 2 &#8221; door 4 &#8221; stuk van licht absorberende folie op zichzelf om te vormen van een 2 &#8221; x 2 &#8221; square. een alternatieve methode is om te snijden een 2 &#8221; x 2 &#8221; plein met een licht absorberen van kant en een licht reflecterende kant (dat wil zeggen een kant van de standaard aluminiumfolie); echter de fold-over-methode is veiliger, omdat daarin een doffe rand voor het afhandelen van het middenrif in de volgende stap.</li> <li>vouwen lab tape of isolatietape langs de randen van het vierkant om te binden de randen niet-gevouwen. Dit zowel de zijden bij elkaar houdt en beschermt tegen bezuinigingen van scherpe randen.</li>
		<li>Een gat in het midden van het plein met behulp van een 26 gauge naald punctie.</li>
		<li>Verwijderen van de grote schroef op de dop van de bolfotometer en betrekking hebben op de opening met het middenrif. Plaats het gat boven het midden. Als het middenrif is gemaakt met een licht absorberen en een licht reflecterende kant, plaatst u het licht absorberen kant omhoog en het licht reflecterende zijde naar beneden, geconfronteerd met de binnenkant van de bolfotometer. 
		Opmerking: Om te voorkomen dat stof en puin van het invoeren van de bolfotometer en houden het gat gecentreerd, beveiligen het membraan aan de buitenkant van de bolfotometer met lab tape.</li>
	</ol></li> <li>Maatregel lichte uitgang langs de tip in 500 µm stappen met behulp van een micromanipulator of stereotaxic arm en een bolfotometer. 
	Opmerking: Veiligheidsbril met de juiste golflengte moeten gedragen worden, wanneer de laser brandt.
	<ol><li>Het andere uiteinde van de vezel verbinden met een laserprinter of een licht bron, maar doen niet nog licht trigger.</li>
		<li>Secure het hulplicht aan een stereotaxic (prefe-houderrably met lab tape) met de tip 7-10 mm onder de bodem van de houder.</li>
		<li>Schroef de stereotaxic houder in het stereotaxic wapen</li>
		<li>Hiermee lijnt u de tip van het hulplicht met het gat in het midden van het middenrif. De micromanipulator nul wanneer de tip op exact hetzelfde niveau als het middenrif is.</li>
		<li>Turn off van de kamer lichten en nul van de bolfotometer.</li>
		<li>Leiden tot de laser (of andere lichtbron) en meet de lichte totaalvermogen uitvoer via de bolfotometer. 
		Opmerking: De laagste lichtopbrengst mogelijk gebruiken voor het testen van de kalibratie.</li>
		<li>De glasvezel 500 µm lager in de integrerende bol en herhaalt u stap 2.2.6.</li>
		<li>Verder verlagen van de vezel in de bolfotometer en het meten van totale lichtopbrengst in 500 µm stappen tot de lichte totaalvermogen niveaus af 
		Let op: Lichte totaalvermogen moet niveau af zodra de gehele tip in het gebied is. Ga niet verder met het verlagen van de vezel meer dan 1-2 mm buiten de geëtste tip lengte. Als het uiteinde contact maakt met de onderkant van de bolfotometer, het kan smelten en/of ruïneren van de bolfotometer.</li>
	</ol></li> <li>Een gelijkmatig geëtste vezel bevestigen door het uitzetten van lichte totaalvermogen output als een functie van hoe ver de vezel is verlaagd in de bolfotometer te bevestigen lineariteit.</li></ol>
 3. in Vivo verlichting
 Opmerking: hier, deze methoden worden weergegeven met behulp van een plastic model in plaats van een niet-menselijke primaten.
<ol><li>Implantaat een kamer van 25 mm diameter opnemen over het gebied van de hersenen van belang voorafgaand aan experimenten was geïmplanteerd.</li>
	<li>Anatomische magnetische resonantie beeldvorming (MRI) voorafgaand aan experimenten uitvoeren Een aangepaste opname-raster plaatsen in de zaal en vul het met steriele chirurgische smeermiddel voor raster visualisatie en bepaling van het gehalte van de breinstructuur dura- en het doeldomein.</li>
	<li>Bereiden een toren micro-station vóór elke test sessie.
	<ol><li>Affix een 25 meter gids buis met schuine tip naar het midden en lagere klemmen op de schijf. Twee klemmen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de gids buis rechtdoor blijft. Beide van deze klemmen kunnen handmatig worden verplaatst indien gewenst. 
		Opmerking: De gids-buis kan vastgesoldeerd aan de klemmen of epoxied worden.</li>
		<li>Beveiligen het hulplicht groot volume in de bovenste klem op hetzelfde station. Deze klem is gekoppeld aan de aandrijfmotor.</li>
		<li>Draad de verlichter van de groot-volume door de gids buis volledig en bevestigen dat het uiteinde van het hulplicht strekt zich uit langs de tip van de gids buis. 
		Opmerking: De lengte van het hulplicht dat zich uitstrekt van verleden het uiteinde van de buis gids is gelijk aan de afstand van de dura in het onderste gedeelte van de regio van de hersenen doel, als bepaald via MRI.</li>
		<li>Geniet van de gids buis en illuminator in antiseptische oplossing (bijvoorbeeld, chlorohexidine) te steriliseren.</li>
