Name: Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer twee methoden voor celinvasie- en migratieanalyse: de Boydenkamerassay en de geoptimaliseerde videomicroscopische kraswondassay met SQ20B-cellen. Vergelijk de voordelen en beperkingen van beide technieken voor uw onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze technieken werden ontwikkeld met de steun van LabEx PRIEMGETALLEN (ANR-11-LABX-0063), de Contrat Plan-Etat-regio (CPER) in het wetenschappelijke kader van ETOILE (CPER 2009-2013), en lyrische Grant INCa-DGOS-4664.

Opmerking: De Boyden kamer en kras testen zonder opname van de ECM worden aangeduid als de bepaling van de migratie en de dezelfde testen met de ECM wordt aangeduid als de bepaling van de invasie.
1. Boyden kamer Assay
Opmerking: Dit protocol is aangepast voor de cellijn van SQ20B, die is afgeleid van een terugkerende hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) laryngeal kanker en is afkomstig van John Little (Boston, MA, USA).
Dag 1
<ol><li>
Cel zaaien
	<ol>
<li>Zaad 2 106 SQ20B cellen in 12 mL gestolde voedingsbodem (CM) in een maatkolf van 175 cm2 72 h vóór dag en laat de cellen om te groeien tot 80% cel samenkomst.<ol>
<li>Aanvulling ter voorbereiding CM van SQ20B cellen, Dulbecco van gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 0,04 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trypsinize onder de motorkap van een laminaire flow, de cellen. Verwijderen van het medium, wassen van de cellen met steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 2,5 mL trypsine ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (0,5 g/L). Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C en vervolgens zet de reactie stop door toevoeging van 12,5 mL CM opgewarmd tot 37 ° C. Het aantal cellen met behulp van een cel counter.</li>
		<li>Het zaad van de cellen in een maatkolf van 25 cm2 op een celdichtheid van 6-105 cellen voor elk criterium moet worden geëvalueerd. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in 3 mL CM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dag 2
<ol start="2"><li>
Cel honger en voorbereiding van gecoate kamers
	<ol>
<li>De cellen verhongeren door vervanging van het medium in elke kolf met 3 mL laag-foetale runderserum (FBS) medium gebruik van 0,1% bovien serumalbumine (BSA) in plaats van FBS. Verhongeren de cellen gedurende 24 uur in de incubator.<ol>
<li>Ter voorbereiding van honger CM (s-CM), een aanvulling DMEM met 0,1% BSA, 0,04 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor de migratie assay, gaat u naar stap 1.3.</li>
		<li>Voor de invasie assay, 12 h voor dag 3, bereiden de gecoate Boyden kamers door toevoeging van 500 μL van s-CM aan elke beklede kamer. Gebruik van commercieel bereid gecoate Boyden kamers en houd hen bij 4 ° C vóór gebruik. Plaats elke kamer Boyden in de metgezel plaat en zet deze in de incubator bij 37 ° C's nachts.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dag 3
<ol start="3"><li>
Cel zaaien in de zaal van Boyden
	<ol>
<li>Gebruik de plaat metgezel ter voorbereiding van de chemoattractant. Vul elk van de 24-well metgezel plaat met 750 μL van volledige medium met 10% FBS, 0,04 mg/mL hydrocortison 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.<ol>
<li>Passen de chemoattractant voor elke cel-regel en de voorwaarde van elke behandeling. Ter voorbereiding van de chemoattractant CM (ca-CM), een aanvulling DMEM met 10% FCS, 0.4 mg/mL hydrocortison, 100 U/mL penicilline en streptomycine 0.1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Breng het Hogerhuis in de ingevulde metgezel plaat, verzorgen om te voorkomen dat de bubbels.</li>
		<li>Voor de invasie assay, 450 μL van CM zorgvuldig uit elke Boyden kamer te verwijderen.</li>
		<li>Trypsinize onder de motorkap van een laminaire flow, de cellen. Verwijderen van het medium, de cellen met steriel PBS wassen Voeg 0,5 mL trypsine EDTA (0,5 g/L) en vervolgens Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Zet de reactie stop door het toevoegen van CM opgewarmd tot 37 ° C. Het aantal cellen met behulp van een cel counter.</li>
		<li>Zaad 3 104 SQ20B cellen in 500 μL van 0,1% BSA medium, geven een uiteindelijke verdunning van 6 104 cellen/mL. Opmerking: De concentratie van de cel moet worden aangepast voor elke regel van de cel.</li>
		<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dag 4
<ol start="4"><li>
Cel fixatie en kleuring
	<ol>
<li>De cellen herstellen voordat u de verdubbeling keer specifiek voor die cellijn. Fix SQ20B cellen voor 24 h.</li>
		<li>Elke toevoeging van de metgezel-plaat verwijderen en verwijder voorzichtig de cellen van de bovenste kamer met behulp van een wattenstaafje. Het is bijzonder belangrijk voor het verwijderen van alle cellen in de bovenste kamer gelegen.</li>
		<li>Fix en vlek elke plaats individueel om te verkrijgen van mei-Grunwald Giemsa kleuring9 met behulp van de kleuring kit geleverd. Als alternatief, gebruiken 4% paraformaldehyde in een andere metgezel plaat voor de fixatie van een 30 min.</li>
