Name: One-Step Protocol voor evaluatie van de wijze van straling veroorzaakte de Clonogenic celdood door fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer een snelle methode voor evaluatie van clonogene celdood door ioniserende straling met DAPI-kleuring en fluorescentiemicroscopie. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van apoptose, mitotische catastrofe en senescentie in kankercellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken mevrouw Akiko Shibata voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund door Grants-in-Aid van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan voor programma's voor toonaangevende gediplomeerde scholen, cultiveren van wereldleiders in zware Ion Therapeutics en Engineering.

1. voorbereiding van materialen <ol><li>autoclaaf cover slips.
	<ol><li>Cover slips in een bekerglas van glas plaatsen.</li>
		<li>Dek het bekerglas af van glas met folie.</li>
		<li>Autoclaaf bij 121 ° C op 15 psi 20 min.</li>
		<li>Droog bij 50 ° C. Store bij kamertemperatuur in een cultuur kap.</li>
	</ol></li> <li>Bereiden fixatie oplossing: 3% paraformaldehyde + 2% sucrose in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
	<ol><li>Om een glazen fles van 1000 mL, voeg 700 mL PBS en 30 g paraformaldehyde. 
		Let op: Paraformaldehyde is corrosief, Draag geschikte handsch onen.</li>
		<li>Los paraformaldehyde volledig door verhitting tot 80 ° C, met behulp van een magnetron. 
		Let op: Paraformaldehyde dampen zijn giftig, draag een masker.</li>
		<li>Laat op kamertemperatuur 's nachts.</li>
		<li>Toevoegen van 20 g sacharose.</li>
		<li>Toevoegen PBS te maken van het totale volume 1 L.</li>
		<li>Aliquot in 50 mL tubes. Fixatie oplossing kan worden opgeslagen voor 3 jaar bij-20 ° C of voor 3 maanden bij 4 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Voorbereiding van celkweek Opmerking: deze procedures moeten worden uitgevoerd in een cultuur kap.
<ol><li>Cultuur en passage U2OS menselijke Osteosarcoom cellen om logaritmische groei 5. 
	Opmerking: Andere celtypes kunnen worden gebruikt na het bepalen van de optimale bestraling dosis.</li>
	<li>Veeg een scalpel met papieren handdoeken bevochtigd met 70% ethanol. Met behulp van de scalpel, plaats een cover slip op een 35 mm schotel voor de cultuur van de cel (hierna gewoon aangeduid als &#34; de schotel &#34;). 
	Opmerking: Het aantal cover slips in één schotel kan worden verhoogd op basis van de experimentele ontwerp (zie discussie).</li>
	<li>Add 1 mL voedingsbodems: DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum. 
	Opmerking: Andere media kan worden gebruikt volgens de gekozen celtype.</li>
	<li>Veeg pincet met keukenpapier vochtig met 70% ethanol. Met behulp van de verlostang, zachtjes houdt het midden van de cover slip. De media van de cultuur van de schotel volledig, gecombineerd met behoud van een greep op de cover slip. 
	&#8203; Opmerking: deze stap bevordert immobilisatie van de cover slip op de dish.</li>
	<li>Losmaken van aanhangend gekweekte cellen met behulp van trypsine 5.
	<ol><li>Voedingsbodems van de schotel gecombineerd.</li>
		<li>Voeg 1 mL PBS toe en schud de schotel voorzichtig.</li>
		<li>Gecombineerd PBS van de schotel.</li>
		<li>1 mL trypsine [0.25w/v% EDTA trypsine-1mmol/L] aan het gerecht toevoegen.</li>
		<li>Incubate gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO 2.</li>
		<li>9 mL cultuurmedia toevoegen aan het gerecht.</li>
		<li>Met behulp van een 1000 μL micropipet, maak een suspensie van eencellige.</li>
	</ol></li> <li>Tellen de cellen 5.
	<ol><li>In een buis 1,5 mL, Voeg 0,9 mL celsuspensie en 0,1 mL 0,4% Trypan blauw oplossing.</li>
		<li>Toepassing 10 μL aan een hemocytometer.</li>
		<li>Het aantal onderzoeken onbevlekt (d.w.z., live) cellen onder een Microscoop omgekeerd-fase.</li>
	</ol></li> <li>In een tube van 15 mL, bereiden 3 mL celsuspensie in kweekmedia bij een dichtheid van 0,5 x 10 5 cellen/mL. 
	Opmerking: Cel dichtheid kan worden gewijzigd volgens experimentele nodig (Zie discussie).</li>
	<li>Voorzichtig, voeg 2 mL van de celsuspensie op de dish.</li>
	<li>Incubate's nachts bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO 2.</li>
</ol> 3. Bestraling Let op: het verwerken van de irradiator van de X-ray zorgvuldig volgens de fabrikant &#39; s instructies.
<ol><li>Onderzoeken de cellen onder een Microscoop omgekeerd-fase. Bevestigen dat de cellen zijn gekoppeld aan de cover slip en levend.</li>
	<li>Het bestralen van de schotel met 6 Gy x-stralen (1.4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).</li>
	<li>Incubate gedurende 72 uur bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO 2. 
	Opmerking: Incubatietijd kan worden gewijzigd volgens de experimentele ontwerp (Zie discussie).</li>
