Name: Massa isolatie en In Vitro kweek van Intramolluscan stadia van de menselijke bloed Fluke Schistosoma Mansoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Leer een protocol voor massale isolatie en in vitro kweek van Schistosoma mansoni miracidia uit muizenlevers. Deze methode ondersteunt onderzoek naar schistosomiasis en parasietbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gedeeltelijk gefinancierd door NIH grant RO1AI015503. Schistosoma-geïnfecteerde muizen werden verstrekt door de NIAID Schistosomiasis Resource Center in het biomedisch onderzoeksinstituut (Rockville, MD) door middel van NIH-NIAID Contract HHSN272201000005I voor distributie via BEI middelen.

Alle dierenverzorgers en experimentele procedures werden goedgekeurd door het dier zorginstellingen en gebruik Comité van de Universiteit van Wisconsin-Madison onder Protocol geen. V005717. Het volgende protocol betekent werken in een Biosafety Level 2 (BSL2)-faciliteit voor menselijke pathogenen, hoewel geen van de stadia van de Schistosoma afgebeeld in dit protocol besmettelijk voor mens of andere zoogdieren zijn. Volg institutioneel beleid voor de verwerking van risico groep 2 (RG2) menselijke pathogenen.
Opmerking: We gebruiken vrouwelijke Swiss-Webster muizen (6 - week oud) als gevolg van hun hogere gevoeligheid voor infectie10, waardoor grotere ei lasten oplevert. Tucker et al. beschrijven de slak en muis infectie-protocollen die worden gebruikt in dit systeem model11. De Tabel van materialen staan alle specifieke uitrusting, materialen, reagentia en dierlijke bronnen die nodig zijn voor het uitvoeren van deze experimentele protocol.
1. de verwerking van besmette levers
<ol><li>Euthanaseren muizen, 6-7 weken na infectie, door CO2 verstikking (snelheid van 10-30% van het volume van de kamer per minuut). Monitor muizen voor beëindiging van de ademhaling en hartslag. Opmerking: Doorgaans tot 20 muizen mogen worden verwerkt op een bepaald moment.</li>
	<li>Na het overbrengen van euthanized muizen een kabinet bioveiligheid, plaats van muizen op hun rug en hun ventrale oppervlak spuiten met 70% ethanol. Laat weken voor 1 min.</li>
	<li>Knijpen en optrekken van de huid van de onderbuik en dwars door de basis van de beknelde huid zich het dichtst bij de buik met een steriele chirurgische schaar. Trek de gesneden huid anteriorly (dat wil zeggen, naar het hoofd) te onthullen van de lever. Merk op dat de lever moet worden vergroot en als gevolg van een ei-geïnduceerde granulomateuze reactie (figuur 2A gevlekt).</li>
	<li>Verwijderen van de lever en plaats deze in een bekerglas van 200 mL steriele 1,2% NaCl oplossing met pen/strep.</li>
	<li>Herhaal stap 1.3 en 1.4 met resterende muizen. Opmerking: Twintig muizen worden meestal verwerkt in een één oogst.</li>
	<li>Plaats de lever in een steriele petrischaal en verwijder niet-lever vet/bindweefsel met steriel pincet.</li>
	<li>Bijgesneden/schoongemaakt levers overbrengen in een fles van de steriele 250 mL centrifuge met ~ 200 mL steriele 1,2% NaCl-oplossing met pen/strep.</li>
	<li>Krachtig schudden van de fles met de lever en met behulp van een steriele Wegwerp pipet, het verwijderen van de overtollige oppervlak schuim/zwevend puin. Langzaam uit de resterende zoutoplossing giet in een container of wastafel met 1% bleekwater (ontsmettingsmiddel).</li>
	<li>~ 200 mL verse zoutoplossing aan de levers toevoegen en herhaalt u stap 1.8 drie keer.</li>
</ol>2. lever extractie en miracidial isolatie
<ol><li>Plaats de lever in een kleine steriele roestvrij stalen blender beker en voeg ~ 2 mL van 1.2% NaCl-oplossing (figuur 2B).</li>
	<li>Dekking van de cup met folie en een petrischaal ter voorkoming van lekkages, en mix voor 1 min door afwisselend hoge en lage snelheid (20 s lage snelheid/10 s hoge snelheid; herhaling) (figuur 2C).</li>
	<li>Verdeel de blended lever schorsing in steriele 250 mL centrifuge flessen (voor 20 levers gebruik 4 flessen).</li>
	<li>Steriele zoutoplossing met antibiotica aan ~ 200 mL totale volume/fles toevoegen. Weeg-/ balans flessen vóór centrifugeren.</li>
	<li>Centrifuge de blended levers bij 290 x g gedurende 15 min bij 4 oC. zachtjes af supernatant in een container met bleekmiddel vóór de teruggooi giet.</li>
	<li>Herhaal stap 2.4-2.5 keer. Zorg ervoor dat grondig resuspendeer lever sediment vóór centrifugeren.</li>
