Basisonderzoek in Plasma geneeskunde - een benadering van de doorvoer van vloeistoffen naar cellen
17 november 2017
High-throughput verkouden fysieke plasma behandeling protocol van vloeistoffen en cellen wordt weergegeven. Het gaat om de oprichting van verschillende grondstof gas composities voor plasma ontsteking, meten van de plasma emissie spectra, en de daaropvolgende analyse van vloeistoffen en cellulaire activiteit na plasma behandeling.
Het algemene doel van deze op meerdere putjes gebaseerde sequentie-assays is om de effecten van koud fysisch plasma op oxidanten beter te begrijpen, op biologische reacties in vitro. Door gebruik te maken van optische emissiespectroscopie, vloeistofonderzoek en cellulaire activiteit, microscopie en flowcytometrie-assays. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van plasmageneeskunde te beantwoorden, met name met betrekking tot plasma-afgeleide directieve soorten, die belangrijk zijn voor de inductie van immunogene kankerceldood. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de semi-geautomatiseerde aanpak.
Het gebruikt 96-welplaten om de snelheid en productiviteit van het onderzoek te verhogen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot toekomstige plasmatherapieën, zoals in de dermatologie of oncologie. En, omdat ze de mogelijkheid bieden om de plasma-afgeleide directieve soorten te identificeren, die relevant zijn voor de biologische reacties.
Felix Niessner, een technicus uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Voor het bewaken van plasmasoorten, plaats een atmosferische plasmastraal voor een optische emissiespectrofotometer, loodrecht op de as van de straal, en gebruik de speciale software om de fotoemissie en golflengte van elke gasconditie te registreren, bij een standaard stroom van twee liter per minuut. Voor de analyse van plasma-behandelde superoxide, stel een eindprotocol in voor de XYZ-tabel, met de juiste respectieve behandelingstijden en putposities.
Voeg vervolgens 100 microliter vers bereide mastermix toe aan de putjes van een heldere, platte-bodem 96-welplaat in triplicaat, en gebruik een microplaatlezer om de absorptie bij 550 nanometer te meten. Om de effecten van plasmabehandeling op cellulaire metabolische reacties te analyseren, zaai in een laminaire stromingskast eenmaal 10 tot de vier cellen van belang in 100 microliter volledig gesupplementeerd celkweekmedium, per put, in een platte-bodem 96-welplaat, en incubeer overnacht. Na overnachte kweek in een celkweekincubator, gebruik de XYZ-tabel om de putjes te behandelen met plasma of gas alleen, volgens de experimentele analyse, en breng de cellen terug in de incubator voor nog eens 20 uur.
Aan het einde van de tweede incubatie, voeg 25 microliter vers celkweekmedium toe, gesupplementeerd met 500 micromolair Resazurin naar de cellen, evenals naar de drie achtergrondcontrole Resazurin-alleen putjes. Breng de cellen terug in de incubator voor een incubatie van drie uur. Meet vervolgens de fluorescentie in een microplaatlezer.
Voor het beeldvormen van de plasma-behandelde cellen, vervang na het lezen van de fluorescentie de supernatanten met 100 microliter vers celkweekmedium, gesupplementeerd met één microgram per milliliter propidiumjodide. Plaats de plaat op een gemotoriseerde microscoopstandaard en selecteer het 20x objectief om de cellen af te beelden. Gebruik vervolgens de geschikte kwantitatieve beeldanalysesoftware om de totale cytosolische oppervlakte in digitale fasecontrastafbeeldingen te bepalen, van alle beeldvelden die in elke put zijn afgebeeld.
Voor flowcytometrische analyse van de plasma-behandelde cellen, was na het beeldvormen de cellen in elke put twee keer met 200 microliter PBS, gesupplementeerd met calcium en magnesium per wasbeurt, gevolgd door labelen met 15 anagrammen per milliliter anti-muis calreticulin monoklonaal antilichaam, in 50 microliter PBS, plus calcium en magnesium per put. Na 15 minuten in de celkweekincubator, was de cellen twee keer met 200 microliter compleet celkweekmedium en voeg 100 microliter celdetacheringsoplossing toe aan elke put gedurende 20 minuten, bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn losgekoppeld, laad de plaat op de flowcytometer en verwerf minimaal 1.000 gebeurtenissen in de voorwaartse en zijwaartse scatterpopulatie, meestal geassocieerd met levensvatbare cellen.
