Name: Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor dissectie van de hypofyse en preparatie van coronale secties bij ontwikkelende muizen. Dit protocol behoudt de weefselarchitectuur voor histologische analyse van celdifferentiatie en apoptose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de subsidies van nationale Natural Science Foundation van China (31201086, 31470759 en 31671219) en Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).

C57BL/6 muizen worden gefokt in omstandigheden van specifieke pathogenen vrije. Alle dierlijke experimentele methoden zijn in overeenstemming met de richtsnoeren die zijn goedgekeurd door de Animal Care en de ethische Commissie op tweede militaire Medizinische Universität.
 1. dissectie van postnatale ontwikkeling hypofyse <ol><li>uitvoeren anesthesie: neonatale muizen (P0 - P5) plaats op crushed ijs voor het opwekken van hypothermie. Voor muizen die ouder zijn dan 5 dagen oud, injecteren 5% urethaan (30 µL/g lichaamsgewicht) intraperitoneally om te induceren van anesthesie. Reacties op staart/teen snuifjes beoordelen. Gaan pas na de muis niet reageert op de schadelijke stimuli.</li>
	<li>Beveiligen van de muis in de liggende positie (liggend op de rug met het gezicht naar boven) door het voorzichtig taping van de forepaws en hindpaws aan de werkoppervlakte van een dat kan worden gespeld (d.w.z., piepschuim) binnen een chemische zuurkast.</li>
	<li>Uitvoeren transcardial perfusie.
	<ol><li>De muis ribbenkast snijd met een chirurgische schaar bloot het hart (en andere thoracale organen).</li>
		<li>Beveiligen het kloppend hart met een botte Tang en invoegen van een naald 26G (0,45 mm) in het linkerventrikel. De naald is verbonden met een 10 mL spuit gevuld met EDTA fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; aangevuld met 5 mg/mL natriumnitriet en 10 U/mL heparine, pH 7.4, warm tot 37 ° C vóór gebruik). Onmiddellijk de juiste atrium snijd met een fijn schaar en beginnen te perfuse van het lichaam met de warme PBS, totdat de vloeistof de juiste atrium verlaten duidelijk. 
		Opmerking: Bij benadering 5-10 mL PBS is nodig voor de neonatale muizen en 10-20 mL PBS voor volwassen muizen.</li>
		<li>De naald op zijn plaats houden en omzetten in een ander spuit gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7.4). Perfuse 10 mL en 20 mL fixeer voor Neonatale en P21 muis, respectievelijk. 
		Let op: PFA is giftig. Huid en respiratoire irritaties en oog schade kan veroorzaken. Draag handschoenen en werken onder een chemische motorkap.</li>
	</ol></li> <li>De PFA-vaste muis decapitate en opengesneden met een schaar van het bot van de schedel.
	<ol><li>Til voorzichtig het hindbrain van de basis van de schedel met een kleine Tang. Bij het eerste teken van de sella turcica cut stop tillen maar houd de hindbrain, de hypofyse stengel en zenuwvezels die aansluiten op de basis van de hersenen met een fijne schaar. Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de hypofyse is niet weg met de hersenen opgeheven.</li>
		<li>Dan de hersenen houden opheffen en verwijderen van de hele hersenen om de hypofyse volledig bloot te stellen. Snijd de hele sella regio met inbegrip van de hypofyse, laterale trigeminal zenuwen, en de onder wiggenbeen met een schaar (ongeveer 3 x 5 mm 2).</li>
	</ol></li> <li>De ontleed weefsel gestoken met een 35 mm-schotel of een putje van een 6-well plaat met 2 mL koude 4% PFA (pH 7.4). Fix het weefsel bij 4 ° C voor 40 min voor P0 - P7 pituitaries, 1 h voor P14 pituitaries, 1,5 h voor P21 - P28 pituitaries en 3 h voor volwassen pituitaries.</li>