	</ol></li> <li>Een aangepaste gesteriliseerde raster plaatsen binnen de schone kamer en veilig op een vooraf opgegeven oriëntatie met een schroef aan de zijkant van de kamer. De hier getoonde raster heeft 1 mm afstand; echter de afstand zo nodig kan worden aangepast. 
	Opmerking: Dit moet identiek zijn aan het raster en de afdrukstand in de anatomische MRI gebruikt.</li>
	<li>De stereotactische houder van de micro-aandrijving op de kamer van de opname in een vooraf bepaalde richting secure.</li>
	<li>Intrekken de gesteriliseerde verlichter van de buis van de gids door te trekken van het hulplicht up met behulp van steriele, botte pincet. De tip van het hulplicht moet 5-10 mm boven de tip van gids buis. 
	Opmerking: Het hulplicht zal buigen naar buiten tussen de buis van de gids en de klem. Dit zal niet beschadigen de flexibele illuminator.</li>
	<li>Brengt de micro-drive aan de houder en de gids buis plaatsen in doel raster gat.</li>
	<li>Lagere de fase van de micro-station totdat de buis gids gewoon door het niveau van de dura is. 
	Opmerking: Indien gewenst, kan een tweede micro-station met een elektrode worden in het werkgebied geplaatst en in een ander rooster gat verlaagd. Het lokale veld potentiële op deze elektrode zal tonen een afstand-afhankelijke lichte artefact, die kan worden gebruikt ter bevestiging van plaatsing illuminator.</li>
	<li>Proberen hoe lager het hulplicht handmatig met steriel pincet.
	<ol><li>Als er geen weerstand, trekken de verlichter 5 - 10 mm, wacht 10 minuten zodat het weefsel te regelen en probeer het opnieuw.</li>
		<li>Als er nog weerstand bij de tweede poging, de verlichter tip intrekken in de gids buis, lager de gids 0,25 mm buis, en probeer het opnieuw.</li>
		<li>Herhalen totdat de illuminator glijdt door de gids buis zonder enige weerstand.</li>
		<li>Lagere de verlichter totdat het strak. 
		Let op: Duw niet het hulplicht krachtig tegen verzet. In deze gevallen de gids buis meestal is niet doorgedrongen tot de dura volledig. De vezel krachtig duwen zal leiden tot het te buigen, voorkomen van de vezel van het invoeren van de hersenen en eventueel vernietigen van de tip ( Figuur 1 g).</li>
	</ol></li> <li>De verlengstuk aan de andere kant van het hulplicht verbinden met de grotere optica instellen of laser.</li>
	<li>Zorg ervoor dat geen licht zichtbaar voor de niet-menselijke primaten is.
	<ol><li>Gebruik verduisterende afschermen of licht absorberende folie volledig omvat de opname torens.</li>
		<li>Plaats van alle optische verbindingen in afgeschermde enveloppen zijn gemaakt van licht absorberende folie.</li>
		<li>Schild alle patch kabels met beide licht absorberende folie of zwarte isolatietape.</li>
		<li>Als een extra voorzorgsmaatregel, plaats een lokvogel light - emitting diode (LED) bank voor de dezelfde lichte kleur gebruikt in het experiment achter de niet-menselijke primaten en flash van de LED's continu bij 2,5 Hz. Hiermee voorkomt u dat de ogen volledig aan te passen aan de duisternis. Mochten er onverhoeds zwak lekkage, deze knipperend licht zou helpen om te voorkomen dat het lek een gedrags trigger bijeenkomen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).</li>
<li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass-coated+tungsten+microelectrode+enclosing+optical+fibers+for+optogenetic+exploration+in+primate+deep+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures.</a> J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).</li>
<li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+Electrical+Microstimulation+Systematically+Bias+Visuospatial+Choice+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates.</a> Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).</li>
<li>Ozden, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coaxial+optrode+as+multifunction+write-read+probe+for+optogenetic+studies+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates.</a> J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).</li>
<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li>
<li>Chuong, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+inhibition+with+a+red-shifted+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin.</a> Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).</li>
<li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).</li>
<li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li>
<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+Induced+Behavioral+and+Functional+Network+Changes+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates.</a> Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
<li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li>
<li>Cavanaugh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inactivation+modifies+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior.</a> Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).</li>
</ol>