</ol> 4. Fixatie <ol><li>cultuur media uit de schotel gecombineerd.</li>
	<li>Met de schaar, knip het uiteinde van een 1.000 μL micropipet tip 5 mm van het einde. 
	Opmerking: De gesneden tip helpt soepel toepassen van de fixatie oplossing.</li>
	<li>Met behulp van de gesneden tip, voeg 1 mL fixatie oplossing (bereid in stap 1.2) aan de schotel van de zijwand van de schotel. 
	Opmerking: Deze stap is tijdgevoelig en dient daarom te worden uitgevoerd zonder micropipet tips bij de verwerking van meerdere monsters. Toepassing van fixatie oplossing direct naar de onderkant van de schotel kan de cellen beschadigen.</li>
	<li>Zet de schotel in een vierkante cultuur schotel. Schud de vierkante cultuur schotel voorzichtig om de fixatie oplossing gelijkmatig verdelen over de cover slip.</li>
	<li>Incubate gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Fixatie-oplossing gecombineerd van de schotel.</li>
	<li>Voeg toe 2 mL PBS op de schotel uit de zijwand van de schotel. 
	Opmerking: Toepassing van PBS rechtstreeks naar de onderkant van de schotel kan de cellen beschadigen.</li>
	<li>Gecombineerd PBS van de schotel.</li>
	Herhaal stap 4.7 en 4.8 tweemaal <li>. 
	Opmerking: De schotel kan worden opgeslagen voor 1 week bij 4 ° C met de stukjes van de cover badend in 2 mL PBS.</li>
</ol> 5. DAPI kleuring <ol><li>een dia glas, van toepassing zijn 5 μl 1 μg/mL DAPI kleuring reagens. 
	Opmerking: De DAPI kleuring reagens is stabiel voor 6 maanden wanneer opgeslagen beschermd tegen licht op of onder de -20 ° C.</li>
	<li>De cover slip met behulp van een scalpel, verwijderen uit de schotel.</li>
	<li>Trekken uit de overtollige PBS op de cover slip door het aanraken van de rand van de slip van de cover met een papieren handdoek.</li>
	<li>Mount de cover slip ondersteboven op de daling van de DAPI kleuring reagens op het glas van de dia, zodat de cellen worden blootgesteld aan DAPI kleuring reagens. 
	Opmerking: Deze stap is tijdgevoelig. Drogen van de DAPI kleuring reagens kan leiden tot suboptimaal kleuring.</li>
	<li>De monsters kunnen worden opgeslagen voor 1 jaar bij -20 ° C.</li>
</ol> 6. Afbeelding van overname <ol><li>onderzocht het monster op een fluorescentie Microscoop. Kernen worden gevisualiseerd met behulp van de filter van de DAPI. 
	Opmerking: Hetzij een 20 X of een 60 X olie lens kan worden gebruikt, volgens de onderzoeker &#39; s belang. Bij het gebruik van een 60 X olie lens, voeg een druppel olie op de cover slip. Wees voorzichtig dat de monsters niet raak de lens; anders, de lens kan worden beschadigd.</li>
	<li>Beelden van kernen met behulp van een CCD camera en digitale afbeelding acquisitie software met de volgende instellingen en parameters te verwerven: DAPI filter, enkelgelaagde beelden, winst van 1 X, en automatische belichting.</li>
	<li>Afwerking beeld overname: veeg de 20 X lens met keukenpapier vochtig met lens cleaner. Veeg de 60 X olie lens met papieren handdoeken met chloroform bevochtigd.</li>
</ol> 7. Evaluatie van Clonogenic cel dood modus <ol><li>In willekeurig geselecteerde beelden, het aantal kernen die voldoen aan de criteria voor apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie totdat het totale aantal getelde kernen 300 tot. Uitvoeren van deze stap in drievoud voor elke experimentele instelling.
	<ol><li>Criteria voor apoptosis: aanwezigheid van apoptotic organen (d.w.z., verkorte en gefragmenteerde kernen) 6 , 7.</li>
		<li>Criteria voor mitotische catastrofe: aanwezigheid van kernen tonen van twee of meer afzonderlijke lobben of micronuclei 8 , 9 , 10.</li>
		<li>Criteria voor cellulaire senescentie: aanwezigheid van senescentie-geassocieerde hétérochromatique foci (SAHF) (d.w.z. nucleair DNA met 30-50 lichte, dichte foci) 2 , 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWouters%2C+BG+%22Basic+Clinical+Radiobiology.+4th+ed%22">Basic Clinical Radiobiology. 4th ed</a>. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Kobayashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+catastrophe+is+a+putative+mechanism+underlying+the+weak+correlation+between+sensitivity+to+carbon+ions+and+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin.</a> Sci. Rep. 7, 40588(2017).</li>
<li>Amornwichet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-ion+beam+irradiation+kills+X-ray-resistant+p53-null+cancer+cells+by+inducing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe.</a> PLoS One. , 115121(2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).</li>
<li>Sawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+sulforaphane+as+a+radiosensitizer+for+murine+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells.</a> Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).</li>