		<li>Houd de inserts in een lege 24-well metgezel plaat onder de motorkap van een laboratorium om te drogen van elke kamer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dag 5
<ol start="5"><li>
Microscopische analyse
	<ol>
<li>Invoegen van de metgezel-plaat met de inzetstukken op een 20 fase contrast-Microscoop en tellen elke gemigreerde cel op het onderste gedeelte van het membraan. Optimaliseren van de positie van de juiste focus door het bewegen van de doelstelling van de bodem naar de top, en stoppen van de positie op het onderste gedeelte van het membraan.</li>
		<li>De verhouding tussen het aantal gemigreerde cellen en geplaatste cellen berekenen. Herhaal elke tellen voor elke behandeling voorwaarde in drievoud.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kras wond Assay: Cel migratie
Opmerking: Instructies moeten worden aangepast voor elk type cel.
Dag 1
<ol><li>
Cel zaaien
	<ol>
<li>Zaad 2 x 106 SQ20B cellen in 12 mL van CM in een maatkolf van 175 cm2 72 h vóór dag en laat de cellen om te groeien tot 80% cel samenkomst.</li>
		<li>Trypsinize onder de motorkap van een laminaire flow, de cellen. Verwijderen van het medium, de cellen met steriel PBS wassen Voeg 2,5 mL trypsine EDTA (0,5 g/L) en Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Zet de reactie stop door toevoeging van 12,5 mL CM opgewarmd tot 37 ° C. Het aantal cellen met behulp van een cel counter.</li>
		<li>Genereer een prediluted monster bij een celdichtheid van 4 x 105/mL, geven een definitieve dichtheid van 4 104 cellen per 100 μl in elk putje. Deze concentratie moet worden aangepast voor elke regel van de cel en moet in het bereik van 1 x 10,4 tot 6 104 cellen.</li>
		<li>Zaad-cellen in ieder putje van een 96-wells-plaat door neerlegging 100 μl van de oplossing bereid in stap 2.1.2.</li>
		<li>Laat de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5 min. te verspreiden van de cellen gelijkmatig over de bodem van de putten.</li>
		<li>Plaats van de plaat in de incubator en laat de cellen zich te houden aan de plaat gedurende 12 tot 16 uur (maximale) bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dag 2
<ol start="2"><li>
Kras wond assay
	<ol>
<li>Verwijder de platen bereid in stap 2.1 uit de incubator.</li>
		<li>Controleer onder de motorkap, een wond met behulp van de commerciële verwonden apparaat volgens protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Onmiddellijke verwijdering van het medium van elk goed met behulp van een precisiepipet met een aangepast conische tip, zorg niet te raken van de wond.</li>
		<li>Het wassen van de cellen tweemaal door het herhalen van de ambitie en het gebruik van 100 μl van CM opgewarmd tot 37 ° C voor elk putje.</li>
		<li>Het verwijderen van de CM met behulp van een precisiepipet met een aangepast conische tip na de stappen wassen.</li>
		<li>Voeg 100 μl van medium specifiek voor elke behandeling voorwaarde aan elk putje.</li>
		<li>Probeer te vermijden dat er luchtbellen in de putjes. Een omgekeerde-pipetting techniek kan hier nuttig zijn. Ook het verwijderen van bubbels met een naald van de spuit.</li>
		<li>Plaats de plaat in het aangepast rack van de video Microscoop.</li>
		<li>Ter verbetering van de kwaliteit van de afbeelding, kunt u de plaat om te warmen gedurende ten minste 15 minuten voordat de eerste scan om te voorkomen dat condens aan de onderkant van de plaat.</li>
		<li>Het programma van de planning scans opgebouwd, met behulp van de video Microscoop software op één afbeelding per putje. Een maximuminterval 2-h is vereist voor een invasie-migratie-experiment. Als het doel van het experiment is om een video te produceren, heeft een interval van 30 minuten maximaal de voorkeur.</li>
		<li>Aan het einde van het experiment, het verwonden apparaat zorgvuldig wassen en volg elk van de vier wassen stappen aangegeven door de fabrikant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dagen 3, 4 en 5
<ol start="3"><li>
Analyse van migratie met behulp van de video Microscoop
	<ol>
<li>Gedurende ten minste 24 uur en maximaal 5 dagen, controleren en de cel migratie.</li>
		<li>Gebruik een masker van de gewenste cel aangepast voor elk celtype cel migratie analyseren. Voor het verkrijgen van een masker van de cel aangepast voor elke regel van de cel, het genereren van een cel verwerken van definitie van de software met behulp van een bepaalde cel foto collectie.</li>
		<li>Sporen van de curven en de gegevens exporteren naar een werkblad, die kan worden gebruikt voor het analyseren en vergelijken van de resultaten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kras wond Assay: Cel invasie
Opmerking: Instructies moeten worden aangepast voor elk type cel.
Dag 1
<ol><li>
Cel zaaien
	<ol>
<li>Hetzelfde protocol gebruiken voor cel zaaien zoals beschreven in stap 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dag 2
<ol start="2"><li>
Voorbereiding van de ECM
	<ol>