	<li>Na het verwijderen van de laatste saline wassen (stap 2.6), 200 mL steriele vijverwater met pen/strep toevoegen aan de Ingehuld leverweefsel, schudden om resuspendeer sediment, en spoel de suspensie met een gesteriliseerde maatkolf van de 1-L dat volledig met aluminium bedekt is folie, met uitzondering van de bovenkant 3 cm van de hals (figuur 2D). Opmerking: Gebruik twee flessen (= 10 levers) per 1-L-kolf. Vijverwater simuleert de natuurlijke zoetwater omgeving nodig ter stimulering van miracidial uitbroeden van de eieren.</li>
	<li>Met behulp van steriele vijverwater, vullen opwaarts naar de kolf tot ongeveer 3 cm boven de folie die betrekking hebben op de nek. Dan, zonder vertraging (zoals miracidia binnenkort beginnen om uit te komen), verwijderen van de resterende schuim en leverweefsel drijvend aan de oppervlakte door snel pipetteren tot ~ 12 mL vijverwater met puin en teruggooi het in een aparte buis negeren. Vervangen door nieuwe steriele vijverwater.</li>
	<li>Herhaal schoonmaak stap 2.8, drie keer, controleren op aanwezigheid van miracidia in de buis van de teruggooi. Niet langer de herhaling van de reiniging van stap als miracidia in de wash-oplossing verschijnen.</li>
	<li>Na de laatste wash, Voeg langzaam ~ 12 mL warme steriele vijverwater (vooraf opgewarmd tot 30 oC) een temperatuur om verloop te maken met schone, steriele warm water bovenop. Opmerking: Dit is het beste gerealiseerd door langzaam ontladen water langs de kant van de hals van de kolf te mengen.</li>
	<li>Plaats een kleine petrischaal cover over de opening van de kolf en een helder licht schijnen over de bovenkant van de kolf boven de folie cover voor het verlichten van de hogere oppervlakte van water. Opmerking: Meestal binnen 5-10 min, zwemmen miracidia, aangetrokken door het licht, zal concentreren in groten getale binnen de eerste 2-3 cm voor vijverwater (figuur 3A).</li>
</ol>3. Miracidial oogsten en teelt
<ol><li>Wanneer miracidia hebben vergaard op het oppervlak na 10 min, met behulp van een steriele overdracht Pipetteer, ~ 8 mL vijverwater en overdracht aan een steriele 15 mL centrifugebuis verwijderen. Plaats de buis met miracidia op ijs.</li>
	<li>Voeg terug 8 mL warme steriele vijverwater langs de binnenkant van de maatkolf en wacht een ander 10 min.</li>
	<li>Met nieuwe buizen telkens, herhaal stap 3.1 en 3.2 drie keer. Na de 4th -collectie, houden de laatste buis op ijs gedurende 10 minuten zodat de miracidia te regelen. Deze set van buizen bestaat uit de eerste oogst.</li>
	<li>Centrifuge buizen met miracidia bij 290 x g gedurende 1 minuut op 4 oC in een vooraf gekoeld, gekoelde centrifuge.</li>
	<li>Onmiddellijk verwijderen van de meeste van de bovendrijvende substantie (~ 7 mL) voorzichtig niet te verstoren, de parasiet pellet (figuur 3B).</li>
	<li>Zwembad alle miracidia uit deze eerste oogst in een buis, dan spoel alle van de oorspronkelijke buisjes met ~ 1 mL steriele vijverwater en toevoegen aan de "gebundelde" buis.</li>
	<li>Toestaan van parasieten te vestigen op ijs voor ~ 5 min, en nogmaals centrifugeren van de parasieten bij 290 x g gedurende 1 minuut op 4 oC.</li>
	<li>Zorgvuldig Verwijder het supernatant en voeg dat 6-8 mL steriel Chernin evenwichtig zoutoplossing (CBSS +; zie tabel van materialen) met pen/strep.</li>
	<li>Zachtjes de miracidia en aliquot hen in een 24-well cultuur plaat (1 mL per putje), gevolgd door de buis te spoelen in 6-8 mL CBSS + en toevoeging van 1 mL voor rinse aan elk putje opschorten. Incubeer parasieten bij 26 oC onder normoxic omstandigheden. Concentraties van geïsoleerde miracidia zal variëren, maar zal meestal gemiddeld ~ 7000/mL.</li>
	<li>Als parasieten nog steeds te op de lichtbron concentreren zijn, herhaalt u stappen 3.1 tot 3.9 te blijven oogsten van eind-broedeieren miracidia maar verhogen het tijdsinterval tussen collecties aan 15-20 min. Opmerking: Deze nieuwe reeks buizen vertegenwoordigt de tweede oogst. Echter, omdat miracidial nummers meestal lage zijn, larven van alle buizen meestal zijn gebundeld in een enkele cultuur putje met 2 mL CBSS +.</li>
	<li>Op 24u na de oogst en teelt, resuspendeer zachtjes sporocysts in hun putten door pipetteren.</li>
	<li>Wacht een paar minuten om parasieten te vestigen aan de onderkant van de putten. Zodra zij hebben geregeld, verwijder voorzichtig het supernatant (~1.5 mL), dat de meeste van de ciliated epidermale platen werpen door miracidia tijdens de larvale transformatie zal bevatten. Deze "transformatie" supernatant kan worden verwijderd of opgenomen in de vervolgstudies van larvale secretoire producten.</li>
	<li>1,5 mL verse CBSS + aan elke goed en voorzichtig pipet aan resuspendeer sporocysts toevoegen. Herhaal stap 3.12 desgewenst verder wassen of omzetten in een ander medium is.</li>
</ol>