<li>Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C646%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+histone+acetyltransferase+p300%2C+radiosensitizes+lung+cancer+cells+by+enhancing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe.</a> Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+lethality-based+strategy+to+treat+cancers+harboring+a+genetic+deficiency+in+the+chromatin+remodeling+factor+BRG1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1.</a> Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).</li>
<li>Russo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+radiosensitization+of+glioblastoma+cells+by+the+poly+%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+E7016%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016.</a> Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).</li>
<li>Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+through+a+tragedy%3A+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Death through a tragedy: mitotic catastrophe.</a> Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).</li>
<li>Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+breaks+during+mitotic+catastrophe+trigger+%CE%B3H2AX-ATM-p53-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis.</a> J. Cell Sci. 129, 1950(2016).</li>
<li>Torres-Roca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+assay+of+tumor+radiosensitivity%3A+a+roadmap+towards+biology-based+personalized+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Per.+Med%22%5BJournal%5D)">A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy.</a> Per. Med. 9, 547-557 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De kritische stappen in het protocol zijn als volgt. Eerst, cellen moeten worden gekweekt op de schotel van cultuur als een enkelgelaagde omdat het uitvoeren van een morfologische analyse van DAPI gebeitste kernen moeilijk voor meerdere lagen cellen is. Te dien einde in stap 2.9, is zorgvuldige overdracht van de cultuur-schotel naar een incubator aanbevolen; schudden van de cultuur-schotel genereert een werveling van zwevende cellen die tot de concentratie van cellen in het midden van de cultuur-schotel leidt. Bovendien, moet overconfluence leiden tot meerdere lagen cellen worden vermeden. Te dien einde in stap 2.7, kan het aantal cellen ontpit op de cultuur schotel worden gewijzigd op basis van de populatie verdubbeling van tijd en het interval tussen de bestraling en fixatie. Een samenloop van ongeveer 80 ten tijde van de fixatie wordt aanbevolen. Ten tweede, is snelheid belangrijk voor fixatie en DAPI kleuring (d.w.z., stap 4 en 5). Inter monster inconsistentie met betrekking tot de termijnen voor deze stappen kan leiden tot heterogeniteit in de DAPI signaalsterkte in de kernen, die de morfologische beoordeling verhullen zou.
In stap 2.2, kan het aantal cover slips in een enkele cultuur schotel worden verhoogd; een maximum van vier cover slips kan worden geplaatst in een schotel van 35 mm, en het aantal kan verder worden verhoogd met behulp van grotere gerechten. Meerdere cover slips in elke cultuur schotel plaatsen kunt de efficiënte werking van tijd cursus beoordeling voor een bepaalde behandeling (dat wil zeggen, de hoes glijdt kunnen worden verzameld van een cultuur schotel één voor één op meerdere tijdstippen van belang).
Bij stap 3.2, kan de dosis van de bestraling worden gewijzigd volgens de onderzoekers belang. De toepassing van een consistente dosis op meerdere cellijnen kan de vergelijking van de gevoeligheid voor elke modus van de dood van de cel van clonogenic onder de cellijnen. Aan de andere kant, maakt het gebruik van iso-clonogenic overleven doses voor elke cel regel vergelijking van clonogenic cel dood profielen onder de cellijnen. De iso-clonogenic overleven dosis kan worden bepaald door de clonogenic overleven assay12. De D-waarde10 , de dosis die 10% clonogenic overleven biedt, is een gemeenschappelijk eindpunt voor de iso-clonogenic overleven dosis.
