Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren
3 december 2017
Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.
Het algemene doel van deze procedure is om corticale interneuron-progenitoren te genereren in post-mitotische interneuron-precursoren voor muizen embryonale stamcellen met behulp van een gemodificeerde embryoïde lichaam naar monolaag methode. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het neurowetenschappelijke veld, zoals hoe subtypen van corticale interneuronen hun individuele lot bereiken tijdens de ontwikkeling. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de efficiënte generatie van Nkx2.1-expresserende interneuron-progenitoren mogelijk maakt, evenals methoden om parvalbumine of somatostatine interneuron-subgroepen te verrijken.
Om deze procedure te beginnen, plateer mitotisch inactieve MEF feeder cellen in MEF media op weefselkweek behandelde platen. Laat ze minimaal 12 uur bezinken in een celkweek incubator bij 37 graden Celsius voordat u de mESC's plateert. Als ze niet onmiddellijk worden gebruikt, vervangt u het MEF media elke drie dagen.
Vervolgens, voeg mESC's met muis leukemie remmende factor toe aan de MEF platen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Passageer mESC's met trypsin-EDTA zodra de schaal 70 tot 80% conflueert, en houd de mESC's op een MEF feeder laag in mESC media om pluripotentie te behouden.
Voordat u begint met differentiatie, passageer de cellen minimaal eenmaal op gelatine gecoate platen zonder MEF's om ze te verdunnen. Om dit te doen, bereid gelatine gecoate platen voor door 0,1% gelatine en PBS met calcium en magnesium toe te voegen aan een weefselkweek behandelde schaal en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende minimaal 1 uur. Plateer 1,5 tot twee keer 10 tot de zesde cellen op elke tien centimeter schaal en laat ze twee dagen uitbreiden voordat u begint met differentiatie.
Op DD0, nadat de mESC's twee dagen op de gelatine gecoate platen zijn gegroeid, aspireer het media en was de cellen eenmaal met PBS zonder calcium en magnesium. Voeg vervolgens voldoende trypsin-EDTA toe om het oppervlak van de platen te bedekken. Plaats de cellen terug in de incubator bij 37 graden Celsius gedurende vier minuten.
Na vier minuten, doof trypsin-EDTA uit met tweemaal het volume van mESC media. Breng de cellen over naar een geschikt gedimensioneerde centrifugeerbuis, en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 200 keer g. Vervolgens, verwijder de buis en aspireer het media zonder de pellet te verstoren.
Resuspendeer de pellet in één milliliet KSR-N2 media. Vervolgens, meet de celconcentratie met behulp van een hemocytometer, of een geautomatiseerde celteller. Begin de cellen te laten groeien als embryoïde lichamen door 75.000 cellen per milliliet in KSR-N2 media toe te voegen in de niet-adherente weefselkweek schalen.
En incubeer ze bij 37 graden Celsius. Op DD1, bereid de cel landing voor door de weefselkweek behandelde schalen gedurende minimaal een uur of 's nachts bij 37 graden Celsius met poly-L-lysine te coaten. Op DD2, aspireer de poly-L-lysine en coat de platen met laminine 's nachts bij 37 graden Celsius.
Op DD3, voordat u begint met EB dissociatie, aspireer laminine en laat de platen volledig drogen in een weefselkweek kap. Breng vervolgens de EB's met het media over naar een 15 milliliter buis, en centrifugeer gedurende drie tot vier minuten bij 15 keer g of totdat de EB's zijn gepelleteerd. Aspireer het media, en voeg drie milliliter celdetacheringsoplossing met DNase toe.
Vervolgens, incubeer het monster bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Schud voorzichtig de buis elke drie minuten om EB dissociatie te bevorderen. Zodra de EB's niet meer zichtbaar zijn, of 15 minuten zijn verstreken, voeg zes milliliter KSR-N2 met DNase toe, en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 keer g.