<ol><li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(13)61949-2/abstract">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+worldwide+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Wkly.+Epidemiol.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li>
<li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. <a target="_blank" href="https://www.routledge.com/Schistosoma-Biology-Pathology-and-Control/Jamieson/p/book/9781498744256">Schistosoma: biology, pathology and control</a>. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).</li>
<li>Bayne, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+parasitism+of+vector+snail+Biomphalaria+glabrata+by+the+human+blood+fluke+%28trematode%29+Schistosoma+mansoni%3A+a+2009+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).</li>
<li>Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoshino%2C+TP+%22Biomphalaria+snails+and+larval+trematodes%22">Biomphalaria snails and larval trematodes</a>. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).</li>
<li>Coustau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+gastropod+immunity+from+the+study+of+the+interaction+between+the+snail+Biomphalaria+glabrata+and+its+parasites%3A+A+review+of+research+progress+over+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade.</a> Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).</li>
<li>Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+molluscan+host+resistance+and+of+parasite+strategies+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival.</a> Parasitology. 123, S159-S167 (2001).</li>
<li>McMullen, D. B., Beaver, P. C. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19462900219">Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae).</a> Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).</li>
<li>Voge, M., Seidel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+vitro+of+miracidia+of+Schistosoma+mansoni+and+S.+japonicum+into+young+sprocysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts.</a> J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).</li>
<li>Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+mortality%2C+pathophysiology%2C+and+susceptibility+differences+in+male+and+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice.</a> Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).</li>
<li>Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Proto+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).</li>
<li>Basch, P. F., DiConza, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miracidium-sporocyst+transition+in+Schistosoma+mansoni%3A+surface+changes+in+vitro+with+ultrastructural+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation.</a> J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).</li>
<li>Hansen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+daughter+sporocysts+of+Schistosoma+mansoni%3A+their+occurrence+and+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).</li>
<li>Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosome+sporocyst-killing+amoebae+Isolated+from+Biomphalaria+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata.</a> J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).</li>
<li>DiConza, J. J., Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li>
<li>Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHansen%2C+EL+%22Invertebrate+tissue+culture%3A+Research+applications%22">Invertebrate tissue culture: Research applications</a>. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).</li>
<li>Yoshino, T. P., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).</li>
<li>Ivanchenko, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+in+vitro+propagation+and+differentiation+of+cultures+of+the+intramolluscan+stages+of+the+human+parasite+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).</li>
<li>Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscan+cells+in+culture%3A+primary+cell+cultures+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines.</a> Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).</li>
<li>Coustau, C., Yoshino, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flukes+without+snails%3A+Advances+in+the+in+vitro+cultivation+of+intramolluscan+stages+of+trematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes.</a> Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).</li>
<li>Milligan, J. N., Jolly, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191(2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Miracidia van S. mansoni, geïsoleerd en gemanipuleerd zoals hierin beschreven kunnen infecteren alleen de slak tussengelegen host, en dus niet vertegenwoordigen een menselijke biohazard tijdens deze fase van larvale ontwikkeling. Echter, accidentele blootstelling/om infectie te voorkomen van slakken, moet worden gewaakt voor het uitvoeren van miracidial isolatie op een andere locatie van gebieden waar ziektegevoelige Biology slak aanwezig of onderhouden kan worden. Een logeerkamer, geregistreerd als BSL...

