Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand
26 september 2017
Deze publicatie beschrijft de fabricage van een apparaat van de orgel-on-chip met geïntegreerde elektroden voor directe kwantificering van signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER). Voor een validatie, de bloed - hersen barrière werd geïmiteerd binnen dit microfluidic apparaat en zijn functie als barrière werd gecontroleerd. De gepresenteerde methoden voor de integratie van de elektrode en directe kwantificering van de TEER zijn algemeen toepasbaar.
Het algemene doel van deze video is om te laten zien hoe micro-vloeistofchips met geïntegreerde elektroden kunnen worden vervaardigd en gebruikt voor transendotheliale of transepitheliale elektrische weerstandsmetingen, of TEER-metingen. Dit wordt gedemonstreerd met behulp van een bloed-hersenbarrière in de micro-vloeistofchip. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van Organs-on-Chips door directe meting van de barrièrefunctie van bijvoorbeeld bloed-hersenbarrièreweefsel mogelijk te maken met behulp van geïntegreerde elektroden.
Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat elektroden eenvoudig kunnen worden geïntegreerd in Organ-on-Chip-systemen en dat de resultaten hiervan kunnen worden vergeleken tussen de verschillende systemen. De implicaties van deze technologie strekken zich uit naar het begrijpen van de functie van de bloed-hersenbarrière bij gezondheid en ziekte, geneesmiddelontdekking en gepersonaliseerde geneeskunde. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te geven in de functie van de bloed-hersenbarrière, kan deze ook worden gebruikt in de context van andere Organ-on-Chip-systemen zoals de Lung-on-Chip en de Gut-on-Chip.
Om deze procedure te beginnen, meng 27 gram PDMS-basisagent en 2,7 gram verhardingsmiddel grondig. Ontgast vervolgens het mengsel in een desiccator gedurende ongeveer 45 minuten om luchtbellen te verwijderen. Bereid ondertussen de mal voor de vloeibare PDMS-mix voor door doorzichtige tape rond de mal te plakken, of plaats de mal in een geschikte waferhouder.
Pour de ontgaste PDMS-mix op de mal. Verhard vervolgens de PDMS-mix in een oven op 60 graden Celsius gedurende vier uur en laat het daarna afkoelen. Trek in een kruisstroomkap de uitgeharde PDMS uit de mal.
Snijd de PDMS-replica in afzonderlijke bovenste en onderste chipdelen met behulp van snijlijsten in de PDMS. Bovendien, maak vervolgens vier gaten in de bovenste delen met een scherpe biopsie-punch met een diameter van één millimeter om inlaten en uitlaten te vormen. Puin van binnen naar buiten om te voorkomen dat PDMS-debris zich in de chip verzamelt.
Bedek vervolgens de chipdelen met doorzichtige tape om ze te beschermen tegen stof. Snijd vervolgens de polycarbonaatmembranen van transwell-inserts in vierkanten van ongeveer drie bij drie vierkante millimeter. Verzamel vervolgens een poreuze membraan lekloos tussen twee PDMS-onderdelen om een tweelaags apparaat met een poreuze membraan te monteren.
Bereid daartoe een PDMS-tolueen mortel voor met behulp van 0,7 gram PDMS-basisagent, 07 gram verhardingsmiddel en 540 microliter tolueen. Vorm de mortel grondig, bedek vervolgens 200 microliter mortel op een glazen dekglas met 1500 rpm gedurende 60 seconden om een dunne, uniforme laag mortel te verkrijgen. Breng vervolgens een dunne laag mortel van het dekglas over op het onderste deel van de chip met een inktroller.
Plaats het onderste deel in een ovenbestendige schaal en breng vervolgens de mortel over op het bovenste deel van de chip. Duik met een set pincetten de randen van een membraan in de spin-gecoate mortel en plaats het voorzichtig in het midden van het onderste deel. Plaats vervolgens voorzichtig het bovenste deel op het onderste deel met aandacht voor de uitlijning.