<li>Ontdooiing van de matrix voor ten minste 12 uur vóór gebruik bij 4 ° C. Zorg ervoor dat geen aggregaten weergegeven worden. Als aggregaten zichtbaar zijn, houden de matrix bij 4 ° C voor een langere periode tot de aggregaten verdwijnen. Houd de matrix op ijs. Gebruik precooled Pipetteer tips. Opmerking: De matrix zal stollen zoniet bewaard bij 4 ° C.</li>
		<li>Chill de buizen van de microcentrifuge op het ijs gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Neem CM gekoeld tot 4 ° C uit de koelkast en de matrix in de buizen van de precooled microcentrifuge om een eindconcentratie van 300 μg/mL verdund.</li>
		<li>De microcentrifuge-buizen met prediluted matrix terug te keren naar de koelkast bij 4 ° C. Opmerking: Een koeling rack aangepast voor microcentrifuge buizen is nuttig voor het behoud van de buizen bij 4° C gedurende het gehele experiment.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dag 2
<ol start="3"><li>
Kras wond Assay en behandeling van de ECM
	<ol>
<li>Verwijder de plaat bereid in stap 3.1 uit de incubator.</li>
		<li>Controleer onder de motorkap, de wond met behulp van de commerciële verwonden apparaat volgens protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Onmiddellijke verwijdering van het medium van elk goed met behulp van een precisiepipet met een aangepast conische tip verzorgen niet te raken van de wond.</li>
		<li>Wassen van de cellen tweemaal door de aspiratie procedure herhalen en het gebruik van 100 μl van CM opgewarmd tot 37 ° C.</li>
		<li>Na de tweede wash, plaats u de plaat op de 4 ° C incubator aan equilibreer de temperatuur gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Verwijder het koud medium uit elk putje met de pipet aspiratie met een conische tip, verzorgen Pipetteer zorgvuldig van de rand en te voorkomen dat de wond aan te raken.</li>
		<li>Voeg 50 l van prediluted matrix aan elk putje met behulp van precooled conische tips bij 4 ° C.</li>
		<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Opmerking: Een ondersteuning van het voorverwarmde rek bij 37 ° C is handig voor het versnellen van de opwarming van de aarde van de 96-wells-plaat.</li>
		<li>Verwijderen de plaat uit de incubator en voeg 100 μl van de aangepast CM aan elk putje zoals aangegeven voor elke voorwaarde die behandeling.</li>
		<li>Probeer te vermijden dat er luchtbellen in de putjes. Een omgekeerde-pipetting techniek kan hier nuttig zijn. Ook het verwijderen van bubbels met een naald van de spuit.</li>
		<li>Plaats de plaat in het aangepast rack in de video Microscoop.</li>
		<li>Ter verbetering van de kwaliteit van de afbeelding, kunt u de plaat om te warmen gedurende ten minste 15 minuten voordat de eerste scan om te voorkomen dat condens aan de onderkant van de plaat.</li>
		<li>Het programma van de planning scans opgebouwd, met behulp van de video Microscoop software op één afbeelding per putje, in de Scratch wond scan-modus. Een maximuminterval 2-h in vereist voor een invasie-migratie-experiment. Als het doel van het experiment is om een video te produceren, heeft een interval van 30 minuten maximaal de voorkeur.</li>
		<li>Aan het einde van het experiment, het verwonden apparaat zorgvuldig wassen en volg elk van de vier wassen stappen aangegeven door de fabrikant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Dagen 3, 4 en 5
<ol start="4"><li>
Analyse van de invasie van de cel met behulp van een video Microscoop.
	<ol>
<li>Herhaal stap 2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
<li>Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+E-cadherin+and+integrins+in+mesoderm+differentiation+and+migration+at+the+mammalian+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak.</a> Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).</li>
<li>Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+cancer+stem%28-like%29+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).</li>
<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
<li>Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).</li>
<li>Chen, H. -C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/922b/e08c04a3ad311a32ca0fc52644681f1bf8b7.pdf">Boyden chamber assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576902">Wound-healing assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).</li>
<li>Piaton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+best+practice+guidelines+for+May-Gr%C3%BCnwald-Giemsa+staining%3A+literature+review+and+insights+from+the+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Path%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance.</a> Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij rapporteren hier twee verschillende modaliteiten te bestuderen van de cel invasie en migratie-proces. De analyse van dit proces is belangrijk voor het begrip van de factoren die betrokken zijn bij gemetastaseerde herhaling, die zou kunnen worden verklaard door de verhoogde motiliteit van een subpopulatie van kankercellen genoemd kanker stamcellen10,11.
Het experiment van Boyden kamer behoort tot de meest gebruikte technieken om te ...