Het menselijk bloed staartvinnen Schistosoma spp., zijn de causatieve agenten van schistosomiasis, een verwaarloosde tropische ziekten teistert een geschatte 230 miljoen mensen wereldwijd1. De meest voorkomende soort, Schistosoma mansoni, is geografisch verdeeld in Zuid-Amerika, de Caribische archipel, het Midden-Oosten en sub-Saharisch Afrika2. De levenscyclus van S. mansonien andere schistosomes, is complex, waarbij een zoogdieren definitieve host en zoetwater slakken van het geslacht Biology die als obligate intermediaire gastheer dienen.
S. mansoni mannelijke en vrouwelijke volwassen worm paren leven in de achterste mesenterische aders van de zoogdieren host reproduceren, resulterend in de release van bebroede eieren (ova) die worden ingediend in de kleine venules van de intestinale mucosa. Eieren vervolgens breekt door de muren van het vaartuig, migreren door mucosal weefsels, en uiteindelijk Voer de intestinale lumen waar zij met de uitwerpselen zijn ongeldig. Wanneer eicellen zoetwater en vrijzwemmende larven (miracidia) broedsel invoert, moeten in korte orde, vinden ze een geschikte Biology slak te infecteren om voort te zetten van de levenscyclus. Deze infectie-proces omvat miracidial gehechtheid aan de slakkengang buiten lichaamsoppervlak gevolgd door actieve penetratie en vermelding van de larve in de gastheer. Kort na binnenkomst begint het miracidium te werpen haar ciliated epidermale Buitenlamellen zoals het vormt een syncytium die als de nieuwe buitenoppervlak (vlies) van de volgende larvale stadium, de primaire of moeder sporocyst fungeren zal. Door middel van ongeslachtelijke voortplanting, elke primaire sporocyst produceert en een tweede generatie van sporocysts, het zogenaamde secundaire of dochter sporocysts, die op zijn beurt, genereren en vrijgeven van grote aantallen van de laatste fase van de intramolluscan, de cercaria3 releases . Bij ontsnappen uit de slak host zijn vrijzwemmende cercariae geschikt voor het aansluiten en direct het penetreren van de huid van een mens of andere geschikte zoogdieren gastheer. Bij binnenkomst in hun nieuwe host, cercariae transformeren naar de parasitaire schistosomula fase en het vasculaire systeem binnen te dringen. Zij, beurtelings, migreren naar de longen en vervolgens naar de hepatische ader waar ze rijpen tot volwassen wormen, mannelijke en vrouwelijke paren vormen en reizen naar de mesenterische aderen te voltooien hun levenscyclus.
Geslaagd intramolluscan of "slak fase" ontwikkeling van larvale schistosomes is essentieel voor de voortzetting van de cyclus van menselijke host-naar-host-transmissie. Is de periode van de volgende vermelding van de vrijzwemmende miracidium in de slak host en haar vroege transformatie tot het stadium van de primaire sporocyst van cruciaal belang. Afhankelijk van de fysiologische en immunologische compatibiliteit tussen host en parasiet is het in deze fase van larvale ontwikkeling dat eerste succes of falen om infecties is vastbesloten4,5,6 . Verdere ontwikkeling van de primaire sporocysts geschikt voor het produceren aardlingen secundaire sporocysts, die vervolgens mens-infectieuze cercariae genereren, verder vereisen een tolerante fysiologische hostomgeving dat voorziet in alle van de parasiet groei en reproductieve moet.
Tot op heden, is weinig bekend over de onderliggende fysiologische, biochemische en moleculaire processen controleren Schistosoma-slak interacties, met name de moleculen en de trajecten betrokken bij larvale ontwikkeling en voortplanting reguleren of modulerende de immuunrespons van de gastheer. Eenvoudige toegang tot grote aantallen van deze larvale stadia omstandigheden in vitro cultuur waarmee experimentele manipulatie zou aanzienlijk vergemakkelijken de ontdekking van ontwikkelings trajecten en onderliggende mechanismen van celgroei, differentiatie en reproductie. Kritische parasiet trajecten of mechanismen, vastgesteld door middel van in vitro experimenten, kunnen vervolgens worden gebruikt larvale groei/reproductie in de slak host verstoren, of identificeren van slak host immuun mechanismen die betrokken zijn bij de erkenning en de eliminatie van de stadia van miracidial of sporocyst.
In dit artikel en een video presentatie, wij bieden een gedetailleerde beschrijving van een methode voor het isoleren van grote aantallen vrijzwemmende S. mansoni miracidia voor in vitro cultuur die vervolgens kan worden onderworpen aan follow-up experimentele binnenbrengen manipulatie (Zie Figuur 1 voor een schematisch overzicht van de werkstroom protocol). Hoewel soortgelijke procedures zijn beschreven eerder7,8,9, vonden we dat een gedetailleerd protocol nuttig voor onderzoekers die tewerkstellen van dit model aan te pakken nog steeds onbeantwoorde vragen met betrekking zijn zou willen tot intramolluscan larval ontwikkeling, cellulaire proliferatie en Schistosoma-slak immuun-interacties. Bovendien, zou kunnen deze aanpak gemakkelijk worden aangepast voor isolatie van eieren uit andere medisch belangrijke darm zoals blaas-woning S. haematobium, staartvinnen lever of Long staartvinnen.