Bedek de chip-inlaten met doorzichtige tape om te voorkomen dat stof in de chip binnendringt en bak ze gedurende drie uur op 60 graden Celsius. Voorzichtigheid is erg belangrijk in deze stap. Oefen geen druk uit op de chip en laat het bovenste deel niet over het onderste deel glijden om te voorkomen dat mortel de kanalen binnendringt en de membraan verstopt.
Om elektroden in de zijkanalen te integreren, snijd een platinadraad in stukken van twee centimeter lang. Dompel ze vervolgens gedurende 30 minuten in aceton. Spoel ze vervolgens af met water en ethanol en laat ze drogen.
Plaats in een kruisstroomkap een chip op een plastic schaal. Breng vier platinadraden in de elektrodekanalen van de chip met behulp van een pincet en buig ze naar beneden op de plastic schaal om ze in de volgende stap aan de schaal te bevestigen. Breng de draden van 0,7 tot één millimeter in het kweekkanaal voorbij de T-vormige kanaalverbinding.
Breng vervolgens een druppel UV-hardende lijm aan bij de ingang van het elektrodekanaal en laat de lijm door capillaire krachten het kanaal vullen. Schakel vervolgens de UV in en laat de lijm uitharden wanneer deze het einde van het elektrodekanaal bereikt. Bevestig de vier geïntegreerde elektroden aan de plastic schaal met een twee-componenten epoxylijm.
Bedek de chips vervolgens met doorzichtige tape en bak ze gedurende twee uur op 60 graden Celsius. Laat ze afkoelen en bewaar ze stofvrij tot gebruik. Om de chips te coaten om celanhechting te bevorderen, vult u beide kanalen eerst met PBS voordat u reagentia introduceert.
Controleer onder een microscoop of er luchtbellen in de kanalen zitten. Als dat het geval is, verwijdert u ze door te spoelen met extra PBS. Vul vervolgens beide kanalen met 30 microliter van 20 microgram per milliliter humane fibronectine in PBS.
Incubeer ze gedurende drie uur op 37 graden Celsius. Spoel vervolgens de chips met endotheelkweekmedium en incubeer ze gedurende twee uur op 37 graden Celsius. Meting van TEER van de lege chips om ervoor te zorgen dat alle elektroden in direct contact zijn met vloeistof in de kanalen.
Neem hiervoor een chip uit de incubator en laat deze gedurende ten minste tien minuten op kamertemperatuur komen. Verwijder eventueel vocht uit de plastic schaal rond de elektroden om elektro-overbrugging buiten de chip te voorkomen. Neem vervolgens het impedantiespectrum van 200 hertz tot één megahertz voor elke combinatie van twee elektroden, wat resulteert in zes impedantiespectra per chip in vijf tot tien minuten, waaruit de TEER direct kan worden bepaald.
Controleer of de impedantiespectra de verwachte magnitudes en vormen hebben om de TEER-meting te valideren. Bereid nu een celsuspensie voor om in het bovenste kana
Overzicht
Deze publicatie presenteert een methode voor het vervaardigen van een organ-on-chip-apparaat met geïntegreerde elektroden voor de directe meting van de transendotheliale elektrische weerstand (TEER). De bloed-hersenbarrière wordt nagebootst binnen dit microfluïdische apparaat, waardoor de monitoring van de barrièrefunctie mogelijk wordt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Microfluidica
- Biomedische Techniek
Achtergrond
- Transendotheliale elektrische weerstand (TEER) is een cruciale maatstaf voor de barrièrefunctie in endotheelcellen.
- Organs-on-chips zijn innovatieve instrumenten voor het bestuderen van de menselijke fysiologie en ziekten.
- De integratie van elektroden in microfluidische apparaten verbetert de meetmogelijkheden.
- De bloed-hersenbarrière is essentieel voor de bescherming van de hersenen en vormt een focuspunt bij de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een microfluidische chip die directe TEER-metingen mogelijk maakt.
- Het valideren van het apparaat met behulp van een model van de bloed-hersenbarrière.
- Het bieden van een methode die toepasbaar is op diverse organ-on-chip-systemen.
Gebruikte methoden
- Fabricage van microfluïdische chips op basis van PDMS met geïntegreerde elektroden.
