One-Step Protocol voor evaluatie van de wijze van straling veroorzaakte de Clonogenic celdood door fluorescentie microscopie

Het algemene doel van deze test is om de belangrijkste manieren van clonogenetische celdood, veroorzaakt door ioniserende straling, te evalueren op basis van de karakteristieke morfologieën van kernen die zijn gekleurd met DAPI. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van stralingsbiologie. Het grote voordeel van deze snelle en kosteneffectieve techniek is dat de belangrijkste manieren van clonogenetische celdood, veroorzaakt door ioniserende straling, gelijktijdig kunnen worden geëvalueerd.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in de stralingsbiologie moeite hebben met het evalueren van door straling geïnduceerde clonogenetische celdood, omdat er verschillende tests nodig zijn om elke manier van celdood te evalueren. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we grootschalige screeningstests uitvoerden van door straling geïnduceerde clonogenetische celdood met behulp van meerdere cellijnen en stralingsdosissen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de stralingsbiologie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals chemotherapie voor kanker.

De procedure zal worden gedemonstreerd door onze medewerker, Atsushi Shibata. Begin door een scalpel te steriliseren met papieren handdoeken die zijn bevochtigd met 70%ethanol. Gebruik vervolgens de scalpel om een dekglas in een 35 millimeter celkweekbakje te plaatsen.

Voeg in de kweekbak met het dekglas één milliliter kweekmedium toe. Houd nu voorzichtig het midden van het dekglas vast met steriele pincetten en zuig het kweekmedium volledig uit de bak. Bereid vervolgens een drie milliliter celsuspensie in kweekmedium in een 15 milliliter buisje voor.

Voeg de celsuspensie toe aan het kweekbakje. En incubeer het een nacht bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Zorg ervoor dat de cellen aan het dekglas hechten en levend zijn door ze te bekijken onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.

Beschadig nu het bakje met zes grays X-stralingsstraling. Na bestraling, incubeer de cellen in een incubator gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Neem nu de cellen uit de incubator en zuig het kweekmedium uit het kweekbakje.

Snij het uiteinde van een micropipettip van 1.000 microliters ongeveer vijf millimeter van het uiteinde af met een schaar. En gebruik het om één milliliter fixeeroplossing toe te voegen aan het kweekbakje. Breng de fixeeroplossing aan langs de wanden van het kweekbakje om schade aan de cellen te minimaliseren.

Breng vervolgens dit kweekbakje over in een vierkant kweekbakje en schud het voorzichtig om de fixeeroplossing gelijkmatig over het dekglas te verdelen. Incubeer het bakje vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de fixeeroplossing uit het bakje.

Voeg nu twee milliliter PBS toe langs de wanden van het bakje. En zuig vervolgens de PBS. Om voor te bereiden op DAPI-kleuring, voeg vijf microliters DAPI-kleuringsreagens toe op een glazen plaatje.

Verwijder vervolgens het dekglas uit het bakje met een scalpel. En laat overtollig PBS op het dekglas wegvloeien door de rand van het dekglas aan te raken met een papieren handdoek. Monteer nu het dekglas ondersteboven op de druppel DAPI-kleuringsreagens op het glazen plaatje zodat de cellen worden blootgesteld aan het DAPI-kleuringsreagens.

Bekijk ten slotte de gekleurde cellen onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een DAPI-filter. De kernmorfologieën in elk van de drie manieren van celdood worden getoond. Apoptotische cellen zijn te zien met gecondenseerde kernen.

Meerdere lobben worden waargenomen in de kernen van cellen die een mitotische catastrofe ondergaan. Cellen die veroudering ondergaan, vertonen karakteristieke verouderingsgeassocieerde heterochromatine foci. Een vergelijkende observatie van niet-bestraalde kernen en kernen bestraald met zes grays X-stralen wordt getoond.

Cirkels geven kernen aan die apoptose ondergaan, en pijlen geven kernen aan die een mitotische catastrofe ondergaan. Evaluatie van ongeveer 300 kernen die aan bestraling zijn blootgesteld, vergeleken met de controle, wordt getoond. De bestraling met zes grays X-stralen veroorzaakt naar schatting 25%vaker mitotische catastrofe, gevolgd door apoptose met ongeveer 5%en zeer zeldzame verouderingsgebeurtenissen.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de cellen niet te beschadigen door oplossingen direct op de dekglazen aan te brengen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals flowcytometrische analyse of celdoodmarkereiwitten, evenals verouderingsgeassocieerde beta-galactosidasekleuring om veroudering te beoordelen, worden uitgevoerd om elke manier van clonogenetische celdood verder te begrijpen.