<table><tbody><tr><td>Chernin's balanced salt solution (CBSS+)</td><td></td><td></td><td>Voor 1L oplossing</td></tr><tr><td>2,8 g natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Los zouten op, behalve calciumchloride en&nbsp;</td></tr><tr><td>0,15 g kaliumchloride&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>suikers in 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0,07 g natriumfosfaat, dibasisch watervrij</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Los calciumchloride apart op in 200&nbsp;</td></tr><tr><td>0,45 g magnesiumsulfaat heptahydraat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0,53 g calciumchloride dihydraat&nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Voeg langzaam calciumsoort toe aan de zouten/suikeroplossing met&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 g natriumbicarbonaat&nbsp;&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>met constant mengen</td></tr><tr><td>1 g glucose</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Pas aan op pH 7,2 en filter steriliseer met een&nbsp;</td></tr><tr><td>1 g trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0,22 &micro;m wegwerpflesapfilter</td></tr><tr><td>10 mL 100X penicilline/streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Voeg gefilterde penicilline en streptomycine oplossing toe&nbsp; voor gebruik</td></tr><tr><td>Incompleet Bge&nbsp; medium (Ibge)</td><td></td><td></td><td>Voor 900 mL oplossing</td></tr><tr><td>220 mL Schneider&rsquo;s Drosophila medium gemodificeerd</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Meng Schneider's medium met 680 mL ddH2O</td></tr><tr><td>4,5 g lactoalbumine enzymatisch hydrolysaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Voeg lactoalbumine hydrolysaat en galactose toe</td></tr><tr><td>1,3 g galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>Pas aan op pH 7,2 en filter steriliseer met een 0,22 &micro;m voorgesteriliseerde wegwerpflesapfilter</td></tr><tr><td>Compleet Bge medium (cBge)</td><td></td><td></td><td>Voor 100 mL oplossing</td></tr><tr><td>90 mL Incompleet Bge medium</td><td></td><td></td><td>Om FBS thermisch te inactiveren: Incubeer ontdooid FBS in&nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL thermisch inact. foetaal bovien serum (FBS) (Optima)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>waterbad op 60&deg;C gedurende 1 uur terwijl u zachtjes&nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 100X penicilline/streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>de fles elke 10 min draait Verdeel thermisch inactief FBS in 15-mL buisjes&nbsp; en bewaar op -20&deg;C.&nbsp; Meng medium + FBS en filter steriliseer met een 0,22 &micro;m voorgesteriliseerde&nbsp; wegwerpflesapfilter&nbsp; Voeg penicilline en streptomycine toe voor gebruik</td></tr><tr><td>Pond water (stamotoplossing)</td><td></td><td></td><td>1L stamotoplossing</td></tr><tr><td>12,5 g calciumcarbonaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Meng alle zouten in 1L ddH2O</td></tr><tr><td>1,25 g magnesiumcarbonaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Merk op dat de zouten niet volledig&nbsp;</td></tr><tr><td>1,25 g&nbsp; natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>opgelost zullen zijn.&nbsp; Schud krachtig om&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>0,25 g&nbsp; kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>zouten op te schorsen voor het maken van de werkoplossing&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Pond water (werkoplossing)</td><td></td><td></td><td>1,5L oplossing</td></tr><tr><td>0,8 mL stamotoplossing pond water (schudden voor gebruik) in&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Meng stock tot ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL ddH2O</td><td></td><td></td><td>Steriseer pond water door autoclaving (langzame&nbsp;cyclus)</td></tr><tr><td>1,5 mL van 100X penicilline/streptomycine&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Voeg penicilline en streptomycine toe voor gebruik</td></tr><tr><td>Zoutoplossing (1,2% NaCl)</td><td></td><td></td><td>1,5L oplossing</td></tr><tr><td>18 g natriumchloride in 1500 mL ddH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Autoclave zout oplossing om te steriliseren</td></tr><tr><td>1,5 mL van 100X penicilline/ streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Voeg penicilline en streptomycine toe voor gebruik</td></tr><tr><td>Aanvullende apparatuur en materiaal:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L muis euthanasiekamer</td><td></td><td></td><td>Volgens goedgekeurd IACUC-protocol nr. V001551</td></tr><tr><td>Muizen</td><td>Taconic Biosciences</td><td></td><td>Zwitsers-Webster, vrouwelijk, 6 weken oud, muispathogeen-vrij</td></tr><tr><td>CO2 tank en regelaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-wells weefselkweekplaat</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>1-L volumetrische kolven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtbron (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Model F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, gekoeld, zwenkbeker</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeflessen (250 mL)</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL centrifugeerbuisjes, steriel</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Steriele wegwerptransferpijpjes&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro;m voorgesteriliseerde wegwerpflesapfilter&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen blender</td><td>Waring Commercial</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Blenderbeker, 100 mL capaciteit