In stap 3.3, kan de tijd tussen bestraling fixatie worden gewijzigd volgens de onderzoekers belang; Dit is belangrijk omdat de piek tijd voor IR-veroorzaakte apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie is afhankelijk van de cellijn en behandeling. In dit artikel, we gebruikten 72 h na bestraling als het tijdstip dat zou nuttigst voor de eerste screening van clonogenic cel dood profielen, op basis van meerdere studies door onze fractie en anderen beschreven als volgt1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-Vleug-veroorzaakte apoptosis in cellen vastgesteld van solide tumoren meestal een paar dagen na bestraling plaatsvindt. (ii) X-Vleug-geïnduceerde mitotische catastrofe in kankercellen gebeurt meest prominent op de tweede of derde mitose na vrijlating uit de tijdelijke celcyclus arrestatie geïnduceerd door bestraling van. De release gebeurt meestal ongeveer 24 uur na bestraling, gevolgd door herhaalde tussen intervallen van ongeveer 24 h. (iii) X-Vleug-geïnduceerde cellulaire senescentie wordt duidelijk na een interval afhankelijk van de betrokken cellijn: 2 dagen na bestraling voor sommige vroege gevallen, en de 7 dagen na bestraling voor meeste cellijnen. Na het verkrijgen van een totaalbeeld van de clonogenic-cel dood profielen uit de eerste screening, tijd cursus experimenten zorgt voor een meer gedetailleerde opheldering van de piek tijd voor elke toestand van dood van de cel van de clonogenic in de specifieke cellijn en/of toestand van belang4.
Opgemerkt moet worden dat de DAPI kleuring assay en de bepaling van de overleving clonogenic, een methode van de gouden standaard voor straling gevoeligheid beoordeling, zijn niet uitwisselbaar. Apoptosis en de mitotische ramp slechts duren uren. Dus, detecteert de DAPI kleuring assay voor een bepaald tijdstip apoptosis en mitotische catastrofe die op het tijdstip van de beoordeling plaatsvindt. Aan de andere kant, assay de resultaten van het voortbestaan van clonogenic op een bepaald moment punt omvatten het totale bedrag van apoptosis en de mitotische catastrofe die hebben plaatsgevonden tijdens de incubatieperiode voor meestal 10-14 dagen na bestraling. Verschillende van apoptosis en mitotische catastrofe, verouderend cellen blijven op de schotel van cultuur; zij accumuleren geleidelijk in de tijd na bestraling. De resultaten van zowel de DAPI kleuring assay en de bepaling van de overleving clonogenic weerspiegelen derhalve de totale hoeveelheid senescentie die hebben plaatsgevonden tijdens de incubatieperiode. Nog belangrijker is, het aandeel van apoptosis, mitotische catastrofe en senescentie geïnduceerd door bestraling van verschilt volgens cel lijn en bestraling dosis. Tezamen, theoretisch, kunnen niet de resultaten van een test worden omgezet direct die van de andere bepaling.
De DAPI kleuring assay heeft een paar beperkingen. Ten eerste, het blijft controversieel of mitotische catastrofe een aparte manier van celdood is. Op het gebied van straling biologie, mitotische catastrofe wordt beschouwd als een belangrijke vorm van IR-veroorzaakte celdood die verschilt van andere mechanismen van clonogenic cel dood1. Aan de andere kant, argumenteren anderen dat mitotische catastrofe is niet een aparte modus van celdood, maar eerder een proces dat voorafgaat aan de dood van de cel met inbegrip van apoptosis en de necrose13,14. Dus, apoptosis en de mitotische catastrofe kunnen overlappen elkaar tot op zekere hoogte. Tweede, vorige studies suggereren dat cellulaire senescentie bij gebrek aan SAHF in sommige cellijnen en behandeling instellingen2 optreden kan. Aanwezig, andere testen, speciaal ontworpen voor elke cel clonogenic moet dood modus worden gebruikt te verhogen van de robuustheid van de conclusies van een gegeven experiment. Ten derde, de DAPI kleuring assay kan niet beoordelen vervoerswijzen clonogenic celdood dan apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie (bijvoorbeeldnecrose en autophagy). Ten vierde heeft het nut van de DAPI kleuring assay als voorspeller van tumor reactie op radiotherapie niet is toegelicht in de kliniek. Vanuit dit oogpunt is de clonogenic overleven assay, die het totale bedrag van de dood van de cel van de clonogenic beoordeelt, superieur aan de DAPI kleuring assay omdat een correlatie tussen SF2, de overlevende Fractie van cellen bestraald met 2 Gy is vastgesteld X-stralen, en de reactie van de tumor op radiotherapie15. Het is echter opmerkelijk dat de bepaling van de overleving clonogenic niet wijd in de kliniek, voornamelijk als gevolg van de eis voor een hoge mate van deskundigheid en een lange periode van tijd (d.w.z., 14 dagen) wordt gebruikt voor data-acquisitie. Ter vergelijking: de procedure voor de DAPI kleuring assay is eenvoudiger en kost aanzienlijk minder tijd, ongeveer 3-4 dagen, om resultaten te genereren. Het nut van de DAPI kleuringassay als voorspeller van tumor reactie op radiotherapie zal worden getest in de kliniek in de nabije toekomst.
Kortom is de DAPI kleuring assay een kosteneffectieve one-step test gelijktijdig beoordelen de drie belangrijke takken van clonogenic IR-veroorzaakte celdood. Deze aanpak maakt het mogelijk om gemakkelijk het scherm voor de modi van de dood van de cel van clonogenic voor verschillende cellijnen, behandelsettings en tijdstippen, met het doel van het ophelderen van de mechanismen van celdood in de doelcellen en de voorwaarden van belang.