	<li>Verdere dissociatie van hypofyse <ol><li>wassen het vaste weefsel met 10 mL PBS, 5 wijzigingen, elke 15 min. De neonatale hypofyse samen met zijn omliggende weefsels en onder wiggenbeen rechtstreeks aan uitdroging kan worden verwerkt. Echter de slijmachtige klieren van muizen die ouder zijn dan 5 dagen moet worden losgekoppeld verder onder een stereomicroscoop.</li>
		<li>Zet het vaste weefsel in een 35 mm-schotel met 1 mL PBS. Voor P5 - P14 pituitaries, verwijdert u de bindweefsel membranen tussen de zenuwen en het bot met fijne Tang en schaar en zorgvuldig het isoleren van de hypofyse samen met laterale trigeminal zenuwen als geheel maar verlaten de sella turcica. De geïsoleerde klier en de zenuwen zijn verbonden door bindweefsel membranen met een &#34; H &#34;-graag uiterlijk ( figuur 1B).</li>
		<li>Voor P21 en volwassen pituitaries, verwijderen van de zenuwen en het bindweefsel van de vliezen rond de hypofyse en gratis de klier uit de omliggende weefsels. Wikkel de hypofyse weefsel met lens reiniging papieren zakdoekje en zet het in een insluiten cassette. 
		Opmerking: De kleine hypofyse inwikkeling met lens reiniging papieren zakdoekje helpt ter voorkoming van potentiële schade van specimens en behoud van weefsel integriteit in de volgende procedure voor het insluiten van paraffine. Het kan niet nodig te laten teruglopen van de hypofyse als het is verwerkt in een klein flesje in de procedure cryo-insluiting.</li>
	</ol></li></ol> 2. Paraffine insluiten en Sectioning <ol><li>de specimens in cassettes met 50%, 65%, 75% en 95% ethanol oplossingen voor elke 15 min te embedding uitdrogen. Vervolgens uitdrogen met 3 wijzigingen van zuiver ethanol, 3 min voor P0 - P4 klieren, elke 4 min voor P5 - P14 klieren, en elke 5 min voor P21 en oudere klieren. Duidelijk met xyleen, 3 verandert, 3 min voor P0 - P4 klieren, elke 4 min voor P5 - P14 klieren, en elke 5 min voor P21 en oudere klieren. Infiltreren met gesmolten paraffine, 3 veranderingen, elke 7 min voor P0 - P4 klieren, en 8 min tweemaal gevolgd door 6 min eenmaal voor P5 en oudere klieren. 
	Opmerking: De optimale parameters voor verwerking van het weefsel kunnen worden empirisch aangepast. Voor het verkrijgen van hoge kwaliteit secties, moet onvoldoende of over uitdroging worden vermeden. Hetzelfde geldt voor het ontruimen van het weefsel met behulp van xyleen.</li>
	<li>Oriëntatie bij het insluiten van <ol><li>op een weefsel insluiten console systeem, verwijderen van het model van de cassette en plaats deze in een basis mal half gevuld met gesmolten paraffine. Juiste stand van de insluiten hypofyse is essentieel voor het voldoen aan van coronale secties.</li>
		<li>Voor P21 en volwassene slijmachtige klieren, plaatst u de hypofyse met de korte as loodrecht op het oppervlak van de bodem van een base mal (het sectievlak). Gebruik wiggenbeen beenderen en trigeminus zenuwen als anatomische bezienswaardigheden voor P0 - P4 en P5 - P14 pituitaries, respectievelijk. Exemplaren met hun trigeminal zenuwen of transversale lamina van wiggenbeen botten loodrecht op het oppervlak van de bodem van een base mal oriënteren.</li>
		<li>Houd zachtjes het weefsel in de gewenste positie met verwarmde fijne pincet totdat de wax semi-solide op de plaat in een koeling wordt. De matrijs met gesmolten paraffine herladen. Toestaan van het blok van de paraffine afkoelen totdat de wax is volledig verhard. 
		Opmerking: De hypofyse ten embryonale dage 18,5 (E18.5) kan worden behandeld op dezelfde wijze als de neonatale hypofyse. Maar de pituitaries (Rathke &#39; s zakjes) jonger dan E16.5 moet worden ingesloten met de gehele kop en met de Sagittaal as (van mond naar achterhoofd) loodrecht op de onderkant van een base mal gericht.</li>