Cel invasie en migratie zijn betrokken bij de verspreiding van kankercellen, die de belangrijkste oorzaak van resistentie tegen behandeling1 en kunnen leiden tot regionale of metastatische herhaling na kanker behandeling2. De epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) is het eerste proces van cel invasie-migratie in welke kanker cellen van een epitheelweefsel naar een mesenchymale fenotype overschakelen. E-cadherine is een extracellulaire marker van de epitheliale fenotype-3en verhoogde expressie van N-cadherine en vimentin is kenmerkend voor de mesenchymale fenotype4. Migratie hangt ook de intrinsieke vermogen van kankercellen te vallen van de extracellulaire matrix (ECM) door de werking van matrix metalloproteasen5.
Dit mechanisme invasie-migratie is beschreven voor kanker op vele locaties, met name in hoofd en nek kanker6. Veel onderzoekers hebben gericht op de migratie en invasie processen beter te begrijpen hoe de verspreiding van de kankercellen in de hoop dat deze kennis tot nieuwe behandelingsstrategieën leiden zal. Het is van cruciaal belang dat deze studies worden uitgevoerd met behulp van betrouwbare en reproduceerbare testen.
In vitro analyse van de beweeglijkheid van de cel kan worden uitdagende. Vele jaren geleden ontwikkeld, de bepaling van Boyden kamer wordt beschouwd als de standaard voor invasie – migratie analyse7. Echter, het is tijdrovend en vaak onjuist is. Een tweede test is de wond-genezing assay8, waarbij een kras op een celkweek enkelgelaagde maken en vastleggen van beelden van cel invasie en migratie op vaste tijdstippen. Deze techniek is breed bekritiseerd wegens de grote verschillen tussen de resultaten van twee opeenvolgende tests. De toepassing van moderne technologieën, met name in microscopie, heeft echter de reproduceerbaarheid van de kras wond assay verbeterd. Video microscopen kunnen gemakkelijk worden ingevoerd in voorbroeders en real-time beelden van cel migratie kunnen genereren. Deze apparaten registreren microscopische gegevens en voorzien van automatische analyse van de wond cel samenvloeiing na verloop van tijd. Het doel van deze paper is om de bepaling van Boyden kamer en de geoptimaliseerde kras wond bepaling te beschrijven en te discussiëren over de voordelen en de zwakke punten van elke methode.