Ioniserende straling (IR) induceert meerdere modi van de dood van de cel van de clonogenic. Onderzoek naar de dood van de cel van de IR-geïnduceerde clonogenic is belangrijk voor het begrijpen van de toxiciteit van IR aan normale weefsels, alsmede voor de ontwikkeling van methoden om de doeltreffendheid van de behandeling van kanker radiotherapie. Apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie zijn de belangrijke modi van de dood van de cel clonogenic geïnduceerd door IR1. Apoptosis is een gereguleerde manier van celdood die wordt geïnitieerd door DNA schade1. Mitotische catastrofe is de dood van de cel die optreedt als gevolg van afwijkende mitose als gevolg van herstelde DNA dubbele-strand einden1. Cellulaire senescentie wordt gedefinieerd als een staat van onomkeerbare cel groei arrestatie2; Merk op dat cellulaire senescentie niet per se celdood is, maar het is een wijze van de dood van de cel van de clonogenic omdat het schaft het voortbestaan van de clonogenic van de verouderend cel.
Verschillende cel-gebaseerde testen zijn ontwikkeld voor het individueel beoordelen apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie. Apoptosis kan worden geëvalueerd door de terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) kleuring, Annexine V kleuring DNA fragmentatie testen en sub-G1 celcyclus fase bepaling door stroom cytometry1. Mitotische catastrofe kan worden beoordeeld door immunofluorescentie kleuring voor mitotische markeringen, met inbegrip van MPM2, TUNEL kleuring en elektronenmicroscopie1. Cellulaire senescentie kan worden beoordeeld door senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) kleuring, groei-arrestatie testen en elektronenmicroscopie1. Nog belangrijker is, is de overheersende wijze van de dood van de cel van de clonogenic verschilt onder cellijnen en behandeling instellingen3,4. Daarom, om te verhelderen van het algehele profiel van de dood van de cel van clonogenic voor een bepaalde experimentele instelling, meerdere tests rekening houdend met alle van de volgende modi van de dood moeten plaatsvinden samen, die - en kosten-arbeidsintensief is.
In dit artikel beschrijven we een snelle en kosteneffectieve one-step-assay voor het gelijktijdig ramingskosten van apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie geïnduceerd door IR3,4. Bij deze methode zijn de cellen geteeld op een cover slip bestraald met x-stralen en gekleurd met 4', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI). Met behulp van fluorescentie microscopie, worden apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie elk geïdentificeerd op basis van de respectieve karakteristiek morphologies van de DAPI gebeitste kernen. Deze aanpak zal zitten nuttig voor toepassingen met inbegrip van screening voor clonogenic cel dood profielen in verschillende cellijnen behandelsettings en tijdstippen, met het doel van het onderzoek naar de mechanismen van celdood in de doelcellen en de voorwaarden van belang.

```html
<table><tbody><tr><td>cover slip</td><td>Matsunami</td><td>C013001</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-250G</td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline</td><td>Cosmo Bio</td><td>16232000</td><td></td></tr><tr><td>scalpel</td><td>Kai Medical</td><td>No.20, 520-A</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cell culture dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>inverted phase microscope</td><td>Shimazu</td><td>114-909</td><td></td></tr><tr><td>X-ray irradiator</td><td>Faxitron Bioptics</td><td>Faxitron RX-650</td><td></td></tr><tr><td>square culture dish</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>slide glass</td><td>Matsunami</td><td>Pro-11</td><td></td></tr><tr><td>DAPI staining reagent</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope DAPI filter</td><td>Nikon</td><td>U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope lens (20&times;)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 20X/0.75</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope lens (60&times;, oil)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 60X/1.40 oil</td><td></td></tr><tr><td>oil</td><td>Olympus</td><td>N5218600</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>digital image acquisition software</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Document</td><td></td></tr><tr><td>lens cleaner</td><td>Olympus</td><td>OT0552</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Wako</td><td>035-02616</td><td></td></tr></tbody></table>
```

