Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom
March 12th, 2018
Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.
Het algemene doel van deze longmetastase-test is om de groei van metastaserende osteosarcoomcellen in levend longweefsel direct te visualiseren en te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van osteosarcoom-metastase. Zoals hoe metastaserende osteosarcoomcellen zich aanpassen, overleven en zich vermenigvuldigen in de micro-omgeving van de long.
Het grote voordeel van deze techniek is dat het een directe visualisatie mogelijk maakt van de groei van metastaserende osteosarcoomcellen in een relevante driedimensionale micro-omgeving. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode het moeilijk vinden, vanwege de technisch uitdagende stappen van het canuleren van de luchtpijp en het inblazen van de long. De injectie van tumorcellen in de staartvene en het euthanaseren van de muis worden uitgevoerd volgens standaard institutionele richtlijnen.
Na vijf minuten plaatst u de geëuthanasieerde muis in dorsale liggende positie op een steriele pad in een laminar flow-kap en gebruikt u kleine, steriele schaar om voorzichtig het borstbeen te disseceren, langs de borstkas tot aan beide zijden van de luchtpijp, zonder de longen te doorboren. Het disseceren van alle spieren en bindweefsel rond de luchtpijp is essentieel voor een succesvolle canuleerbaarheid. Gebruik vervolgens een 20 gauge IV-katheter om de luchtpijp voorzichtig te canuleren en gebruik een steriele catgutnaald om de katheter en de luchtpijp losjes vast te zetten.
Koppel een IV-verlengset van de katheter naar de 10 milliliter spuit van een zwaartekrachtperfusie-apparaat en giet 37 graden Celsius vloeibare agarose gemengd met A-medium oplossing in de spuit. Vul de longen met de agarose-oplossing totdat ze volledig opgeblazen zijn. Verwijder vervolgens de canule en bind de naald stevig vast om lekkage van de agarose-oplossing te voorkomen.
Het is belangrijk om de long intact te houden tijdens het opblazen. Een goede opblazing met agarose en het daaropvolgende afkoelen van de pluck, zal de long in een uitgezette toestand houden. Verzamel de pluck, luchtpijp, hart en long, zorg ervoor dat u het oppervlak van de long niet puncteert of beschadigt.
Plaats de weefsels in 30 milliliter voorgekoelde PBS aangevuld met antibiotica en laat de agarose stollen. Plaats de pluck op ijs gedurende 20 minuten. Na 20 minuten gebruikt u fijne schaar en pincetten om de long in stukken van 3 x 1,5 millimeter te snijden en plaatst u de plakken in individuele putjes van een 6-putjesplaat met 2 x 2 centimeter gelatinesponzen die vooraf gedrenkt zijn in B-medium.
Op de dag van de beeldvorming, brengt u de longsneden voorzichtig van de 6-putjesplaat over in een steriele 35 millimeter glazen bodem ronde schaal in kolommen volgens hun experimentele groep. Vervolgens selecteert u op een breedveldfluorescentiemicroscoop het 2,5x objectief en stelt u de beeldvormingsparameters in om de beste contrast tussen de fluorescente tumorcellen en de niet-fluorescerende achtergrondweefsel in de controleweefselmonstergroep te bieden. Maak beeld van alle monsters met dezelfde parameters als voor de controleweefsels.
Als de software niet schaalgekalibreerd is, maakt u een beeld van een micrometer met hetzelfde objectief als het longweefsel om een schaalreferentie te verkrijgen en slaat u alle beelden op als tif-bestanden. Wanneer alle beelden zijn verkregen, opent u om de beelden in ImageJ te analyseren het eerste bestand. Gebruik het polygoon selectiegereedschap om de hele longplak te omlijnen om het gebied van de totale longplak te bepalen.
Selecteer proces en trek achtergrond af. Stel de rollende balradius in op een startwaarde van 50 pixels. Deze waarde is afhankelijk van de mate van achtergrondfluorescentie en moet voor elke dataset worden geoptimaliseerd.
Zorg ervoor dat u het lichte achtergrondvak uitvinkt. Selecteer afbeelding en type, 8-bits, vervolgens afbeelding en eigenschappen, voer pixels in. Onder lengte-eenheid voert u 1 in voor de pixelbreedte, pixelhoogte en voxeldiepte.
Controleer vervolgens wereldwijd om deze parameters toe te passen op alle volgende afbeeldingen. Selecteer vervolgens afbeelding, vervolgens aanpassen, vervolgens drempel. Markeer standaard en zwart-wit en gebruik de schuifregelaar om de afbeelding zodanig te drempelen dat de meerderheid van de tumorcellen nauwkeurig wordt gemarkeerd.
Klik één keer op toepassen om de long zwart en de fluorescente laesies wit te maken. Klik vervolgens een tweede keer op toepassen om het beeld te spiegelen zodat alle fluorescente structuren zwart worden. Om het aantal en de vorm van de laesies te kwantificeren, selecteert u analyseren en stelt u metingen in en vinkt u gebied aan.
Vink alle andere vakken uit. Selecteer vervolgens analyseer deeltjes en gebruik in het grootteveld het gebied van de kleinste laesie die door ImageJ als een enkele cel is bepaald, om het bereik van vormen dat het programma zal tellen in te stellen. Gebruik een afbeelding van de voertuiggroep van dag nul om de kleinste oppervlakte te kiezen die als een enkele tumorcel wordt beschouwd.