Hoewel optogenetic tools veel gebruikt worden om te studeren ziekten, en fysiologie bij knaagdieren, heeft de technische uitdaging van verhelderend grote hersenen volumes beperkt het gebruik van optogenetics in niet-menselijke primaten. Baanbrekende studies in apen grote lichte macht dichtheden (~ 100 mW/mm2 tot 20 W/mm2) gebruikt voor het verlichten van kleine volumes, misschien &#60; 1 mm3en gerapporteerde bescheiden gedrags effecten met excitatory opsins in de cortex4...

Optogenetic instrumenten, die voor milliseconde-nauwkeurige, licht gestuurde neuronale controle zorgen worden veel gebruikt om te studeren functionele fysiologie en gedrag in knaagdieren en ongewervelde dieren. Technische uitdagingen hebben echter slechts beperkt het gebruik van optogenetics in de hersenen van de niet-menselijke primaten, die een volume van ~ 100 x groter dan de knaagdier hersenen 1 heeft.
Om te vergemakkelijken optogenetics studies in niet-menselijke primaten, een hulplicht is ontworpen om twee concurrerende doelstellingen adres: groot volume verlichting en minimale penetratie schade. Eerdere pogingen om een van deze problemen te komen op de duur van de andere. Bundels van vezels verlichten grotere volumes, maar met grotere diameter, en daarmee schade2,3. Taps toelopende glasvezels beschadiging, penetratie, maar ternauwernood focus licht aan oplichtende oppervlak &#60; 100 µm2 - 4,5. Externe hersenen verlichting door een raam in de dura omzeilt de uitdaging van de penetratie schade en kan voor grote volume verlichting, maar het kan alleen worden gebruikt voor enkele oppervlakkige hersenen gebieden6.
Als u wilt maken een groot volume, kleine diameter illuminator (Figuur 1a), het puntje van een plastic optische vezel is warmte tapered en de kern en de bekleding zijn geëtst (Figuur 1bc). In tegenstelling tot andere taps toelopende vezels die licht naar een smal punt concentreren, kunt de etsen licht gelijkmatig ontsnappen uit de zijkanten van de stortplaats, dus licht in grote lijnen over een groot gebied (Figuur 1 de) te verdelen. Omdat de penetratie schade is evenredig aan de diameter van de penetratie, dit hulplicht heeft geen meer schade van de penetratie dan een conventionele vezel, maar het heeft &#62; 100 x het oplichtende oppervlak gebied en levert licht meer in het algemeen met 1/100ste de lichte macht dichtheid in een hersenen phantom (1,75% agarose) (Figuur 1e). Een Monte Carlo-model (Figuur 1f) illustreert het verschil in licht verspreiden tussen een conventionele vezel en het grote volume hulplicht wanneer zij gelijke lichte macht dichtheden hebben als hun lichtdoorlatende oppervlakken. Elke illuminator is individueel gekalibreerd met behulp van een bolfotometer (Figuur 2a, b) om ervoor te zorgen zelfs lichtverdeling langs de tip (Figuur 2 c).
Dit groot volume illuminator is gevalideerd met optogenetic manipulatie van zowel gedrag en neuronale afvuren in niet-menselijke primaten. De lengte van de tip vezel kan worden aangepast naar elk willekeurig deel van de hersenen en voor elk dier individuele receptieve veld kaart. Het hulplicht kan gekoppeld worden aan een doordringende elektrode voor neuronale opnames die zich uitstrekken over de lengte van de verlichting. Verder, omdat de vezel elke kleur van zichtbaar licht kunnen, kunnen worden gekoppeld met een van de beschikbare optogenetic moleculen beschikbaar.