	</ol></li> <li>Chill de paraffine blok bij-20 ° C gedurende 10-20 minuten en dan snijd het in dunne plakjes (4 µm dikte heeft de voorkeur) met een microtoom. Als u op bevredigende coronale secties, fine-tunen van de positie van de paraffineblokken tijdens segmenteren. Mount de plakjes weefsel in polylysine-gecoat glas dia's om te voorkomen dat detachement van segmenten in de volgende procedures. 
	Opmerking: Als alternatief, exemplaren kunnen worden gedehydrateerde in 15%, 30% (G/V) oplossingen van de sucrose (in PBS) bij 4 ° C totdat ze naar de bodem zinken, ingesloten in cryo-insluiting samengestelde gebruikend de zelfde methode van oriëntatie en snel bevroren op droog ijs. Vervolgens snijd het bevroren weefsel blokken in reepjes van 8-10 µm met behulp van een cryostaat. De morfologie van cryo-secties, is echter vaak inferieur aan secties paraffine.</li>
</ol> 3. H &#38; E kleuring en labelen van immunofluorescentie <ol><li>Warm de dia's op een hitte blokkeren bij 55 ° C en dewax met xyleen, 2 wijzigingen, 4 min elke. Uitdrogen van de monsters met tweemaal de ethanol van 95% en 75% ethanol tweemaal, 3 minuten elk. Wassen van de dia's met gedestilleerd water gedurende 5 minuten in een roteerapparaat.</li>
	<li>Voor H &#38; E vlekken, vlek de secties in aluin Haematoxyline oplossing voor 6 min, spoel in runnhet water van de kraan van de ING gedurende 2 minuten, onderscheiden met 0,2% ammoniak water voor 45 s, en het opnieuw spoelen in stromend water gedurende 2 minuten. Vervolgens het uitdrogen van de secties met 95% ethanol voor 1 min en vlek met eosine 2 min. sequentieel uitdrogen, duidelijk, en mount.</li>
	De secties behandelen <li>immunofluorescentie labeling <ol><li>met methanol met 3% H 2 O 2 en 0,01% NaN 3 gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te inactivering van endogene Peroxidasen. Ophalen van antigenen door koken secties in de ophalen buffer (1 mM EDTA en 1 mM Tris-HCl, pH 7.4) in een snelkookpan voor 2 min. Incubate de secties met een blokkeerbuffer (5% geit serum in PBS) gedurende 30 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Broeden secties met konijn anti-groeihormoon (GH) antilichaam (1:2, 000) of konijn anti-gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) antilichaam (1:2, 000) verdund in blokkeerbuffer 's nachts bij 4 ° C.</li>
		<li>Secties met secundair antilichaam (geit anti-konijn IgG-HRP, 1:300 in de blokkeerbuffer) Incubeer gedurende 35 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Versterken de signalen met behulp van Biotinyl Tyramide (1:50 in Tris gebufferde zoutoplossing met 0,3% H 2 O 2) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en visualiseren met streptavidine-Alexa594 of 488 (1:300 in het blokkeren van de buffer, 30 min, 37 ° C).</li>
		<li>Counterstain de kernen met de DAPI (50 mg/L in PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. 
		Opmerking: Het kan niet noodzakelijk zijn om het signaal dat met behulp van Tyramide signaal versterking (TSA) systeem versterken. Als alternatief, een fluorescentie-geconjugeerde secundair antilichaam kan worden gebruikt voor het visualiseren van het signaal.</li>
	</ol></li> <li>Ophaal beelden met behulp van een fluorescentie Microscoop uitgerust met DAPI, Texas Red en FITC filter sets, × 4/0.13 te × 40/0,75 doelstellingen en een 5.0 megapixelcamera. Gebruik de 360, 488 594 nm laser golflengten voor imaging DAPI Alexa 488- en Alexa 594 gebeitste secties, respectievelijk en. Optimaliseren van de kracht van de laser (0.8 werd gebruikt in het algemeen) en belichtingstijd op de gewenste niveaus voor elk kanaal. De opname onder de controle van afbeelding acquisitie software en overlay van de afbeeldingen van de fluorescentie vervolgens met behulp van beeld processing software.</li>
</ol>