Gebruik vervolgens de geschikte flowcytometrie-analysesoftware om de populatie van belang te scheiden en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de calreticulin-expressie te bepalen. Optische emissiespectroscopie kan worden gebruikt om de verschillende pieken te volgen die verband houden met reactieve plasmacomponenten in verschillende voedselgascondities. Voor de plasmabehandeling van vloeistoffen wordt eerst de verdamping veroorzaakt door het argongas en het argonplasma bepaald, met de condities die verschillende verdampingsresultaten opleveren, aangezien plasma ook effecten heeft op de temperatuur.
Net als de resultaten van de optische emissiespectroscopie voor hydroxylradicalen, neemt de afzetting van waterstofperoxide aanzienlijk af met zuurstof of stikstofmenging, maar neemt toe met bevochtigde voedselgas. Bovendien leidt de toevoeging van stikstof aan het voedselgas tot aanzienlijk hogere nitraatconcentraties, in vergelijking met door argonplasma behandelde vloeistoffen. De meeste superoxide wordt geproduceerd onder droge argongascondities, waarbij zuurstof en/of stikstofmengingen de superoxide-generatie significant verminderen, behalve in aanwezigheid van bevochtigd argonzuurstofplasma.
De fluorescentie-intensiteiten van Resazurin en plasma-behandelde cellen zijn vergelijkbaar met de visueel waargenomen fysieke veranderingen in de supernatanten van de celculturen, wat de cytotoxische effecten van langdurige plasmabehandeling bevestigt. Een afname van het totale celarea wordt ook waargenomen in de plasmabehandelingsmonsterputjes, met name onder de bevochtigde voedselgascondities, met een algemene regulering van calreticulin-kleuring op miren-melanoomcellen, als reactie op kortere blootstelling aan plasmabehandeling. Als het op de juiste manier wordt uitgevoerd, kunnen de mytoplex-cellulaire assays en de uitlezing in slechts enkele uren worden voltooid.
Volgens deze procedure kunnen ook andere methoden worden uitgevoerd, zoals de co-cultuur met immuuncellen of de analyse van celkweeksupernatanten. Dit helpt om aanvullende vragen te beantwoorden over de afgifte van dammen, cyto-klanten of redux-eiwitten, evenals de immuunherkenning van plasma-behandelde melanoomcellen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg geëffend voor verder onderzoek naar melanoomcycli, bijvoorbeeld met 3D-tumorsferoïden.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u basisonderzoek in plasmagenees
Overzicht
Dit artikel presenteert een high-throughput protocol voor de behandeling van vloeistoffen en cellen met koud fysisch plasma, waarbij de focus ligt op de effecten van plasma op biologische responsen in vitro. De studie maakt gebruik van optische emissiespectroscopie en diverse assays om de cellulaire activiteit na de behandeling te analyseren.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plasmageneeskunde
- Cellulaire biologie
- Biochemische analyse
Achtergrond
- Koude fysieke plasma's hebben potentiële toepassingen in de geneeskunde, in het bijzonder bij de behandeling van kanker.
- Inzicht in plasma-afgeleide species is cruciaal voor het induceren van immunogene celdood.
- De studie beoogt de efficiëntie van plasmabehandelingsprotocollen te verbeteren.
- Eerder onderzoek heeft variërende effecten van plasma op verschillende biologische systemen aangetoond.
Doel van de studie
- Om de effecten van koud fysisch plasma op oxidanten en biologische responsen te onderzoeken.
- Om een semi-geautomatiseerde aanpak met multi-well platen te ontwikkelen voor een verhoogde productiviteit.
- Om plasma-afgeleide species te identificeren die relevant zijn voor biologische responsen.
Gebruikte methoden
- Optische emissiespectroscopie voor het monitoren van plasmasoorten.
- 96-wells platen voor high-throughput analyse van cellulaire responsen.
