Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom
12 maart 2018
Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.
Het algemene doel van deze longmetastase-test is om de groei van metastaserende osteosarcoomcellen in levend longweefsel direct te visualiseren en te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van osteosarcoom-metastase. Zoals hoe metastaserende osteosarcoomcellen zich aanpassen, overleven en zich vermenigvuldigen in de micro-omgeving van de long.
Het grote voordeel van deze techniek is dat het een directe visualisatie mogelijk maakt van de groei van metastaserende osteosarcoomcellen in een relevante driedimensionale micro-omgeving. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode het moeilijk vinden, vanwege de technisch uitdagende stappen van het canuleren van de luchtpijp en het inblazen van de long. De injectie van tumorcellen in de staartvene en het euthanaseren van de muis worden uitgevoerd volgens standaard institutionele richtlijnen.
Na vijf minuten plaatst u de geëuthanasieerde muis in dorsale liggende positie op een steriele pad in een laminar flow-kap en gebruikt u kleine, steriele schaar om voorzichtig het borstbeen te disseceren, langs de borstkas tot aan beide zijden van de luchtpijp, zonder de longen te doorboren. Het disseceren van alle spieren en bindweefsel rond de luchtpijp is essentieel voor een succesvolle canuleerbaarheid. Gebruik vervolgens een 20 gauge IV-katheter om de luchtpijp voorzichtig te canuleren en gebruik een steriele catgutnaald om de katheter en de luchtpijp losjes vast te zetten.
Koppel een IV-verlengset van de katheter naar de 10 milliliter spuit van een zwaartekrachtperfusie-apparaat en giet 37 graden Celsius vloeibare agarose gemengd met A-medium oplossing in de spuit. Vul de longen met de agarose-oplossing totdat ze volledig opgeblazen zijn. Verwijder vervolgens de canule en bind de naald stevig vast om lekkage van de agarose-oplossing te voorkomen.
Het is belangrijk om de long intact te houden tijdens het opblazen. Een goede opblazing met agarose en het daaropvolgende afkoelen van de pluck, zal de long in een uitgezette toestand houden. Verzamel de pluck, luchtpijp, hart en long, zorg ervoor dat u het oppervlak van de long niet puncteert of beschadigt.
Plaats de weefsels in 30 milliliter voorgekoelde PBS aangevuld met antibiotica en laat de agarose stollen. Plaats de pluck op ijs gedurende 20 minuten. Na 20 minuten gebruikt u fijne schaar en pincetten om de long in stukken van 3 x 1,5 millimeter te snijden en plaatst u de plakken in individuele putjes van een 6-putjesplaat met 2 x 2 centimeter gelatinesponzen die vooraf gedrenkt zijn in B-medium.
Op de dag van de beeldvorming, brengt u de longsneden voorzichtig van de 6-putjesplaat over in een steriele 35 millimeter glazen bodem ronde schaal in kolommen volgens hun experimentele groep. Vervolgens selecteert u op een breedveldfluorescentiemicroscoop het 2,5x objectief en stelt u de beeldvormingsparameters in om de beste contrast tussen de fluorescente tumorcellen en de niet-fluorescerende achtergrondweefsel in de controleweefselmonstergroep te bieden. Maak beeld van alle monsters met dezelfde parameters als voor de controleweefsels.
Als de software niet schaalgekalibreerd is, maakt u een beeld van een micrometer met hetzelfde objectief als het longweefsel om een schaalreferentie te verkrijgen en slaat u alle beelden op als tif-bestanden. Wanneer alle beelden zijn verkregen, opent u om de beelden in ImageJ te analyseren het eerste bestand. Gebruik het polygoon selectiegereedschap om de hele longplak te omlijnen om het gebied van de totale longplak te bepalen.
Selecteer proces en trek achtergrond af. Stel de rollende balradius in op een startwaarde van 50 pixels. Deze waarde is afhankelijk van de mate van achtergrondfluorescentie en moet voor elke dataset worden geoptimaliseerd.