<ol><li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+face+of+the+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li>
<li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+pituitary+development%3A+signaling+and+transcriptional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li>
<li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li>
<li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li>
<li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li>
<li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size%2C+shape%2C+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li>
<li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li>
<li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion%3A+proliferation%2C+progenitors%2C+and+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li>
<li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li>
<li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+%28lit%29+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor het ontwikkelen van lymfkliertest pituitaries, is het technisch moeilijk te verkrijgen van de juiste coronale secties als gevolg van hun klein en kwetsbaar functies en unieke anatomische kenmerken6,8. Sommige onderzoeksgroepen koos dus mid-Sagittaal secties voor het analyseren van de morfologie van embryonale en neonatale hypofyse11,12. Hoewel de mid-Sagittaal sectie van hypofyse is ook geschikt voor...

De hypofyse of hypophysis is een belangrijk endocriene orgaan afscheidende hormonen essentieel voor homeostase1,2. De hypofyse is anatomisch, een '' two-in-one'' structuur bestaande uit de neurohypophysis en de adenohypophysis. Die onderdelen moeten verschillende embryonale oorsprong en functie zeer verschillend. De neurohypophysis is afgeleid van de neurale ectoderm en scheidt van oxytocine en veel hormoon. De adenohypophysis is afkomstig uit de zak van Rathke en is verantwoordelijk voor het vrijkomen van hormonen waaronder groei-hormoon prolactine, schildklier - stimulerend hormoon, follikelstimulerend hormoon, luteïniserend hormoon, adrenocorticotropic hormoon, en Melanocyt - stimulerend hormoon3,4,5.
De hypofyse berust op het dorsale oppervlak van het wiggenbeen (sella turcica) van de schedel van de muis en aan de verdieping van de hersenen is gekoppeld door een fragiele stengel. Lateraal is omgeven door trigeminal zenuwen en anteriorly de optic opticum6,7. De klier heeft een langwerpige ovale vorm met haar lange as loodrecht staat op die van het hoofd. Op het dorsale oppervlak, kunnen de neurohypophysis en de adenohypophysis gemakkelijk worden afgebakend, met de voormalige bezetten de dorsale mediale regio en de laatste uitbreiding lateraal en ventrally. Tijdens de postnatale ontwikkeling, neemt de grootte van hypofyse toe snel in de eerste maand na de geboorte8,9. De hypofyse muis is echter nog steeds zeer klein in grootte met een gemiddeld gewicht van 1.9 mg en een lange-as diameter van ~ 3 mm in volwassen10, een lange-as diameter van 2-2,5 mm op postnatale dag 21 (P21), en slechts 1-1,5 mm bij P0.
Een coronale sectie heeft de voorkeur om zowel adenohypophysis als neurohypophysis in een enkel sneetje van de hypofyse muis weer te geven. Echter, sommige technische vaardigheden worden vereist om te verkrijgen die voldoen aan de coronale secties van de slijmachtige klieren van het ontwikkelen van muizen vanwege zijn uitzonderlijk kleine formaat en verschillende anatomie. In dit artikel video laten we zien hoe ontleden muis slijmachtige klieren en hypofyse coronale secties voor te bereiden op de verschillende ontwikkelingsstadia.