massa isolatie en in vitro kweek van intramolluscan stadia van de menselijke bloed fluke schistosoma mansoni

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Menselijk bloed staartvinnen, Schistosoma spp., hebben een complexe levenscyclus met ongeslachtelijke en seksuele ontwikkeling fasen binnen een slak intermediaire en zoogdieren definitieve gastheer, respectievelijk. De mogelijkheid om te isoleren en in stand houden van de fasen van de levenscyclus van de verschillende omstandigheden in vitro cultuur heeft sterk vergemakkelijkt onderzoek naar de cellulaire, biochemische en moleculaire mechanismen tot regeling van de parasiet groei, ontwikkeling en gastheer interacties. Transmissie van schistosomiasis vereist ongeslachtelijke voortplanting en ontwikkeling van meerdere larvale stadia binnen de slak host; vanuit de infectieuze miracidium, door middel van primaire en secundaire sporocysts, naar de eindfase van de cercarial is dat besmettelijk voor de mens. In deze paper presenteren we een stapsgewijze protocol voor massale broedeieren en isolatie van Schistosoma mansoni miracidia van eieren die zijn verkregen uit de lever van geïnfecteerde muizen en hun latere invoering in in vitro cultuur. Verwacht wordt dat het gedetailleerde protocol nieuwe onderzoekers deelnemen en verbreden van dit belangrijke terrein van Schistosoma onderzoek zal bevorderen.

De overgrote meerderheid van miracidia zal meestal zijn verzameld in de eerste twee "oogsten". Incubatie van geïsoleerde miracidia in CBSS + Triggert het miracidium-aan-sporocyst transformatieproces (Figuur 4A- C). Binnen het eerste uur wells volgende overdracht aan cultuur met CBSS +, de meerderheid van de miracidia staken zwemmen (figuur 4A). Om 6 uur in cultuur momenteel miracidia actief vergieten hun ciliated...