Zorg ervoor dat u het lichte achtergrondvak uitvinkt. Selecteer afbeelding en type, 8-bits, vervolgens afbeelding en eigenschappen, voer pixels in. Onder lengte-eenheid voert u 1 in voor de pixelbreedte, pixelhoogte en voxeldiepte.
Controleer vervolgens wereldwijd om deze parameters toe te passen op alle volgende afbeeldingen. Selecteer vervolgens afbeelding, vervolgens aanpassen, vervolgens drempel. Markeer standaard en zwart-wit en gebruik de schuifregelaar om de afbeelding zodanig te drempelen dat de meerderheid van de tumorcellen nauwkeurig wordt gemarkeerd.
Klik één keer op toepassen om de long zwart en de fluorescente laesies wit te maken. Klik vervolgens een tweede keer op toepassen om het beeld te spiegelen zodat alle fluorescente structuren zwart worden. Om het aantal en de vorm van de laesies te kwantificeren, selecteert u analyseren en stelt u metingen in en vinkt u gebied aan.
Vink alle andere vakken uit. Selecteer vervolgens analyseer deeltjes en gebruik in het grootteveld het gebied van de kleinste laesie die door ImageJ als een enkele cel is bepaald, om het bereik van vormen dat het programma zal tellen in te stellen. Gebruik een afbeelding van de voertuiggroep van dag nul om de kleinste oppervlakte te kiezen die als een enkele tumorcel wordt beschouwd.
Wanneer de ondergrens is ingesteld, klikt u op oké. Er verschijnt een resultatenvenster met alle getelde vormen en gebiedsmetingen. Kopieer vervolgens de gegevens uit het resultatenvenster en plak deze in een spreadsheet en gebruik de som-wiskundige functie om alle gebieden van de metastaserende laesies voor die specifieke longplak bij elkaar op te tellen.
De metastaserende neigingen voor hoge en lage metastaserende cellijnen zijn visueel duidelijk over progressieve tijdstippen. Meer specifiek tonen deze microscoopbeelden hoe zeer metastaserende cellen de long efficiënter kunnen koloniseren dan laag metastaserende cellijnen. Beeldanalyse, kwantificering en statistische analyse van de beeldgegevens bevestigen dat zeer metastaserende tumorcellen efficiënt de longweefsels kunnen koloniseren.
Terwijl lage metastaserende cellen helemaal niet kunnen groeien. Hoge magneficatieve confocale fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van de longparenchymcellen in grote ruimtelijke detail mogelijk in vergelijking met EGFP-uitdrukkende tumorcellen. Evenals faciliteert de analyse van subcellulaire structure
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft het protocol voor de pulmonary metastasis assay (PuMA), waarmee de groei van metastatische osteosarcoomcellen in longweefsel kan worden gevisualiseerd en bestudeerd. De methode biedt inzicht in hoe deze cellen zich aanpassen en prolifereren in een driedimensionale micro-omgeving.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Metastaseringonderzoek
Achtergrond
- Metastatisch osteosarcoom is een uitdagende vorm van kanker om te bestuderen.
- Het begrijpen van het celgedrag in de longmicro-omgeving is cruciaal.
- Het PuMA-model biedt een relevant platform voor dergelijke studies.
- Er zijn technische uitdagingen bij het uitvoeren van de assay.
Doel van de studie
- Om de groei van metastatische osteosarcoomcellen te visualiseren.
- Om celadaptatie en overleving in longweefsel te onderzoeken.
- Om het begrip van osteosarcoommetastase te vergroten.
Gebruikte methoden
- Canulatie van de trachea voor longinsufflatie.
- Injectie van tumorcellen via de staartvene.
- Gebruik van widefield-fluorescentie- of confocale laser-scanningmicroscopie.
- Naleving van institutionele richtlijnen voor euthanasie van dieren.
Belangrijkste resultaten
- Directe visualisatie van metastatische celgroei is gerealiseerd.
- Inzichten in celproliferatie in een driedimensionale omgeving.
- Identificatie van belangrijke overlevingsmechanismen in de long.
- Technische uitdagingen toegelicht voor nieuwe onderzoekers.
Conclusies
- De PuMA-assay is een waardevolle tool voor het bestuderen van osteosarcoommetastase.