<table><tbody><tr><td>Gereedschap/Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar-recht</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Fijne schaar-recht</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Blunt pincet</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Fijne pincet</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>voor isolatie van de hypofyse</td></tr><tr><td>26G (0.45mm) naald</td><td>HongDa</td><td></td><td>voor transcardiale perfusie</td></tr><tr><td>Spuit (1 mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Spuit (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>35mm schaal</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Lensreinigingspapier</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Anatomisch microscoop</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Inbeddingscassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Weefselinbeddingsconsolesysteem</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Superfrost-Plus dia's</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>voor PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>voor PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>voor PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>voor PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparine-natriuminjectie</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>voor perfusie-zoutoplossing</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>voor H&amp;E kleuring</td></tr><tr><td>Eosine Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>voor H&amp;E kleuring</td></tr><tr><td>konijnen anti groeihormoon (GH)</td><td>National Hormone</td><td></td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>antilichaam</td><td>Hypofyseprogramma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-muis GFAP antilichaam</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Geiten anti-konijn IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>TSA-systeem</td><td>NEN Life Science Products</td><td>NEL700</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Streptavidine, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>voor immunokleuring</td></tr></tbody></table>

dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

De hypofyse of hypophysis is een belangrijk endocriene orgaan afscheidende hormonen essentieel voor homeostase. Het bestaat uit twee klieren met aparte embryonale oorsprong en functies — de neurohypophysis en de adenohypophysis. De ontwikkelende muis hypofyse is klein en delicaat met een langgerekte ovale vorm. Bij voorkeur wordt een coronale sectie weer te geven van zowel de adenohypophysis als de neurohypophysis in een enkel sneetje van de hypofyse muis.
Het doel van dit protocol is te bereiken van de juiste hypofyse coronale secties met goed bewaarde weefsel architecturen van het ontwikkelen van muizen. In dit protocol beschrijven we in detail hoe te ontleden en te verwerken van de slijmachtige klieren goed van de ontwikkeling van muizen. Eerst, muizen door transcardial perfusie van formaldehyde vóór dissectie worden opgelost. Vervolgens worden drie verschillende ontleden technieken toegepast om het verkrijgen intact slijmachtige klieren afhankelijk van de leeftijd van muizen. Voor foetale muizen van embryonale dagen (E) 17,5-18,5 en pasgeborenen jaar omhoog tot 4 dagen, worden de regio van de gehele sella's waaronder het wiggenbeen, klier en trigeminus zenuwen ontleed. Voor pups worden leeftijd postnatale dagen (P) 5-14, de slijmachtige klieren verbonden met trigeminal zenuwen ontleed als een geheel. Voor muizen meer dan 3 weken oud, worden de slijmachtige klieren zorgvuldig ontleed gratis uit de omliggende weefsels. We tonen ook hoe de slijmachtige klieren insluiten in een goede richting met behulp van de omliggende weefsels als monumenten te verkrijgen die voldoen aan de coronale secties. Deze methoden zijn handig bij het analyseren van de histologische en ontwikkelingsproblemen functies van slijmachtige klieren bij de ontwikkeling van muizen.

Dit protocol biedt een methode om te ontleden slijmachtige klieren van het ontwikkelen van muizen. Voor de neonatale muis, de hele sella regio's met de hypofyse, de trigeminus zenuwen en de onderzijde wiggenbeen werden ontleed uit vanaf de basis van de schedel. De kleine en delicate hypofyse tijdens het proces (figuur 1A) intact gebleven. Voor muizen die ouder zijn dan 5 dagen, toen de slijmachtige klieren gekoppeld aan de laterale trigeminal zenuwen waren ge...

We presenteren een protocol om te ontleden slijmachtige klieren en bereiden van hypofyse coronale secties van het ontwikkelen van muizen.

Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Het algemene doel van deze procedure is om goede coronale secties van de hypofyse te verkrijgen met goed bewaarde weefselstructuren van zich ontwikkelende muizen. Deze procedure kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hypofysontwikkeling, zoals hypofysehistologie, celdifferentiatie, proliferatie en apoptose. Het grote voordeel van deze techniek is dat zich ontwikkelende muishypofysen kunnen worden gedissecteerd zonder zichtbare schade en correct worden georiënteerd om coronale secties te bereiken.We kregen het idee voor deze methode toen we ontdekten dat het voor zich ontwikkelende muishypofysen technisch moeilijk was om goede coronale secties te verkrijgen. Na het anestheseren en fixeren van muizen volgens het tekstprotocol, gebruikt u schaar om het schedelbot open te snijden. Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig de achterhersenen vanaf de basis van de schedel op te tillen.Bij het eerste teken van de sella turcica, stop met tillen maar houd de achterhersenen vast en gebruik een fijne schaar om de hypofysesteel en zenuwvezels verbonden met de hersenbasis door te snijden. Blijf de hele hersenen optillen en verwijderen om de hypofyse volledig bloot te leggen. De hypofyse rust op het dorsale oppervlak van het sfenoïde bot en wordt lateraal omringd door trigeminuszenuwen.Gebruik vervolgens schaar om het gehele sellaire gebied, inclusief de hypofyse, laterale trigeminuszenuwen en onder het sfenoïde bot, door te snijden. Plaats het weefsel in een 35 mm schaal met 4% PFA en incubeer het bij 4 graden Celsius gedurende 40 minuten tot 3 uur, afhankelijk van de leeftijden. Was vervolgens het gefixeerde weefsel met 10 mL PBS gedurende vijf verversingen van 15 minuten elk.Breng het gefixeerde weefsel over in een 35 mm schaal met 1 mL PBS en onder een stereomicroscoop dissocieert u de hypofysen. Voor P5 tot P14 hypofysen, verwijdert u met fijne pincetten en schaar de bindweefselmembraan tussen de zenuwen en het bot en isoleert u voorzichtig de hypofyse samen met de laterale trigeminuszenuwen als een geheel, maar laat de sella turcica achter. Voor P21 en volwassen hypofysen, verwijder de zenuwen en bindweefselmembraan rond de hypofyse en bevrijd de klier van het omliggende weefsel.Na dehydratie, xyleenklaring en waxinfiltratie volgens het tekstprotocol, verwijdert u op een weefsel-inbeddingsconsolesysteem het specimen uit de cassette en plaatst u het in een basisvorm half gevuld met gesmolten paraffinewas. Voor P21 en volwassen hypofysen, gebruikt u verwarmde fijne pincetten om de hypofyse te positioneren met de korte as loodrecht op het onderoppervlak van een basisvorm. Voor P0 tot P4 hypofysen, oriënteer de specimens met hun sfenoïde botten loodrecht op het onderoppervlak van een basisvorm.Voor P5 tot P14 hypofysen, oriënteer de specimens met hun trigeminuszenuwen loodrecht op het onderoppervlak van een basisvorm. Na het positioneren van de klier, gebruikt u verwarmde fijne pincetten om het weefsel voorzichtig in de gewenste positie te houden totdat de was semi-solide wordt op een koelplaat. Vul de vorm aan met gesmolten paraffinewas.Laat de paraffineblok afkoelen tot de was volledig gestold is. Koel de paraffineblok op minus 20 graden Celsius gedurende 10 tot 20 minuten en gebruik vervolgens een microtoom om het in dunne plakjes te snijden, waarbij de positie van de paraffineblok tijdens het snijden fijn wordt afgesteld. Voer immunolabeling uit volgens het tekstprotocol.Zoals hier getoond, om de hypofyse van de neonatale muis te dissecteren, werd het hele sellaire gebied dat de hypofyse, de trigeminuszenuwen en het onderliggende sfenoïde bot bevat, uit de schedelbasis gedissecteerd. De kleine en delicate hypofyse bleef intact tijdens het proces. Voor muizen ouder dan vijf dagen, werden de hypofysen die aan de laterale trigeminuszenuwen waren gehecht, geïsoleerd.De groeistructuur van de hypofyse geïsoleerd uit de P7 muis werd goed bewaard. Hier werd de hypofyse van de P21 muis succesvol geïsoleerd zonder zichtbare schade terwijl het omringende weefsel werd verwijderd. In deze figuur toont H&E-kleuring van correct georiënteerde coronale secties een goed bewaarde morfologie van zowel adenohypofyse als neurohypofyse in P0, P7 en P21 hypofysen.Ten slotte waren de verwerkte slides ook compatibel met immunofluorescencelabeling. Als voorbeeld toonden de adenohypofyse en neurohypofyse specifieke immunolabeling van respectievelijk GH en GFAP. Eenmaal beheerst, kan het proces van dissectie tot inbedding in 7,5 uur worden gedaan bij volwassen muizen en zelfs minder bij jongere muizen als het op de juiste manier wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om het hele sellaire gebied te dissecteren om te voorkomen dat de hypofyse met chirurgische instrumenten wordt aangeraakt. Volgens deze procedure kan de hypofyse die niet is geprefixeerd ook worden geïsoleerd. In dat geval moet meer voorzichtigheid worden betracht om ongewenste schade te voorkomen.De klier moet ook zo snel mogelijk worden gedissecteerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muishypofysen moet dissecteren en coronale secties van de hypofyse kunt voorbereiden in verschillende ontwikkelingsstadia.