<table><tbody><tr><td>Kunststof glasvezel</td><td>Individuele vezeloptiek</td><td>SK-10</td><td>250 micron diameter, Super Eska lijn</td></tr><tr><td>Draadstripper</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>22 gauge</td></tr><tr><td>Scharnierende klemmen</td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>Generieke tafelmontage klemmen</td></tr><tr><td>Dubbele temperatuur hittepistool</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1.000 &deg;F</td></tr><tr><td>Lab marker</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie microscoop</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Stereomicroscoop met dubbele gloeilamp, 2X/4X vergroting, verkrijgbaar bij VWR</td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>Pakket van 4 violette kleur; echter, de kleur van het tape maakt niet uit</td></tr><tr><td>Silicon carbide polijstblad</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>5 micron grit, 10-pack</td></tr><tr><td>Aluminium oxide polijstblad</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>3 micron grit, 10-pack</td></tr><tr><td>Aluminium oxide polijstblad</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>1 micron grit, 10-pack</td></tr><tr><td>Calcined alumina polijstblad</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>0.3 micron grit, 10-pack</td></tr><tr><td>Heet mes</td><td>Individuele vezeloptiek</td><td>IF370012</td><td>60 Watt, heavy duty</td></tr><tr><td>Vezel inspectiescoop</td><td>ThorLabs</td><td>FS201</td><td>optioneel</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen ferrule</td><td>Precision fiber optics</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>265 micron binnendiameter</td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>Luer-lok tip is te prefereren om het risico op lekkage te verminderen, maar niet strikt noodzakelijk</td></tr><tr><td>Kunststof epoxy</td><td>Individuele vezeloptiek</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge stompe naald</td><td>BD</td><td>305180</td><td>1.5 inch lengte</td></tr><tr><td>Lintvrije doek (KimWipe)</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>beschikbaar bij veel leveranciers</td></tr><tr><td>Lichtabsorberende folie</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Elektrische tape</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>Optioneel, mag andere merken / modellen vervangen</td></tr><tr><td>26 gauge scherpe naald</td><td>BD</td><td>305111</td><td>0.5 inch lengte</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>mag andere merken/modellen vervangen</td></tr><tr><td>Stereotactische arm</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>mag andere merken/modellen vervangen</td></tr><tr><td>Laser veiligheidsbril</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>moet worden geselecteerd op basis van de kleur van de gebruikte laser, voorbeeld hier gegeven</td></tr><tr><td>Laser of andere lichtbron</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>voorbeeld van blauwe laser</td></tr><tr><td>Integrerende bol</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Bijbehorende vermogensmeter, ook verkrijgbaar bij ThorLabs, artikelnummer #PM100D</td></tr><tr><td>Ultem opnamekamer</td><td>Crist instrument company</td><td>6-ICO-J0</td><td>Aangepast met uitlijningssnede</td></tr><tr><td>Toren microdrive met klemmen</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>Leiding</td><td>Aangepast</td><td>N/A</td><td>Gemaakt van 25 gauge spinale naald (BD) of stompe buis</td></tr><tr><td>NAN driver systeem</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Aangepast rasterontwerp</td><td>aangepast</td><td>aangepast</td><td>plannen beschikbaar op aanvraag</td></tr><tr><td>Stompe pincetten</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>generieke roestvrijstalen stompe pincetten</td></tr><tr><td>Digitale schuifmaten</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>beschikbaar op amazon.com. Kan een nauwkeuriger resolutie schuifmaat selecteren voor meer nauwkeurige metingen.</td></tr><tr><td>Patchkabel</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>Dit is een voorbeeld van vele mogelijke patchkabels. Zolang de vezeldiameter kleiner is of gelijk is aan de vezeldiameter van de grote volume illuminator en zolang de connectoren compatibel zijn, is elke patchkabel (glas of plastic, door de verkoper gekocht of gemaakt in het lab) prima voor deze toepassing.</td></tr><tr><td>Doorzichtige kunststof stofdoppen</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Pakket van 25</td></tr><tr><td>keramische split koppelingshuls</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