Dit artikel beschrijft een protocol voor de grootschalige een isolatie en verzameling van vrijzwemmende miracidia van de menselijk bloed fluke Schistosoma mansoni en hun verdere verwerking voor in vitro cultuur binnenbrengen.

Massa isolatie en In Vitro kweek van Intramolluscan stadia van de menselijke bloed Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

In deze video beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het op grote schaal uitkomen en isoleren van vrij zwemmende Schistosoma mansoni miracidia en de daaropvolgende introductie in in vitro-kweek. Schistosoma mansoni is een van de vier belangrijkste soorten bloedsuikers die meer dan tweehonderd miljoen mensen wereldwijd infecteren en de verwaarloosde tropische ziekte veroorzaken die bekend staat als Schistosomiasis. De schistosome-levenscyclus is complex en omvat slakken als tussenliggende gastheren en zoogdieren, inclusief mensen, als definitieve gastheren.In vitro-kweek van larvale en volwassen schistosomen vertegenwoordigt een onschatbare tool voor het bevorderen van onderzoek naar de bestrijding en uitroeiing van deze parasitaire ziekte. In deze video, met behulp van een muismodel om S.mansoni eieren te produceren die het door slakken geïnfecteerde miracidiumstadium bevatten, illustreren we een stapsgewijze procedure voor de massale isolatie van miracidia uitgekomen uit eieren die zijn teruggewonnen uit leveren en hun in vitro-kweek. Nathalie Dinguirard en Codie Heinemann assisteren mij bij deze demonstratie.Hieronder volgt een workflow-diagram dat de drie belangrijkste s

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Cercarial Transformatie en In vitro Teelt van Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma mansoni eieren zijn krachtige stimulatoren van de T-helper type 2 (Th2) immuunrespons, kenmerk van parasitaire infecties, astma en allergische ontsteking. Dit protocol maakt gebruik van S. mansoni ei injectie om een CD4 Th2 cytokine-geïnduceerde ontstekingsreactie in de long, gekenmerkt door long granuloomvorming rond het ei, eosinofilie en macrofaag alternatieve activatie te genereren.

Het gebruik van eieren van<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als een<em&gt; In vivo</em&gt; Model van Helminth veroorzaakte longontsteking

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Heligmosomoides polygyrus is een muizen nematode met krachtige immunomodulerende mogelijkheden die sterk lijken op die van zeer voorkomende menselijke worminfecties. Hier beschrijven we een protocol voor het onderhoud van de H. langdurige polygyrus levenscyclus.

Teelt van<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Een Immunomodulatory Nematode Parasite en haar uitgescheiden producten

We beschrijven hier de laatste ontwikkelingen in virale isolatie voor de karakterisering van nieuwe genotypen van Faustovirus, een nieuw asfarvirus-gerelateerd lijn van gigantische virussen. Dit protocol kan worden toegepast op de isolatie van virussen met hoge doorvoer, met name gigantische virussen die amoeben infecteren.

Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

We beschrijven een muismodel van experimentele cerebrale malaria en laten zien hoe inflammatoire en microvasculaire pathologie in vivo kunnen worden gevolgd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming.

In vivo Tracking van Oedema Ontwikkeling En Microvasculaire Patologie In Een Model Van Experimentele Cerebrale Malaria Met Magnetic Resonance Imaging

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van extracellulaire blaasjes (EVs) isolatie in in vitro gekweekte medium uit volwassen Schistosoma japonicum.

Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.

Nucleofection en in Vivo propagatie van kippeneimeria parasieten

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

We beschrijven een snelle transiënte transductietechniek in verschillende ontwikkelingsstadia van Echinococcus granulosus met behulp van lentivirale vectoren van de derde generatie.

Voorbijgaande transductie van de gestrobileerde vormen van Echinococcus granulosus

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Leer een protocol voor massale isolatie en in vitro kweek van Schistosoma mansoni miracidia uit muizenlevers. Deze methode ondersteunt onderzoek naar schistosomiasis en parasietbiologie.

Massa isolatie en In Vitro kweek van Intramolluscan stadia van de menselijke bloed Fluke Schistosoma Mansoni

Meer video's verkennen