<table><tbody><tr><td>Fetal Calf Serum Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison oplosbaar in water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>De oplossing moet direct voor gebruik worden bereid omdat deze zeer onstabiel is</td></tr><tr><td>Z1 coulter deeltjes</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Optische microscoop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B cellijn</td><td>Gift from the John Little&rsquo;s Laboratory</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Wound Maker</td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>Bewaar op een veilige en droge plaats</td></tr><tr><td>96-well ImageLock Plate</td><td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox 96F Systeem met CoolSink 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox met M30 Systeem</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Boyden Insert</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Boyden Gecoate Insert</td><td>Dominique Dutcher</td><td>354483</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Companion 24-well Plate</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel standaard</td><td>BD BioScience</td><td>BD 354234</td><td>Bewaar bij -20&deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>RAL 555 Staining Kit</td><td>RAL Diagnostics</td><td>&nbsp;361550</td><td>Bewaar op een veilige en droge plaats</td></tr><tr><td>Microcentrifuge buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>33511</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de video microscoop gebaseerde kras wond assay en de bepaling van boyden kamer

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

De invasie en migratie mogelijkheden van tumorcellen zijn grootste bijdragen aan de progressie van kanker en herhaling. Vele studies hebben onderzocht de migratie en invasie capaciteiten om te begrijpen hoe kankercellen verspreiden, met het doel van de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën. Analyse van de cellulaire en moleculaire basis van deze capaciteiten heeft geleid tot de karakterisatie van cel mobiliteit en de fysisch-chemische eigenschappen van het cytoskelet en mobiele communicatie. Voor vele jaren, de bepaling van Boyden kamer en de kras wond assay geweest de standaardtechnieken cel invasie en migratie te gaan studeren. Deze twee technieken hebben echter beperkingen. De bepaling van de kamer Boyden is moeilijk en tijdrovend, en de bepaling van de kras wond heeft lage reproduceerbaarheid. Ontwikkeling van moderne technologieën, met name in microscopie, is de reproduceerbaarheid van de kras wond assay toegenomen. Met behulp van krachtige analysesystemen, kan een "in-incubator" video Microscoop worden gebruikt om automatisch en real-time analyse van cel migratie en invasie. Het doel van deze paper is te rapporteren en vergelijken van de twee tests gebruikt bij het bestuderen van de cel invasie en migratie: de bepaling van Boyden kamer en een geoptimaliseerde in vitro video Microscoop gebaseerde scratch wond assay.

Wij rapporteren hier twee verschillende methoden voor het analyseren van de cel invasie en migratie. Figuur 1 toont de Boyden kamer experiment. De inserts zijn geplaatst in een metgezel plaat met chemoattractant medium, en de cellen worden overgeënt in CM. Het membraan kan worden gelamineerd (migratie assay) of bekleed (invasie assay). Cellen worden overgeënt in de bovenste kamer in s-CM. De tweede kamer is gevuld met CM als een chemoattractant. De cellen zij...