groot volume, gedragsgestoorde relevante verlichting voor optogenetics in niet-menselijke primaten

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

Dit protocol beschrijft een groot volume illuminator, die werd ontwikkeld voor optogenetic manipulaties in de hersenen niet-menselijke primaten. De illuminator is een gemodificeerde kunststof optische vezel met geëtste tip, zodanig dat het oplichtende oppervlak &#62; 100 x die van een conventionele vezel. Naast het beschrijven van de bouw van een groot volume hulplicht, detailleert dit protocol de kalibratie van de kwaliteitscontrole gebruikt om ervoor te zorgen zelfs lichtverdeling. Dit protocol wordt verder beschreven technieken voor het invoegen en verwijderen van het hulplicht groot volume. Zowel de oppervlakkige en de diepe structuren kunnen worden verlicht. Dit hulplicht groot volume hoeft niet te worden fysiek gekoppeld aan een elektrode, en omdat de illuminator is gemaakt van kunststof, niet het glas, het gewoon zal buigen in omstandigheden als traditionele optische vezels zou versplinteren. Omdat dit hulplicht licht boven gedragsgestoorde relevante weefsel volumes (≈ 10 mm3) zonder meer schade van de penetratie dan een conventionele optische vezel levert, vergemakkelijkt het behavioral studies met optogenetics in niet-menselijke primaten.

De verlichting van de grote hersenen volumes in niet-menselijke primaten zorgt voor behavioristisch relevante optogenetic manipulatie. Acker et al. (2016) gebruikt dit hulplicht groot volume met de rood-verschoven Halorhodopsin, Jaws, 7 te bestuderen van de tijdelijke bijdrage van het veld frontale oog (FEF) geheugen-geleide saccades in twee rhesus monkeys. In het bijzonder waren FEF neuronen geïnjecteerd met een virale vector met kaken en vervolgens verlicht met rood-licht met behulp van...

Een protocol bij het bouwen van een weefsel doordringende illuminator voor het leveren van licht via grote volumes met minimale diameter wordt gepresenteerd.

Groot Volume, gedragsgestoorde relevante verlichting voor Optogenetics in niet-menselijke primaten