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een methode om translationeel actief, intact synaptoneurosomes (SNS) voor te bereiden van de hersenen van muizen cortex wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt waardoor voor de snelle bereiding van actieve SNS.

De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt

We beschrijven de procedures voor de voorbereiding en elektrofysiologische opname van de hersenen plakken dat de dorsale-ventrale as van de mediale entorhinale cortex (MEC) te handhaven. Omdat neurale codering van de locatie volgt een rug-buik organisatie binnen de MEC, deze procedures te vergemakkelijken onderzoek van cellulaire mechanismen van belang voor de navigatie en het geheugen.

Voorbereiding van Parasagittal Slices voor onderzoek naar Dorsale-ventrale Organisatie van het knaagdier Medial entorhinale cortex

The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Met behulp van meerdere hoeken om de muis pup hersenen snijden, verbeteren we op een eerder beschreven acute hersenen slice, die de verbindingen tussen de meeste van de grote auditieve middenhersenen en de voorhersenen structuren vangt.

Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming

Veel typen menselijke hersentumoren zijn gelokaliseerd in specifieke gebieden in de hersenen en zijn moeilijk te laten groeien in cultuur. Dit protocol behandelt de rol van de tumormicro-omgeving en onderzoekt nieuwe medicamenteuze behandelingen door fluorescerende primaire hersentumorcellen te analyseren die groeien in een organotypische muizenhersensnede.

Een hersentumor / organotypische Slice Co-cultuur voor het bestuderen tumor micro en Gerichte Drug therapieën

In dit artikel beschrijven we, in detail, een protocol voor het genereren van neurosfeerculturen uit postnatale muisneurale stamcellen afkomstig van de belangrijkste muisneurogene niches. Neurosferen worden gebruikt om neurale stamcellen te identificeren uit hersenweefsel waardoor de schatting van voorloper celnummers. Bovendien kunnen deze 3D-structuren worden verguld met differentiërende omstandigheden, waardoor neuronen, oligodendrocyten en astrocyten ontstaan, waardoor het cellot kan worden...

Isolatie en uitbreiding van Neurosferen van Postnatale (P1−3) Muis Neurogene Niches

We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.

Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem van het lichaam. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van organoïden uit de hypofyse van de muis als een nieuw 3D in vitro model om de stamcelpopulatie van de klier te bestuderen waarvan de biologie en functie slecht begrepen blijven.

Ontwikkeling van organoïden uit muizenpluipcel als in vitro model om hypofyse stamcelbiologie te verkennen

Leer een betrouwbare methode voor dissectie van de hypofyse en preparatie van coronale secties bij ontwikkelende muizen. Dit protocol behoudt de weefselarchitectuur voor histologische analyse van celdifferentiatie en apoptose.

Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

Meer video's verkennen