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Het algemene doel van dit experiment is om de twee tests te rapporteren en vergelijken die worden gebruikt om celinvasie en -migratie te bestuderen, de Boyden kamer test en een geoptimaliseerde in vitro video microscoop-gebaseerde scratch wond test. Deze experimenten kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van invasie en migratie, zoals de keuze van de meest relevante methode. Het grote voordeel van deze geoptimaliseerde in vitro video microscopie-gebaseerde scratch wond test is dat deze een reproduceerbare en nauwkeurige vergelijking biedt tussen behandelingscondities.Hoewel deze methode celmigratie en -invasie kan beoordelen, kan het ook worden toegepast op andere onderzoeksgebieden zoals genezing of weefselregeneratie. Bereid SQ20B cellen 72 uur voorafgaand aan dag één van de test voor door tweemaal 10 tot de 1/6 cellen in 25 milliliter kweekmedium in een 175 vierkante centimeter kolf te zaaien. Laat de cellen groeien tot 80% celconfluentie bij 37 graden Celsius.Op dag één na trypsinisatie en celtelling, zaai de cellen in een 25 vierkante centimeter kolf met een celdichtheid van zes keer 10 tot de 1/5 cellen in drie milliliter kweekmedium voor elke te evalueren conditie. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Op de volgende dag, laat de cellen uithongeren door het medium in elke kolf te vervangen door drie milliliter laag foetaal bovien serum medium.Laat de cellen uithongeren in de 37 graden Celsius incubator gedurende 24 uur. Voor de invasie test, bereid de gecoate Boyden kamers 12 uur na het begin van het uithongeren van de cellen voor. Plaats elke Boyden kamer in de begeleidende plaat.Voeg 500 microliter uithongeringscel medium toe aan elke gecoate kamer. Op de volgende dag, dag drie, gebruik de begeleidende plaat om de chemo-attractant voor te bereiden. Vul elke put van de 24-wel begeleidende plaat met 750 microliter compleet medium met 10%FBS, hydrocortison, penicilline en streptomycine.Breng de bovenste kamer over in de voorgevulde begeleidende plaat en zorg ervoor geen bubbels te maken. Voor de invasie test, verwijder voorzichtig 450 microliter kweekmedium uit elke Boyden kamer. Na trypsinisatie en telling van de uitgehongerde SQ20B cellen, zaai drie keer 10 tot de 1/4 cellen in 500 microliter 0,1%BSA medium voor een uiteindelijke verdunning van zes keer 10 tot de 1/4 cellen per milliliter.Plaats de Boyden kamer in de 37 graden Celsius incubator voor 24 uur. Op dag vier verwijder je elke inzet uit de begeleidende plaat en verwijder voorzichtig de cellen van de bovenste kamer met een wattenstaafje. Fixeer en kleur vervolgens elke inzet afzonderlijk om May-Grunwald Giemsa kleuring te verkrijgen volgens de instructies van de fabrikant.Voer microscopische analyse uit op dag vijf. Plaats de begeleidende plaat met de inzetjes op een 20X fase contrast microscoop en tel elke gemigreerde cel op het onderste deel van de membraan. 72 uur voorafgaand aan dag één van de test, zaai tweemaal 10 tot de 1/6 SQ20B cellen in 25 milliliter kweekmedium in een 175 vierkante centimeter kolf en laat de cellen groeien tot 80% celconfluentie.Op dag één na trypsinisatie en celtelling, genereer een voorverdunde steekproef van de SQ20B cellen met een dichtheid van vier keer 10 tot de 1/5 cellen per milliliter. Verdeel 100 microliter van de celoplossing in elke put van een 96-wel plaat om een uiteindelijke dichtheid van vier keer 10 tot de 1/4 cellen per 100 microliter in elke put te krijgen. Plaats de plaat in de 37 graden Celsius incubator en laat de cellen gedurende 12 tot 16 uur aan de plaat hechten.Op de volgende dag, neem de plaat naar de kap voor wondvorming met behulp van een commercieel wondvormingsapparaat. Verwijder het bovenste deel van de wondmaker en plaats het in de wasboot oplossing. Plaats de plaat in de basisplaathouder en verwijder de plaatdeksel.Vervang de pinblok door de achterste pennen van het pinblok in de achterste gaten van de basisplaat te leiden. Druk en houd de zwarte hendel ingedrukt en til het pinblok op terwijl je de zwarte hendel ingedrukt houdt. Gebruik een pipet met een aangepaste conische tip om onmiddellijk het medium uit elke put te verwijderen zonder de wond aan te raken.Was de cellen door aan elke put 100 microliter celmedium toe te voegen dat is opgewarmd tot 37 graden Celsius. Na de tweede wasbeurt, gebruik een pipet met een aangepaste conische tip om het celmedium af te zuigen. Voeg vervolgens 100 microliter medium specifiek voor elke behandelingsconditie toe aan elke put, zorg ervoor geen bubbels in de putten te maken.Plaats de 96-wel plaat in de aangepaste rek van de video microscoop. Gebruik het video microscoop software programma om het schema van scans in te stellen op één beeld per put. Voor een migratie invasie experiment is een maximale tussenpoos van twee uur vereist.Als het doel van het experiment is om een video te produceren, is een maximale tussenpoos van 30 minuten te prefereren. Bewaak en controleer de celmigratie gedurende minimaal 24 uur en maximaal vijf dagen met behulp van een geschikte celmasker aangepast voor elk celtype om celmigratie te analyseren. Om een celmasker aangepast voor elke cellijn te verkrijgen, genereer een celverwerkingsdefinitie van de software met behulp van een specifieke celbeeldverzameling.Traceer de curven en exporteer de gegevens naar een spreadsheet die kan worden gebruikt om de resultaten te analyseren en te vergelijken. Om je voor te bereiden op de celinvasie test, zaai SQ20B cellen op dezelfde manier als gedemonstreerd voor de celmigratie test, en incubeer de 96-wel plaat in de incubator. Op dag twee van de test, bereid de extracellulaire matrix voor.Ontdooi de matrix bij vier graden Celsius gedurende minimaal 12 uur voor gebruik en zorg ervoor dat er geen aggregaten zichtbaar zijn. Koel de microcentrifugebuizen gedurende vijf minuten op ijs. Verdun de matrix met voor