- Het biedt cruciale inzichten in het metastatisch gedrag.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie om kankermetastase verder te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De pulmonary metastasis assay (PuMA) maakt directe visualisatie van de kolonisatie van osteosarcomcellen in longweefsel mogelijk, wat een fysiologisch relevant model biedt voor het evalueren van het metastatisch potentieel en therapeutische interventies. Dit ex vivo-systeem ondersteunt mechanistische risicoreductie door real-time beoordeling van de adaptatie, overleving en proliferatie van tumorcellen in een driedimensionale micro-omgeving. Het vergroot het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en leadidentificatie door fenotypische uitkomsten te koppelen aan drugseffecten in een ziekterelevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & validatie van targets
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door te visualiseren hoe metastatische osteosarcoomcellen zich aanpassen en overleven in de longmicro-omgeving.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe observatie van het gedrag van tumorcellen in een relevante weefselcontext.
- Strategische waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door genetische of farmacologische perturbaties te koppelen aan meetbare veranderingen in metastatische kolonisatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve op beelden gebaseerde uitlezingen van de oppervlakte en het aantal laesies, waardoor een gestandaardiseerde beoordeling van metastatische groei over verschillende experimentele condities mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Compatibel met widefield- en confocale fluorescentiemicroscopie, wat schaalbare imaging-workflows voor compound-screening mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Ondersteunt de assay-gereedheid door reproduceerbare, kwantificeerbare resultaten te genereren die kunnen worden gebruikt om anti-metastatische therapeutica over tijd te evalueren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door muislongweefsel te gebruiken om de metastatische niche van osteosarcoom te modelleren, waardoor de studie van micro-omgevingsinteracties mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale beeldvorming mogelijk om dynamische veranderingen in tumorgroei en de respons op interventies te beoordelen.
- Strategische waarde: Verbindt bevindingen uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie door een brug te slaan tussen in vitro-modellen en in vivo-metastase.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het PuMA-model past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische beoordeling en biedt een platform om kandidaten te prioriteren op basis van het metastatische fenotype.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door visualisatie mogelijk te maken van hoe osteosarcoomcellen longweefsel koloniseren en reageren op signalen uit de micro-omgeving.
- Screening: Levert kwantitatieve output, zoals het oppervlak van metastatische laesies, dat kan worden gemeten en vergeleken tussen behandelgroepen met behulp van beeldanalyse-instrumenten zoals ImageJ.
- Analytics: Genereert meetbare gegevens over de proliferatie en ruimtelijke distributie van tumorcellen, wat statistische analyse ondersteunt om verschillen tussen sterk en zwak metastatische lijnen te bevestigen.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij de preklinische continuïteit door intacte long-explantaat te gebruiken voor het bestuderen van genfunctie, promoteractiviteit en subcellulaire structuren in metastatische cellen.
- Enterprise Reuse: Vormt een herbruikbaar platform voor het evalueren van meerdere therapeutische kandidaten of genetische modulatoren in een consistent, gestandaardiseerd systeem.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door ambiguïteit in het metastatisch potentieel te verminderen via directe, visuele bevestiging van kolonisatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde weefselpreparatie, beeldparameters en kwantificeringsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege, mechanistische inzichten te bieden in de anti-metastatische effectiviteit, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van hun vermogen om kolonisatie te remmen in een ziekterelevente longmicro-omgeving.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in muisweefseldissectie, tracheale canulatie en agarose-insufflatie om de integriteit van de longen te behouden.
- Is afhankelijk van toegang tot fluorescentiemicroscopiesystemen (widefield of confocaal) en beeldanalyse-software zoals ImageJ voor kwantificering.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft weefselsnijden, plaatjes en beeldcondities om de vergelijkbaarheid van de resultaten te waarborgen.
- Omvat aanpassingen bij het toepassen van het model op verschillende cellijnen of genetische achtergronden, in het bijzonder bij het definiëren van single-cell drempelwaarden voor partikelanalyse.
- Wordt beperkt door de technische complexiteit van de longdissectie en insufflatie, wat de doorvoer kan beïnvloeden en training vereist voor een consistente uitvoering.