one-step protocol voor evaluatie van de wijze van straling veroorzaakte de clonogenic celdood door fluorescentie microscopie

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

Onderzoek naar ioniserende straling (IR)-de dood van de cel van de geïnduceerde clonogenic is belangrijk voor het begrijpen van het effect van IR op tumoren en normale weefsels. Hier beschrijven we een snelle en kosteneffectieve one-step-assay voor het gelijktijdig het beoordelen van de belangrijkste wijzen van clonogenic celdood geïnduceerd door IR, dat wil zeggen, apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie. Bij deze methode zijn de cellen geteeld op een cover slip bestraald met x-stralen en gekleurd met 4', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI). Met behulp van fluorescentie microscopie, worden apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie geïdentificeerd op basis van de karakteristieke morphologies van de DAPI gebeitste kernen. Apoptosis wordt bepaald door de aanwezigheid van apoptotic organen (d.w.z., verkorte en gefragmenteerde kernen). Mitotische catastrofe wordt bepaald door de aanwezigheid van kernen die twee of meer afzonderlijke lobben en micronuclei vertonen. Cellulaire senescentie wordt bepaald door de aanwezigheid van senescentie-geassocieerde hétérochromatique foci (d.w.z.nucleair DNA met 30-50 lichte, dichte foci). Deze benadering biedt de experimentator te gemakkelijk scherm voor clonogenic cel dood modi met behulp van verschillende cellijnen, behandelsettings, en/of tijdstippen, met het doel van het ophelderen van de mechanismen van celdood in de doelcellen en de voorwaarden van belang.