evaluation-cell-invasion-migration-process-comparison-video

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Onderzoek naar vroege migratie van endotheelcellen (EEC) is belangrijk om de pathofysiologie van bepaalde ziekten te begrijpen en om mogelijk nieuwe strategieën voor therapeutische interventie te identificeren. Het volgende protocol beschrijft technieken om celmigratie te beoordelen die zijn aangepast voor het onderzoek van EEC.

Beoordeling van endotheelcelmigratie na blootstelling aan giftige chemische stoffen

Dit protocol Gegevens een aanpasbare werkwijze celmigratie als reactie op chemoattractanten die ook kunnen worden gebruikt om de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te bepalen uit een polymeermatrix meten.

Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Hier beschrijven we een procedure om te testen de cel migratie in vitro met een geautomatiseerde optische camera Microscoop. De kras assay is wijd verbeid gebruikt wanneer de sluiting van de kras gedurende een ingestelde periode wordt gevolgd. De optische Microscoop kunt betrouwbare en goedkope detectie van cel migratie.

Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

We presenteren een kosteneffectieve methode om de scratch migratie test die een nieuwe aanpak voor het bepalen van celmigratie biedt zonder het gebruik van apparatuur-intensieve methoden. Terwijl fibroblasten werden gebruikt in dit protocol, kan het worden aangepast en gebruikt om extra celtypen en invloeden op celmigratie te bestuderen.

Een kosteneffectieve en aanpasbare scratchmigratietest

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Leer twee methoden voor celinvasie- en migratieanalyse: de Boydenkamerassay en de geoptimaliseerde videomicroscopische kraswondassay met SQ20B-cellen. Vergelijk de voordelen en beperkingen van beide technieken voor uw onderzoek.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer (Video) | JoVE Journal

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Meer video's verkennen