Wanneer de ondergrens is ingesteld, klikt u op oké. Er verschijnt een resultatenvenster met alle getelde vormen en gebiedsmetingen. Kopieer vervolgens de gegevens uit het resultatenvenster en plak deze in een spreadsheet en gebruik de som-wiskundige functie om alle gebieden van de metastaserende laesies voor die specifieke longplak bij elkaar op te tellen.
De metastaserende neigingen voor hoge en lage metastaserende cellijnen zijn visueel duidelijk over progressieve tijdstippen. Meer specifiek tonen deze microscoopbeelden hoe zeer metastaserende cellen de long efficiënter kunnen koloniseren dan laag metastaserende cellijnen. Beeldanalyse, kwantificering en statistische analyse van de beeldgegevens bevestigen dat zeer metastaserende tumorcellen efficiënt de longweefsels kunnen koloniseren.
Terwijl lage metastaserende cellen helemaal niet kunnen groeien. Hoge magneficatieve confocale fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van de longparenchymcellen in grote ruimtelijke detail mogelijk in vergelijking met EGFP-uitdrukkende tumorcellen. Evenals faciliteert de analyse van subcellulaire structure
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft het protocol voor de pulmonaire metastase-assay (PuMA), dat de visualisatie en studie van de groei van metastaserende osteosarcomacellen in longweefsel mogelijk maakt. De methode biedt inzichten in hoe deze cellen zich aanpassen en vermenigvuldigen in een driedimensionale micro-omgeving.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Metastaseonderzoek
Achtergrond
- Metastaserend osteosarcoma is een uitdagende kanker om te bestuderen.
- Begrip van celgedrag in de longmicro-omgeving is cruciaal.
- Het PuMA-model biedt een relevant platform voor dergelijke studies.
- Er bestaan technische uitdagingen bij het uitvoeren van de assay.
Doel van de studie
- Om de groei van metastaserende osteosarcomacellen te visualiseren.
- Om celadaptatie en overleving in longweefsel te onderzoeken.
- Om het begrip van osteosarcoma-metastase te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Cannulatie van de luchtpijp voor longinsufflatie.
- Injectie van tumorcellen in de staartader.
- Gebruik van breedveldfluorescentie of confocale laser-scanning microscopie.
- Naleving van institutionele richtlijnen voor diereneuthanasie.
Belangrijkste resultaten
- Directe visualisatie van metastaserende celgroei bereikt.
- Inzichten in celproliferatie in een driedimensionale omgeving.
- Identificatie van belangrijke overlevingsmechanismen in de long.
- Technische uitdagingen gesignaleerd voor nieuwe onderzoekers.
Conclusies
- De PuMA-assay is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van osteosarcoma-metastase.
- Het biedt cruciale inzichten in metastaserend gedrag.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie om kankermetastase beter te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The pulmonary metastasis assay (PuMA) enables direct visualization of osteosarcoma cell colonization in lung tissue, providing a physiologically relevant model for evaluating metastatic potential and therapeutic intervention. This ex vivo system supports mechanistic de-risking by allowing real-time assessment of tumor cell adaptation, survival, and proliferation in a three-dimensional microenvironment. It enhances predictive confidence in target validation and lead identification by linking phenotypic outcomes to drug effects in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how metastatic osteosarcoma cells adapt and survive in the lung microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of tumor cell behavior in a relevant tissue context.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in metastatic colonization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative image-based readouts of lesion area and number, enabling standardized assessment of metastatic growth across experimental conditions.
- Operational Value: Compatible with widefield and confocal fluorescence microscopy, allowing scalable imaging workflows for compound screening.
- Strategic Value: Supports assay readiness by generating reproducible, quantifiable outputs that can be used to evaluate anti-metastatic therapeutics over time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by using murine lung tissue to model the osteosarcoma metastatic niche, enabling study of microenvironmental interactions.
- Operational Value: Permits longitudinal imaging to assess dynamic changes in tumor growth and response to intervention.
- Strategic Value: Connects discovery-phase findings to preclinical validation by providing a bridge between in vitro models and in vivo metastasis.
Pipeline & Workflow Integration
The PuMA model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, offering a platform to prioritize candidates based on metastatic phenotype.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of how osteosarcoma cells colonize lung tissue and respond to microenvironmental cues.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as metastatic lesion area, which can be measured and compared across treatment groups using image analysis tools like ImageJ.
- Analytics: Generates measurable data on tumor cell proliferation and spatial distribution, supporting statistical analysis to confirm differences between high and low metastatic lines.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using intact lung explants to study gene function, promoter activity, and subcellular structures in metastatic cells.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for evaluating multiple therapeutic candidates or genetic modifiers in a consistent, standardized system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in metastatic potential through direct, visual confirmation of colonization.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, imaging parameters, and quantification protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanistic insight into anti-metastatic efficacy, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to inhibit colonization in a disease-relevant lung microenvironment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, tracheal cannulation, and agarose insufflation to maintain lung integrity.
- Depends on access to fluorescence microscopy systems (widefield or confocal) and image analysis software such as ImageJ for quantification.
- Necessitates standardization across teams in tissue slicing, plating, and imaging conditions to ensure comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different cell lines or genetic backgrounds, particularly in defining single-cell thresholds for particle analysis.
- Limited by the technical complexity of lung dissection and insufflation, which may affect throughput and require training for consistent execution.