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

Het algemene doel van dit protocol is om een tissueilluminator met een groot volume te creëren die goed geschikt is voor optogenetische manipulaties bij niet-menselijke primaten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen, zoals hoe populaties van neuronen in de verschillende hersengebieden bijdragen aan gedrag, en hoe tijdelijk specifieke neuronale ontladingspatronen in één regio een andere regio kunnen beïnvloeden? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het licht gebruikt, en dus optogenetische manipulatie van grote gedragsrelevante hersengebieden mogelijk maakt met minimale weefselschade.De implicaties van deze techniek reiken tot translationele geneeskunde vanwege de overeenkomsten tussen de menselijke en niet-menselijke primatenhersenen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het enige oefening vereist om de juiste hoeveelheid druk toe te passen bij het trekken van deze vezels. Om deze procedure te beginnen, gebruikt u een paar scherpe schaar om een ​​sectie van 250 micrometer diameter kunststof optische vezel te snijden die minstens 10 centimeter langer is dan de gewenste totale illuminatorlengte.Vervolgens verwijdert u 15 tot 20 centimeter polyethyleen jas van het ene uiteinde van de kunststof optische vezel met behulp van een 22-gauge draadstripper. Bevestig vervolgens de meest distale drie tot vijf centimeter van het ontmantelde uiteinde van de vezel in een tafelklauw. Houd het ommantelde uiteinde van de vezel in één hand strak vast met een constante, gelijkmatige trekkracht.De vezel moet evenwijdig aan de vloer zijn, weggetrokken van de vice. Houd deze constante spanning op de vezel gedurende het verwarmen en afkoelen, zodat de vezel recht en strak blijft terwijl deze dunner wordt. Gebruik de laagste instelling van een dubbele temperatuur heteluchtpistool om het ontmantelde gedeelte van de vezel te verwarmen totdat het is verdund tot een diameter van 60 tot 100 micrometer, of ongeveer de diameter van een mensenhaar.Houd de constante spanning op de vezel vast terwijl u deze laat afkoelen. Als u de spanning niet vasthoudt of de vezel oververhit, kan de vezel krullen en/of breken. Om de constante spanning op de vezel te helpen behouden terwijl u deze verwarmt, gebruikt u uw niet-dominante hand, zodat u niet hoeft los te laten wanneer u de heteluchtpistool gebruikt.Je kunt de vezel ook zachtjes om je palm wikkelen voor een nog betere grip. Zodra de vezel volledig is afgekoeld en de gewenste diameter is bereikt, knijpt u de vezel drie centimeter vanaf het smalste punt aan beide kanten. Met een snelle, scherpe trek langs de as van de vezel, scheidt u de zijden om een taps toelopende punt te maken.Bekijk vervolgens de taps toelopende punt onder een dissectiemicroscoop met een lage vergroting. Als de punt gevorkt of gekruld is, gooit u de vezel weg. Zelfs met veel oefening zal ongeveer een derde van de vezels gevorkte of gekrulde uiteinden hebben.We gooien deze vezels gewoon weg in plaats van te proberen ze te repareren, omdat het zo snel en goedkoop is om er een nieuwe te trekken. Bereid de taps toelopende punt voor om te etch door een stuk lab tape nabij het einde van de punt te plaatsen, waarbij de gewenste lengte van het lichtemissie-uiteinde wordt blootgesteld. Hier zijn de laatste vijf millimeter blootgesteld.Het tape beschermt de vezel tegen het etsen boven de gewenste lengte van lichtemissie. Vouw vervolgens een klein vierkant van vijf micrometer siliciumcarbide slijpblad tussen de duim en wijsvinger. Plaats het uiteinde van de vezel tussen de twee zijden van het slijpblad en etch de vezel voorzichtig met kleine cirkelvormige bewegingen.Roteer de vezel regelmatig zodat alle kanten gelijkmatig worden geëtst. Vervolgens verwijdert u ongeveer vijf millimeter van de polyethyleen jas van het tegenovergestelde uiteinde van de illuminator met behulp van een 22-gauge draadstripper. Snijd vervolgens het tegenovergestelde uiteinde vlak af met een heet mes om het oppervlak glad te maken.Bevestig een connector aan het uiteinde van de illuminator tegenover de geëtste punt. Dit stelt de illuminator in staat om verbinding te maken met een optisch kabel of laser. Daarna polijst u het tegenovergestelde uiteinde vlak met opeenvolgende fijnere slijpbladen.Vervolgens steekt u het platte tegenovergestelde uiteinde in een 260 micrometer binnendiameter roestvrijstalen ferrule totdat het gelijk is met het uiteinde van de ferrule. Bevestig visueel dat het tegenovergestelde uiteinde glad en gelijkmatig is gepolijst met een vezelmicroscoop. Plak de ferrule verticaal op de rand van de tafel met de kleinere opening van de ferrule naar beneden wijzend.Vul vervolgens een enkele milliliter spuit met plastic epoxy en bevestig een stompe 18-gauge naald aan de spuit. Gebruik vervolgens de naald om epoxy in de ferrule aan te brengen. Vul de ferrule volledig met epoxy.Steek de vezel in de ferrule zodat deze gelijk is met de bodem van de ferrule. Als dat nodig is, veegt u eventueel overtollig epoxy van het gepolijste oppervlak van de vezel af met een natte, pluisvrij doek voordat u het droogt. Bereid in deze stap vóór elke test sessie een torenmicrodrive voor.Bevestig vervolgens een 25-gauge geleidingsbuis met een afgeschuinde punt aan de onderste klem op de aandrijving. Bevestig de illuminator met groot volume in de bovenste klem op dezelfde aandrijving. Deze klem is bevestigd aan de aandrijfmotor.Trek vervolgens de illuminator met groot volume volledig door de geleidingsbuis en bevestig dat de punt van de illuminator verder uitsteekt dan de punt van de geleidingsbuis. Alternatief kan lab tape op de vezel worden aangebracht, zodat de tape, in plaats van de vezel zelf, wordt geklemd om de vezel te beschermen. Week vervolgens de geleidingsbuis en illuminator in een antiseptische oplossing voor sterilisatie.Plaats een aangepast gesteriliseerd raster met een gat van een millimeter tussen de