Als voorbeeld, werden U2OS menselijke Osteosarcoom cellen behandeld met 6 Gy x-stralen, 72 uur ge¨ uncubeerd, en onderworpen aan de DAPI kleuring assay volgens het protocol. Figuur 1 toont de ingezoomde beelden voor de typische nucleaire morphologies gekoppeld apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie verkregen met behulp van een 60 × olie lens. Verwijzen naar de stappen 7.1.1-7.1.3 voor de karakteristieke morphologies voor elke toestand van de dood van de cel van de clonogenic. Figuur 2 toont overzicht beelden van kernen verkregen met behulp van een 20 X zoomlens. Bestraling met 6 Gy x-stralen geïnduceerde mitotische ramp vaak, minder vaak apoptosis en cellulaire senescentie zelden. Op deze manier op een laag-vergroting veld onderzoek maakt het mogelijk om vatten in één oogopslag het totaalbeeld van de clonogenic cel dood profiel in een bepaalde experimentele setting. Figuur 3 ziet u een grafische weergave van de gekwantificeerde gegevens.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg"> 
Figuur 1: beelden van de DAPI gebeitste kernen met typische morphologies van apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie ingezoomd. U2OS cellen werden bestraald met 6 Gy x-stralen. Na 72 uur, werden de cellen vast en gekleurd met DAPI. Nucleaire beelden werden verkregen met behulp van een 60 X olie lens. Schaal bar = 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg"> 
Figuur 2: overzicht beelden van DAPI gebeitste kernen van cellen behandeld met röntgenstralen. U2OS cellen werden bestraald met 6 Gy x-stralen of mock-bestraald. Na 72 uur, werden de cellen vast en gekleurd met DAPI. Beelden van kernen werden verkregen met behulp van een 20 X zoomlens. Cirkels, apoptosis; pijlen, mitotische catastrofe. Schaal bar = 50 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg"> 
Figuur 3: gekwantificeerde gegevens voor apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie geïnduceerd in cellen die zijn behandeld met röntgenstralen. U2OS cellen werden bestraald met 6 Gy x-stralen of mock-bestraald. Na 72 uur, werden de cellen vast en gekleurd met DAPI. Beelden van kernen werden verkregen met behulp van een 20 X zoomlens. Uit willekeurige velden, een totaal van 300 kernen werden geëvalueerd voor apoptosis (Ap), mitotische catastrofe (MC) en cellulaire senescentie (Sns). De evaluaties werden uitgevoerd in drievoud. Gemiddelde waarden worden weergegeven, en foutbalken geven standaarddeviaties. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Onderzoek naar ioniserende straling (IR)-de dood van de cel van de geïnduceerde clonogenic is belangrijk voor het begrijpen van de effecten van IR op tumoren en normale weefsels. Hier beschrijven we een one-step-assay voor het beoordelen van de belangrijkste wijzen van clonogenic IR-veroorzaakte celdood op basis van morfologie van 4', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI)-gekleurd kernen gevisualiseerd door fluorescentie microscopie.

One-Step Protocol voor evaluatie van de wijze van straling veroorzaakte de Clonogenic celdood door fluorescentie microscopie

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

Het algemene doel van deze test is om de belangrijkste manieren van clonogenetische celdood, veroorzaakt door ioniserende straling, te evalueren op basis van de karakteristieke morfologieën van kernen die zijn gekleurd met DAPI. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van stralingsbiologie. Het grote voordeel van deze snelle en kosteneffectieve techniek is dat de belangrijkste manieren van clonogenetische celdood, veroorzaakt door ioniserende straling, gelijktijdig kunnen worden geëvalueerd.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in de stralingsbiologie moeite hebben met het evalueren van door straling geïnduceerde clonogenetische celdood, omdat er verschillende tests nodig zijn om elke manier van celdood te evalueren. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we grootschalige screeningstests uitvoerden van door straling geïnduceerde clonogenetische celdood met behulp van meerdere cellijnen en stralingsdosissen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de stralingsbiologie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals chemotherapie voor kanker.De procedure zal worden gedemonstreerd door onze medewerker, Atsushi Shibata. Begin door een scalpel te steriliseren met papieren handdoeken die zijn bevochtigd met 70%ethanol. Gebruik vervolgens de scalpel om een dekglas in een 35 millimeter celkweekbakje te plaatsen.Voeg in de kweekbak met het dekglas één milliliter kweekmedium toe. Houd nu voorzichtig het midden van het dekglas vast met steriele pincetten en zuig het kweekmedium volledig uit de bak. Bereid vervolgens een drie milliliter celsuspensie in kweekmedium in een 15 milliliter buisje voor.Voeg de celsuspensie toe aan het kweekbakje. En incubeer het een nacht bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Zorg ervoor dat de cellen aan het dekglas hechten en levend zijn door ze te bekijken onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.Beschadig nu het bakje met zes grays X-stralingsstraling. Na bestraling, incubeer de cellen in een incubator gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Neem nu de cellen uit de incubator en zuig het kweekmedium uit het kweekbakje.Snij het uiteinde van een micropipettip van 1.000 microliters ongeveer vijf millimeter van het uiteinde af met een schaar. En gebruik het om één milliliter fixeeroplossing toe te voegen aan het kweekbakje. Breng de fixeeroplossing aan langs de wanden van het kweekbakje om schade aan de cellen te minimaliseren.Breng vervolgens dit kweekbakje over in een vierkant kweekbakje en schud het voorzichtig om de fixeeroplossing gelijkmatig over het dekglas te verdelen. Incubeer het bakje vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de fixeeroplossing uit het bakje.Voeg nu twee milliliter PBS toe langs de wanden van het bakje. En zuig vervolgens de PBS. Om voor te bereiden op DAPI-kleuring, voeg vijf microliters DAPI-kleuringsreagens toe op een glazen plaatje.Verwijder vervolgens het dekglas uit het bakje met een scalpel. En laat overtollig PBS op het dekglas wegvloeien door de rand van het dekglas aan te raken met een papieren handdoek. Monteer nu het dekglas ondersteboven op de druppel DAPI-kleuringsreagens op het glazen plaatje zodat de cellen worden blootgesteld aan het DAPI-kleuringsreagens.Bekijk ten slotte de gekleurde cellen onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een DAPI-filter. De kernmorfologieën in elk van de drie manieren van celdood worden getoond. Apoptotische cellen zijn te zien met gecondenseerde kernen.Meerdere lobben worden waargenomen in de kernen van cellen die een mitotische catastrofe ondergaan. Cellen die veroudering ondergaan, vertonen karakteristieke verouderingsgeassocieerde heterochromatine foci. Een vergelijkende observatie van niet-bestraalde kernen en kernen bestraald met zes grays X-stralen wordt getoond.Cirkels geven kernen aan die apoptose ondergaan, en pijlen geven kernen aan die een mitotische catastrofe ondergaan. Evaluatie van ongeveer 300 kernen die aan bestraling zijn blootgesteld, vergeleken met de controle, wordt getoond. De bestraling met zes grays X-stralen veroorzaakt naar schatting 25%vaker mitotische catastrofe, gevolgd door apoptose met ongeveer 5%en zeer zeldzame verouderingsgebeurtenissen.Eenmaal beheerst, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de cellen niet te beschadigen door oplossingen direct op de dekglazen aan te brengen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals flowcytometrische analyse of celdoodmarkereiwitten, evenals verouderingsgeassocieerde beta-galactosidasekleuring om veroudering te beoordelen, worden uitgevoerd om elke manier van clonogenetische celdood verder te begrijpen.