- Flowcytometrie voor het beoordelen van celviabiliteit en immunogene markers.
- Fluorescentiemetingen om de metabole activiteit na behandeling te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Plasmabehandeling heeft een significante invloed op de productie van superoxide en de cellevensvatbaarheid.
- Verschillende samenstellingen van het toevoergas resulteren in variërende resultaten voor plasma-afgeleide species.
- Fluorescentie-intensiteit correleert met de cytotoxische effecten die worden waargenomen in behandelde cellen.
- Kortere plasma-blootstellingstijden kunnen de expressie van calreticuline in melanomacellen verhogen.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol maakt een snelle beoordeling van de effecten van plasma op cellen mogelijk.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de rol van plasma bij cancertherapie.
- Toekomstig onderzoek kan co-cultuursystemen en immuunresponsen op met plasma behandelde cellen verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit high-throughput plasmamedisch protocol maakt een systematische evaluatie mogelijk van de effecten van reactieve species op cellulaire responsen, wat de validatie van targets in oncologische en dermatologische pipelines ondersteunt. Door vloeistoffase-analyse te integreren met cellulaire assays in één enkele workflow, wordt het voorspellend vertrouwen in plasmagebaseerde therapeutische mechanismen verhoogd. De semi-geautomatiseerde benadering met 96-wells platen verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van assays voor vroege discovery-fasen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt plasmagerige reactieve species als modulatoren van immunogene celdoodpaden in melanomacellen.
- Operationele waarde: Maakt parallel testen van meerdere toevoergascondities mogelijk om optimale profielen van reactieve species voor target engagement te identificeren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve resultaten van de metabole activiteit, calreticuline-expressie en cytotoxische effecten van dezelfde behandelde celpopulatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de toediening van de plasmabehandeling via XYZ-tafelpositionering voor een consistente blootstelling per putje in high-density formats.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt plasmaparameters aan de expressie van biomarkers (bijv. calreticuline) die relevant zijn voor immuunherkenning in kankermodellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt dosis-responsprofilering over verschillende blootstellingstijden en gascomposities voor mechanische risicoreductie voorafgaand aan in vivo studies.
Integratie van pipeline en workflow
De methode koppelt plasmakarakterisering (gas/vloeistoffase) aan cellulaire resultaten, wat past binnen workflows voor de overgang van vroege ontdekking naar preklinische fasen voor immunomodulerende kankertherapieën.
- Discovery Biology: Test hypothesen over plasma-geïnduceerde redoxregulatie en mechanismen van immunogene celdood.
- Screening: Maakt reproduceerbare, multiparametrische assay-uitlezingen mogelijk vanuit gestandaardiseerde, met plasma behandelde putjes.
- Analytics: Genereert gecorreleerde datasets op basis van optische emissies, fluorescentie, imaging en flowcytometrie voor multidimensionale responsprofilering.
- Translationeel onderzoek: Stemt plasma-expositiecondities af op de upregulatie van calreticuline als biomarker voor immunogeen potentieel.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van plasmaparameters over diverse celtypen en therapeutische contexten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door plasma-gegenereerde species te koppelen aan specifieke cellulaire pathways.
- Operationele waarde: Verhoogt de doorvoer en vermindert variabiliteit door geautomatiseerde plaatbehandeling en sequentiële uitvoering van assays.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig bewijs te leveren voor de inductie van immunogene celdood.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van plasmaformuleringen op basis van biomarker- en viabiliteitsresultaten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in plasmafysica, celkweek en multi-modale assay-integratie (spectroscopie, microscopie, flowcytometrie).
- Is afhankelijk van toegang tot atmosferische plasmastralen, XYZ-positioneringssystemen en plaatlezers die compatibel zijn met 96-well formaten.
- Vereist cross-team standaardisatie van de timing van de plasmabehandeling, gasmenging en assay-sequencing voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het overdragen van protocollen naar verschillende cellijnen of 3D-modellen buiten monolaag melanoma-kweken.
- Bevat praktische beperkingen zoals verdampings effecten door plasmabehandeling op vloeistofvolumes en de noodzaak van endpoint-specifieke assay-optimalisatie.
