Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

Het doel van dit protocol is om conditionele knockdown van genexpressie in kankercellen te gebruiken om de recrutering van monocyten en macrofagen naar de tumormicro-omgeving in vitro te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de tumormicro-omgeving over de aard van de kruisstroom tussen de kankercellen en de cellen van het immuunsysteem. Het grote voordeel van deze techniek is dat het systeem dat hier wordt gebruikt, enkel vector-klonering vereist, snelle generatie van meerdere klonen mogelijk maakt en zeer lage niveaus van dikte vertoont.

Ook wordt een methode gedemonstreerd voor de zuivering van humane monocyten zonder direct contact met antilichamen, wat onbedoelde activering voorkomt en resulteert in een meer dan 95% pure populatie van humane monocyten. Om virale deeltjes te produceren, transfecteer 70%confluente 150 millimeter schotels van HEK-293-cellen met 25 microgram pLKO-tet-on shRNA, 25 microgram van het psPAX-packaging-plasmide en vijf microgram van het envelop-expresserende plasmide pMD2. G met behulp van transfectie-reagens volgens standaardprotocollen.

Voeg mix toe aan de 150 millimeter schotels. De volgende dag induceert u de productie van lentiviren in de cellen door het medium te vervangen door DMEM aangevuld met 10 millimolair natriumbutyraat en 20 millimolair HEPES. Kweek gedurende acht uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Na acht uur wast u de cellen met PBS en voegt u 25 milliliter vers DMEM-medium met 20 millimolair HEPES toe en zonder natriumbutyraat. Na incubatie gedurende 48 uur verzamelt u voorzichtig het virusbevattende medium met een pipet. Om stabiele cellijnen te genereren, begint u door HCT-116 colonkankercellen en MDA-MB-231 borstkankercellen in een 12-wellsplaat en 50.000 cellen per well te zaaien.

Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Wanneer de cellen 60-70%confluent zijn, wast u de cellen met PBS en voegt u één milliliter virusbevattend medium toe aan elke well. De volgende dag verwijdert u voorzichtig het virusbevattende medium door aspiratie.

Vervolgens, na het wassen van de cellen met PBS, voegt u medium toe dat tetracycline-vrij FBS bevat. Na 72 uur wast u de cellen zoals eerder en voegt u medium toe dat is aangevuld met één microgram per milliliter puromycine voor de selectie van virus-getransfecteerde cellen. Selecteer virus-getransduceerde cellen door cellen te kweken in aanwezigheid van puromycine gedurende drie tot 14 dagen.

Observeer gedeeltelijk doden van de wells door puromycine in de cellen met virus-getransduceerde cellen. Niet-getransduceerde cellen zullen niet groeien in aanwezigheid van puromycine. Wanneer deze controlecellen dood zijn, blijft u de conditioneel gereguleerde cellijnen twee weken cultiveren in aanwezigheid van antibiotica om de conditioneel gereguleerde cellijnen te creëren.

Controleer de efficiëntie van de conditionele knockdown in de puromycine-resistente HCT-116 colonkanker en MDA-MB-231 borstkankercellen door medium toe te voegen met verschillende concentraties doxycycline en de cellen gedurende 72 uur te kweken. Na het bereiden van cellysaat, controleert u het niveau van knockdown door middel van western blot-analyse. Niveaus van PAI-1 worden hier getoond.

Om perifere bloedmonocyten te isoleren, bereidt u eerst drie 50 milliliterbuizen met 15 milliliter dichtheidsgradiëntoplossing. Gebruik vervolgens een pipettencontroller ingesteld op zwaartekrachtstroom om langzaam 30 milliliter verdund bloed over de dichtheidsgradiëntoplossing te plaatsen. Centrifugeer in een schommelrotor bij 400 g bij kamertemperatuur zonder pauzes gedurende 25 minuten.

Na de centrifugatie, gooit u de bovenste laag weg en brengt u de middelste laag die perifere bloedmononucleaire cellen bevat over naar een verse 50 milliliterbuis en voegt u PBS aangevuld met FBS tot 50 milliliter toe. Centrifugeer bij 120 g's bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na het centrifugeren, verwijdert u de supernatant die bloedplaatjes bevat.

Na de laatste centrifugatie en verzameling, resuspendeert u de pellet in 50 milliliter PBS aangevuld met FBS en telt u de perifere bloedmononucleaire cellen met behulp van een hemocytometer. Na het centrifugeren van de cellen bij 120 g's, resuspendeert u de pellet in PBS aangevuld met FBS dat een millimolair EDTA bevat tot een eindconcentratie van 50 miljoen cellen per milliliter. Begin vervolgens met het verrijken van monocyten door 50 microliter negatieve selectie-antilichaamcocktail toe te voegen voor elke milliliter celsuspensie en te mengen.

Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie, voegt u 50 microliter magnetische kralen per milliliter toe, mengt en incubeert nog eens 10 minuten. Voeg vervolgens PBS met FBS en EDTA toe tot 25 milliliter en plaats de perifere bloedmononucleaire mix in een magneet die een 50 milliliterbuis kan herbergen.

Na incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, zullen de magnetische kralen zich aan de wanden van de buis hechten en de niet-monocytaire cellen uit de oplossing scheiden. Gebruik een 25 milliliter pipet om de oplossing met monocyten uit de buis te verwijderen terwijl u ervoor zorgt dat de pipetten de zijkanten van de buis niet aanraken. Na centrifugeren en verwijderen van het supernatant, resuspendeert u de pellet met monocyten in RPMI-medium dat 10% TET-vrij FBS en 1% pen-strep bevat.

Begin de test door 40.000 HCT-116 of MDA-MB-231-cellen in een volume van 0,5 milliliter in de wells van een 24-wellsplaat in drievoudig te zaaien. De volgende dag voegt u een filter toe aan de well. Plateer vervolgens 8.000 monocyten in een volume van 0,3 milliliter op een met BSA behandelde poreuze membraaninzet geplaatst op de top van de kankercellen en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Verzamel de inzetstukken na 48 uur. Schud het overtollige medium af en veeg de binnenkant precies af met een watt