large-volume-behaviorally-relevant-illumination-for-optogenetics-non

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Hier beschrijven we onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnamen van geïdentificeerde remmende interneuronen in de geanesthetiseerde muiscortex. Neuronen die ChR2 tot expressie brengen, worden geïdentificeerd door hun reactie op blauw licht. De methode maakt gebruik van standaard extracellulair opname-apparatuur en dient als een goedkope alternatief voor calcium-beeldvorming of visueel geleid patchen.

Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons

Dit protocol beschrijft de stappen en gegevensanalyse die nodig zijn om optogenetisch functioneel magnetische resonantiebeeldvorming (ofMRI) met succes uit te voeren. ofMRI is een nieuwe techniek die high-field fMRI-uitlezing combineert met optogenetische stimulatie, waardoor het mogelijk wordt om celtype-specifieke kaarten van functionele neurale circuits en hun dynamica in de gehele levende hersenen te maken.

Optogenetische Functionele MRI

Hier demonstreren we magnetische resonantie (MR)-geleide convectie verbeterde levering (CED) van virale vectoren in de cortex als een efficiënte en vereenvoudigde aanpak voor het bereiken van optogenetische expressie in grote corticale gebieden in de makaak hersenen.

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

De onderstaande methode is bedoeld om een uitgebreid protocol te bieden voor de voorbereiding van niet-menselijke primaten (NHP) neurochirurgie met behulp van een nieuwe combinatie van driedimensionale (3D) printmethoden en MRI-gegevensextractie.

Een MRI-gebaseerde toolbox voor neurochirurgische planning bij niet-menselijke primaten

Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.

Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen

Bioluminescentie - licht uitgezonden door een luciferase-enzym dat een substraat met kleine moleculen oxideert, een luciferine - kan worden gebruikt om fotosensorische eiwitten te activeren, waardoor een andere dimensie wordt toegevoegd aan lichtstimulatie en de manipulatie van een veelheid aan lichtgemedieerde functies in cellen op temporele en ruimtelijke schalen mogelijk wordt.

Bioluminescente optogenetica 2.0: Bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren

Dit artikel schetst geautomatiseerde processen voor neurochirurgische planning van niet-menselijke primaten op basis van MRI-scans (magnetic resonance imaging). Deze technieken maken gebruik van procedurele stappen in programmeer- en ontwerpplatforms om op maat gemaakt implantaatontwerp voor NHP's te ondersteunen. De validiteit van elk onderdeel kan vervolgens worden bevestigd met behulp van driedimensionale (3D) geprinte levensgrote anatomische modellen.

Een gereedschapskist voor het ontwerpen van neurale implantaten voor niet-menselijke primaten

Leer hoe je een grootvolume weefselverlichtingsapparaat bouwt voor optogenetische manipulaties in niet-menselijke primaten. Deze methode minimaliseert weefselschade en vergroot het inzicht in neuronale bijdragen aan gedrag.

Groot Volume, gedragsgestoorde relevante verlichting voor Optogenetics in niet-menselijke primaten

Meer video's verkennen