one-step-protocol-for-evaluation-mode-radiation-induced-clonogenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

De toepasselijkheid van de Monogene assay voor het evalueren van reproductieve levensvatbaarheid is vastgesteld voor meer dan 50 jaar. Hier laten we zien de algemene procedure voor het uitvoeren van de Monogene assay met hechtende cellen.

Monogene Assay: hechtende cellen

Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.

Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

This video demonstrates the methodology to screen for major cell death profiles in ionizing radiation (IR) induced cancer cell lines using DAPI staining assay. The DAPI-stained nuclei of target cells undergoing cell death exhibit distinct morphologies and can be easily identified by fluorescence microscopy.

Cell Death Screening Using DAPI Staining: A Method for Rapid Screening of IR Induced Clonogenic Cell Death in Cancerous Cell Lines

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de toepassing van rhodamine 123 CLIC4 knockdown-geïnduceerde HN4 cel apoptosis in vitrostudie te identificeren van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP). Onder gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en confocale laser scanning fluorescentie Microscoop, werd de real-time verandering van de MMP opgenomen.

Detectie van Mitochondria membraanpotentiaal CLIC4 Knockdown-geïnduceerde HN4 cel Apoptosis om te studeren In Vitro

Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

Live-cel imaging biedt een schat aan informatie op afzonderlijke cellen of hele populaties die onbereikbaar is door de vaste cel imaging alleen. Hier, worden live-cel imaging protocollen te beoordelen cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel beschreven.

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8+ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en kosteneffectieve methode om celdood in menselijke colonorganoïden te onderzoeken en te kwantificeren als reactie op cytotoxische perturbagens zoals cytokines. De aanpak maakt gebruik van een fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), live fluorescentiemicroscopie en open-source beeldanalysesoftware om enkelvoudige organoïde reacties op cytotoxische stimuli te kwantificeren.

Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Leer een snelle methode voor evaluatie van clonogene celdood door ioniserende straling met DAPI-kleuring en fluorescentiemicroscopie. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van apoptose, mitotische catastrofe en senescentie in kankercellen.

One-Step Protocol voor evaluatie van de wijze van straling veroorzaakte de Clonogenic celdood door fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen