Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing
24 augustus 2017
Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.
Het algemene doel van deze techniek is om mutaties met een lage frequentie in circulerend tumor- of ctDNA te detecteren om klinische artsen een krachtig hulpmiddel te bieden voor het diagnosticeren van tumoren en het monitoren van tumordynamiek als reactie op therapie. De methode van ctDNA-testen kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over wat voor soort mutaties een patiënt draagt, zoals enkele nucleus-type variatie, invoegingsverwijdering, kopienummervariaties en structurele variatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge gevoeligheid en specificiteit die de nauwkeurige detectie van mutaties met een lage frequentie in ctDNA mogelijk maakt.
De procedures zullen worden gedemonstreerd door Yuliang Yang, een technicus uit mijn laboratorium. Om te beginnen, trek 10 milliliter perifeer bloed in een opvangbuis en draai de buis zachtjes zes tot acht keer om en neer om de inhoud te mengen. Bewaar de bloedmonsters in de opvangbuizen bij zes tot 37 graden Celsius gedurende maximaal 72 uur.
Centrifugeer de opvangbuis bij 1.600 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gebruik vervolgens een wegwerppipet om het supernatant of plasma van de buis over te brengen naar vier schone centrifugebuizen van twee milliliter met een geschikt label zonder de pellet te verstoren. Gebruik een schone wegwerppipet om één milliliter van de cellen over te brengen naar een centrifugebuis van twee milliliter met een geschikt label.
Bewaar de cellen bij min 20 graden Celsius of kouder voor genomische of gDNA-isolatie. Centrifugeer vervolgens het plasma bij 1.600 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng het plasma vervolgens over naar schone centrifugebuizen die correct zijn gelabeld als plasma, waarbij ongeveer 0,1 milliliter restvolume aan de bodem wordt achtergelaten om besmetting te voorkomen.
De buffycoat moet tijdens het scheidingsproces worden vermeden in het plasma. Anders kunnen grote DNA-fragmenten die uit de cellen worden geëxtraheerd, de ctDNA verdunnen en de gevoeligheid van de test beïnvloeden. Gebruik een commercieel verkrijgbaar kit om cfDNA te isoleren uit drie milliliter van het verzamelde plasma volgens de instructies van de fabrikant.
Isoleer vervolgens ook met een kit gDNA uit 200 microliter witte bloedcellen volgens de instructies van de fabrikant. Om het gDNA-controlemonster te fragmenteren door sonicatie, bereid één microgram gDNA-monster in 100 microliter Tris-EDTA-buffer in een schone sonicatiebuis voor. Stel het sonicatieprogramma in op 30 seconden aan en 30 seconden uit gedurende 12 cycli voor een totaal van 12 minuten.
Nadat is bevestigd dat het product fragmenten van 200 tot 250 basenparen bevat, breng alle fragmentatieproducten over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter die 150 microliter magnetische korrels bevat en incubeer het monster gedurende vijf minuten om de juiste fragmenten te selecteren. Plaats vervolgens de buis gedurende 30 seconden op een magnetische rek en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens, terwijl de buis op de rek blijft, 200 microliter vers bereide 80%ethanol toe om de korrels te wassen.
Incubeer de korrels gedurende 30 seconden voordat u het supernatant verwijdert en herhaal de wassing. Houd de buis op de rek met de deksel open om de korrels te laten drogen. Eluteer vervolgens de DNA-fragmenten door 32 microliter van 10 millimolair Tris-HCL toe te voegen aan de korrels.
Volg de instructies van de fabrikant om de end-prep-reactie uit te voeren. Voeg in een steriele, nuclease-vrije buis zeven microliter reactiebuffer toe, drie microliter enzymmix, 30 nanogram cfDNA en tweemaal gedestilleerd water voor een totaal volume van 60 microliter. Voeg in een aparte buis dezelfde componenten toe, maar met één microgram gDNA in plaats van cfDNA. Incubeer het mengsel in een thermische cycler bij 20 graden Celsius gedurende 30 minuten, gevolgd door 65 graden Celsius gedurende 30 minuten zonder het deksel te verwarmen.
Voeg onmiddellijk na de incubatie 30 microliter van de ligatiemastermix toe, één microliter van de ligatie-versterker en vier microliter van de unieke sequencing-adapter in de buis. Incubeer de reactie in de thermische cycler bij 20 graden Celsius gedurende 15 minuten zonder het deksel te verwarmen. Vortex om de magnetische korrels te resuspenderen en laat de korrels minimaal 30 minuten op kamertemperatuur staan.
Voeg vervolgens 87 microliter van de resuspendeerde magnetische korrels toe aan de ligatiereactie. Meng goed door op en neer te pipetten en incubeer vervolgens het monster gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Na het wassen en luchtdrogen van de korrels, eluteer het DNA-doelwit van de korrels door 20 microliter van 10 millimolair Tris-HCL toe te voegen.
Voeg 20 microliter adapter-geligateerd DNA-fragmenten toe, vijf microliter indexprimer i7, 25 microliter bibliotheekversterkingsmastermix en tweemaal gedestilleerd water tot een totaal volume van 50 microliter. PCR versterk de adapter-geligateerd cfDNA of gDNA. Voeg vervolgens 45 microliter gesuspendeerde magnetische korrels toe aan het PCR-verrijkte DNA.
Meng het monster door op en neer te pipetten en incubeer het gedurende vijf minuten. Na het verwijderen van het supernatant en het wassen van de korrels, gebruik 30 microliter van 10 millimolair Tris-HCL om de DNA-fragmenten met adapters te eluteren. Om gerichte DNA-vangst uit te voeren, blokkeer in een steriele buis het monster door 1,5 microgram poolbibliotheken toe te voegen, acht microliter P5-blok 100P en P7-blok 100P en vijf microliter van een microgram per microliter cock een DNA.
Laat de inhoud van de buis drogen met behulp van een vacuümconcentrator ingesteld op 60 graden Celsius. Hybridiseer de DNA-vangstprobes met de bibliotheek door 8,5 microliter van 2X hybridisatiebuffer toe te voegen, 2,7 microliter van hybridisatie-versterker en 1,8 microliter van nuclease-vrij tweemaal gedestilleerd water. Meng door op en neer te pipetten en incubeer in de thermische mixer bij 95 graden Celsius gedurende 10 minuten.
Voeg vervolgens on
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een techniek voor het detecteren van laagfrequente mutaties in circulerend tumor-DNA (ctDNA), bekend als ER-Seq. Deze methode kenmerkt zich door een unieke tweerichtingsfoutcorrectie en een hoge sensitiviteit en specificiteit voor precieze mutatiedetectie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Oncologie
- Genomica
- Klinische diagnostiek
Achtergrond
- Circulerend tumor-DNA (ctDNA) is een waardevolle biomarker voor de diagnose en monitoring van kanker.
- Het detecteren van mutaties met een lage frequentie kan inzicht geven in de tumordynamiek.
- Huidige methoden missen mogelijk de sensitiviteit die nodig is voor een nauwkeurige detectie.
- ER-Seq is erop gericht deze beperkingen aan te pakken met geavanceerde technieken voor foutcorrectie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het detecteren van laagfrequente mutaties in ctDNA.
- Het voorzien van clinici van een instrument voor het diagnosticeren van tumoren en het monitoren van de behandelrespons.
- Het verbeteren van het begrip van de mutatietypen die bij patiënten voorkomen.
Gebruikte methoden
- Bloedmonsters worden afgenomen en gemengd in opvangbuizen.
- Monsters worden bewaard bij gecontroleerde temperaturen gedurende maximaal 72 uur.
- Tijdens de analyse wordt tweerichtingsfoutcorrectie toegepast.
- Er wordt gebruikgemaakt van een speciaal achtergrondfilter om de detectienauwkeurigheid te verbeteren.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een hoge sensitiviteit en specificiteit bereikt bij het detecteren van mutaties.
- De methode identificeerde succesvol diverse mutatietypes, waaronder enkelvoudige nucleotidevariaties en structurele variaties.
- ER-Seq demonstreerde zijn potentieel als een betrouwbaar instrument voor klinisch gebruik.
- De procedures werden effectief gedemonstreerd door een laboratoriumtechnicus.
Conclusies
- ER-Seq vertegenwoordigt een significante vooruitgang in de detectie van ctDNA-mutaties.
- De techniek kan bijdragen aan de klinische besluitvorming voor kankerbehandelingen.
- Verdere validatie en toepassing in klinische settings zijn gerechtvaardigd.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De detectie van zeldzame mutaties in circulerend tumor-DNA (ctDNA) is cruciaal voor de vroege diagnose van kanker, het monitoren van de respons op de behandeling en het identificeren van resistentiemechanismen. De ER-Seq-methode verhoogt de sensitiviteit en specificiteit via bidirectionele foutcorrectie en gerichte verrijking, waardoor betrouwbare detectie van laagfrequente varianten mogelijk wordt. Dit ondersteunt de preklinische en klinische besluitvorming door het voorspellend vertrouwen van vloeibare biopsie-toepassingen in de ontwikkeling van oncologische geneesmiddelen te verbeteren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar tumorheterogeniteit mogelijk door laagfrequente mutaties te detecteren die therapeutische resistentie kunnen veroorzaken.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare workflow voor ctDNA-extractie, library-preparatie en targeted capture met gebruik van 1021 kb probes die >95% van de tumoreigenschap-gerelateerde drivermutaties bestrijken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de standaardisatie van assays door echte mutaties te onderscheiden van sequencingsartefacten via sense/antisense-foutcorrectie.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare library-constructie en hybridisatiegebaseerde capture mogelijk voor een consistente kwantificering van zeldzame varianten over verschillende monsterbatches.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekte-relevante systemen door EGFR pT790M en andere laagfrequente mutaties te detecteren die door traditionele methoden over het hoofd worden gezien vanwege achtergrondruis.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via een workflow van 48 uur die compatibel is met longitudinale monitoringsstudies.
Integratie van Pipeline & Workflow
ER-Seq past binnen het ontdekkingscontinuüm door hypothesetoetsing in de vroege ontdekkingsfase mogelijk te maken, assay-gereedheid bij screening te ondersteunen en kwantitatieve gegevens over mutatiefrequenties te leveren voor translationeel onderzoek en preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door driver-mutaties in ctDNA te identificeren bij frequenties tot wel 1 op 10^7 wild-type nucleotiden.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door efficiënt herstel van cfDNA-moleculen en een verbeterde coveragediepte (23% hoger dan traditionele methoden).
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (variant allele frequency) die vergelijking tussen behandelcondities en tijdspunten mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door resistentiemutaties zoals EGFR pT790M te detecteren, wat bijdraagt aan risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare capaciteit dankzij het universele probedesign en het kosteneffectieve, gestroomlijnde protocol dat slechts 1-2 dagen voor uitvoering vereist.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door fout-positieven en fout-negatieven te verminderen via bidirectionele foutcorrectie en achtergrondfiltering.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gestandaardiseerde bead-gebaseerde zuivering, adapterligatie en PCR-verrijkingstappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van resistentiemutaties mogelijk te maken, waardoor biologische risico's in een laat stadium in oncologie-pipelines worden verminderd.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door nauwkeurige kwantificering van ctDNA-dynamiek, wat bijdraagt aan patiëntenstratificatie en het ontwerp van klinische studies.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in nucleïnezurextractie, library-preparatie en hybridisatie-gebaseerde capture.
- Is afhankelijk van toegang tot sonicatie-apparatuur, thermocyclers, magnetische rekken en vacuümconcentratoren.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor het tijdstip van bloedafname, bewaarcondities (6–37°C voor maximaal 72 uur) en protocollen voor plasma-/celscheiding.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het 1021 kb probe-panel op verschillende tumortypes of modelsystemen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om cfDNA-verlies tijdens extractie, library-preparatie en bead-wasstappen te vermijden om de sensitiviteit te behouden.