- Voorbereiding van een poreus membraan om de bloed-hersenbarrière na te bootsen.
- Directe meting van de TEER met behulp van impedantiespectroscopie.
- Celkweektechnieken om endotheelcellen voor de chip voor te bereiden.
Belangrijkste resultaten
- Het gefabriceerde organ-on-chip-apparaat integreerde succesvol elektroden voor TEER-meting.
- Er werden TEER-waarden verkregen die de barrièrefunctie van het bloed-hersenbarrièremodel weerspiegelen.
- De methode maakt vergelijking tussen verschillende organ-on-chip-systemen mogelijk.
- De resultaten wijzen op potentiële toepassingen in geneesmiddelenonderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde.
Conclusies
- De integratie van elektroden in organ-on-chip-apparaten verbetert de nauwkeurigheid van de metingen.
- Deze techniek kan worden toegepast om diverse orgaansystemen buiten de bloed-hersenbarrière te bestuderen.
- Toekomstig onderzoek kan deze methode benutten voor inzichten in gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Directe kwantificering van de transendotheliale elektrische weerstand (TEER) binnen organ-on-chip-systemen voorziet in een kritieke behoefte aan een robuuste, kwantitatieve beoordeling van de barrièreintegriteit in ziekterelevante modellen. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen bij vroege fasen van medicijnontwikkeling en ondersteunt mechanistische risicobeperking voor de bloed-hersenbarrière en andere weefselmodellen. De aanpak maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare metingen mogelijk die vergelijkingen tussen verschillende platforms en portfolio-triage faciliteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van de barrièrefunctie in mens-relevante microfysiologische systemen mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de integriteit van tight junctions in endotheelmodellen te kwantificeren.
- Faciliteert functionele targetvalidatie voor barrière-modulerende verbindingen.
- Biedt kwantitatieve eindpunten voor hypothese-gestuurde pathway-studies.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde TEER-metingen voor de reproduceerbaarheid en benchmarking van assays.
- Bereidt gevalideerde organ-on-chip-platformen voor op workflows voor compound-screening.
- Maakt schaalbare, gemultiplexte resistentiemetingen over meerdere apparaten mogelijk.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van permeabiliteitsmodificerende agentia.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro barrièremodellen uit met ziekterelevante eindpunten voor translationele continuïteit.
- Maakt monitoring van patiëntafgeleide of iPSC-afgeleide endotheelfuncties mogelijk voor gepersonaliseerd onderzoek.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaten die zich richten op barrières van het CZS of epitheelbarrières.
- Biedt mechanistisch inzicht in ziektemodellen zoals neurodegeneratie of inflammatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit TEER-geactiveerde organ-on-chip-systeem is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot de ontwikkeling van preklinische modellen, ter ondersteuning van zowel mechanistische studies als screeningscampagnes.
- Discovery Biology: Kwantitatieve TEER-metingen verduidelijken de barrièrefunctie en ondersteunen hypothesetests in microfluidische modellen.
- Screening: Gestandaardiseerde impedantiegebaseerde read-outs maken reproduceerbare assay-ontwikkeling tussen verschillende apparaten mogelijk.
- Analytics: Multipad-weerstandsgegevens leveren robuuste statistische resultaten voor het vergelijken van condities.
- Translationeel Onderzoek: Ziekterelevante barrièremodellen faciliteren de afstemming van biomarkers en preklinische validatie.
- Enterprise Reuse: Het platform is aanpasbaar aan diverse orgaansystemen, wat een breed nut voor R&D ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar de barrièrefunctie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van TEER-assays.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het bieden van kwantitatieve, vergelijkbare eindpunten.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering mogelijk van kandidaten die zich richten op de barrière-integriteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microfluïdica, impedantiespectroscopie en celkweek.
- Toegang tot microfabricatietools en instrumentatie voor impedantiemetingen is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de integratie van elektroden en data-analyse.
- Aanpasbaar aan diverse organ-on-chip-modellen met een geschikte selectie van membranen en celtypen.
- Praktische beperkingen omvatten de precisie van de elektrodeplaatsing en de kans op verstopping van de kanalen.
