Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Het algemene doel van dit experiment is om de twee tests te rapporteren en vergelijken die worden gebruikt om celinvasie en -migratie te bestuderen, de Boyden kamer test en een geoptimaliseerde in vitro video microscoop-gebaseerde scratch wond test. Deze experimenten kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van invasie en migratie, zoals de keuze van de meest relevante methode. Het grote voordeel van deze geoptimaliseerde in vitro video microscopie-gebaseerde scratch wond test is dat deze een reproduceerbare en nauwkeurige vergelijking biedt tussen behandelingscondities.

Hoewel deze methode celmigratie en -invasie kan beoordelen, kan het ook worden toegepast op andere onderzoeksgebieden zoals genezing of weefselregeneratie. Bereid SQ20B cellen 72 uur voorafgaand aan dag één van de test voor door tweemaal 10 tot de 1/6 cellen in 25 milliliter kweekmedium in een 175 vierkante centimeter kolf te zaaien. Laat de cellen groeien tot 80% celconfluentie bij 37 graden Celsius.

Op dag één na trypsinisatie en celtelling, zaai de cellen in een 25 vierkante centimeter kolf met een celdichtheid van zes keer 10 tot de 1/5 cellen in drie milliliter kweekmedium voor elke te evalueren conditie. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Op de volgende dag, laat de cellen uithongeren door het medium in elke kolf te vervangen door drie milliliter laag foetaal bovien serum medium.

Laat de cellen uithongeren in de 37 graden Celsius incubator gedurende 24 uur. Voor de invasie test, bereid de gecoate Boyden kamers 12 uur na het begin van het uithongeren van de cellen voor. Plaats elke Boyden kamer in de begeleidende plaat.

Voeg 500 microliter uithongeringscel medium toe aan elke gecoate kamer. Op de volgende dag, dag drie, gebruik de begeleidende plaat om de chemo-attractant voor te bereiden. Vul elke put van de 24-wel begeleidende plaat met 750 microliter compleet medium met 10%FBS, hydrocortison, penicilline en streptomycine.

Breng de bovenste kamer over in de voorgevulde begeleidende plaat en zorg ervoor geen bubbels te maken. Voor de invasie test, verwijder voorzichtig 450 microliter kweekmedium uit elke Boyden kamer. Na trypsinisatie en telling van de uitgehongerde SQ20B cellen, zaai drie keer 10 tot de 1/4 cellen in 500 microliter 0,1%BSA medium voor een uiteindelijke verdunning van zes keer 10 tot de 1/4 cellen per milliliter.

Plaats de Boyden kamer in de 37 graden Celsius incubator voor 24 uur. Op dag vier verwijder je elke inzet uit de begeleidende plaat en verwijder voorzichtig de cellen van de bovenste kamer met een wattenstaafje. Fixeer en kleur vervolgens elke inzet afzonderlijk om May-Grunwald Giemsa kleuring te verkrijgen volgens de instructies van de fabrikant.

Voer microscopische analyse uit op dag vijf. Plaats de begeleidende plaat met de inzetjes op een 20X fase contrast microscoop en tel elke gemigreerde cel op het onderste deel van de membraan. 72 uur voorafgaand aan dag één van de test, zaai tweemaal 10 tot de 1/6 SQ20B cellen in 25 milliliter kweekmedium in een 175 vierkante centimeter kolf en laat de cellen groeien tot 80% celconfluentie.

Op dag één na trypsinisatie en celtelling, genereer een voorverdunde steekproef van de SQ20B cellen met een dichtheid van vier keer 10 tot de 1/5 cellen per milliliter. Verdeel 100 microliter van de celoplossing in elke put van een 96-wel plaat om een uiteindelijke dichtheid van vier keer 10 tot de 1/4 cellen per 100 microliter in elke put te krijgen. Plaats de plaat in de 37 graden Celsius incubator en laat de cellen gedurende 12 tot 16 uur aan de plaat hechten.

Op de volgende dag, neem de plaat naar de kap voor wondvorming met behulp van een commercieel wondvormingsapparaat. Verwijder het bovenste deel van de wondmaker en plaats het in de wasboot oplossing. Plaats de plaat in de basisplaathouder en verwijder de plaatdeksel.

Vervang de pinblok door de achterste pennen van het pinblok in de achterste gaten van de basisplaat te leiden. Druk en houd de zwarte hendel ingedrukt en til het pinblok op terwijl je de zwarte hendel ingedrukt houdt. Gebruik een pipet met een aangepaste conische tip om onmiddellijk het medium uit elke put te verwijderen zonder de wond aan te raken.

Was de cellen door aan elke put 100 microliter celmedium toe te voegen dat is opgewarmd tot 37 graden Celsius. Na de tweede wasbeurt, gebruik een pipet met een aangepaste conische tip om het celmedium af te zuigen. Voeg vervolgens 100 microliter medium specifiek voor elke behandelingsconditie toe aan elke put, zorg ervoor geen bubbels in de putten te maken.

Plaats de 96-wel plaat in de aangepaste rek van de video microscoop. Gebruik het video microscoop software programma om het schema van scans in te stellen op één beeld per put. Voor een migratie invasie experiment is een maximale tussenpoos van twee uur vereist.

Als het doel van het experiment is om een video te produceren, is een maximale tussenpoos van 30 minuten te prefereren. Bewaak en controleer de celmigratie gedurende minimaal 24 uur en maximaal vijf dagen met behulp van een geschikte celmasker aangepast voor elk celtype om celmigratie te analyseren. Om een celmasker aangepast voor elke cellijn te verkrijgen, genereer een celverwerkingsdefinitie van de software met behulp van een specifieke celbeeldverzameling.

Traceer de curven en exporteer de gegevens naar een spreadsheet die kan worden gebruikt om de resultaten te analyseren en te vergelijken. Om je voor te bereiden op de celinvasie test, zaai SQ20B cellen op dezelfde manier als gedemonstreerd voor de celmigratie test, en incubeer de 96-wel plaat in de incubator. Op dag twee van de test, bereid de extracellulaire matrix voor.

Ontdooi de matrix bij vier graden Celsius gedurende minimaal 12 uur voor gebruik en zorg ervoor dat er geen aggregaten zichtbaar zijn. Koel de microcentrifugebuizen gedurende vijf minuten op ijs. Verdun de matrix met voor