Vervolgens, plateer de cellen in KSR-N2 met LDN193189, XAV939, en de ROCK remmer, Y27632, bij 4,5 tot vijf keer tien tot de vierde cellen per vierkante centimeter. Op DD5, ververs media met KSR-N2 met FGF2, IGF1, en SSH. Bereid vervolgens weefselkweek platen voor voor replateren op dag 8, volgens de instructies in de procedures op DD1 en DD2.
Op DD7, ververs media met KSR-N2 met FGF2, IGF1 en SHH. Op DD8, replateer de cellen door ze vijf minuten bij 37 graden Celsius los te maken van de platen met trypsin-EDTA. Doof trypsin-EDTA uit met tweemaal het volume met KSR-N2.
En centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 keer g. Filtreer de cellen door een 40 micron filterbuis om eventuele klonten te verwijderen. Plateer vervolgens de cellen opnieuw bij 250.000 cellen per vierkante centimeter in N2-KSR met FGF2, IGF1 en Y27632 met SHH.
Op DD10, ververs media met KSR-N2 met SHH. Was de cellen eenmaal met PBS zonder calcium en magnesium, en voeg voorverwarmd, niet-trypsin bevattend celdissociatie reagens toe, bevattend DNase aan de cellen. Plaats ze in de incubator bij 37 graden Celsius gedurende 10 tot 30 minuten, of totdat de cellen zijn losgemaakt.
Vervolgens, tik zachtjes op de platen om de dissociatie te bevorderen. Op DD5, ververs media met KSR-N2 met FGF2 en IGF1. Bereid vervolgens weefselkweek platen voor voor replateren op DD8.
Op DD7, ververs media met KSR-N2 met FGF2 en IGF1. Op DD8, replateer de cellen met smoothened agonist en voeg atypische PKC remmer toe. Op DD10, ververs media met KSR-N2 met aPKCi.
Op DD11, los de cellen van de platen voor FACS. Als de cellen niet werden losgemaakt voor FACS op DD11, ververs media op DD12 met KSR-N2 met aPKCi. Op DD14, ververs media met KSR-N2 met aPKCi.
En op DD16, ververs media met KSR-N2 met aPKCi. Vervolgens, op DD17, verzamel de Nkx-2.1:mCherry positieve cellen. Hier worden representatieve beel
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het genereren van corticale interneuron-progenitors en post-mitotische interneuron-precursors uit muis-embryonale stamcellen met behulp van een aangepaste embryoid body-naar-monolayer methode. Deze techniek maakt efficiënte generatie van Nkx2.1-expresserende interneuron-progenitors mogelijk voor het bestuderen van bestemmingsbepaling en therapeutische toepassingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Stamcellenonderzoek
Achtergrond
- Corticale interneuronen spelen een cruciale rol in de hersenfunctie.
- Inzicht in hun ontwikkeling kan inzicht geven in neurologische aandoeningen.
- Deze methode maakt het mogelijk om de bestemmingsbepaling van interneuronen te bestuderen.
- Het kan ook de verrijking van specifieke interneuron-subtypen vergemakkelijken.
Doel van het onderzoek
- Corticale interneuron-progenitors genereren uit muis-embryonale stamcellen.
- De ontwikkelingsroutes van corticale interneuronen onderzoeken.
- Mogelijke therapeutische toepassingen van deze progenitors verkennen.
Gebruikte methoden
- Aangepaste embryoid body-naar-monolayer methode.
- Gebruik van mitotisch inactieve MEF-feedercellen.
- Celcultuurtechnieken bij 37 graden Celsius.
- Fluorescente sortering van interneuron-precursors.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van corticale interneuron-progenitors.
- Efficiënte verrijking van parvalbumine en somatostatine interneuron-subgroepen.
- Inzichten in de bestemmingsbepaling van corticale interneuronen.
- Mogelijkheden voor therapeutische toepassingen in de neurowetenschap.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor het genereren van interneuron-progenitors.
- Het vergroot ons begrip van corticale interneuron-ontwikkeling.
- Toekomstige studies kunnen deze bevindingen benutten voor therapeutische vooruitgang.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient derivation of cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells enables systematic investigation of interneuron fate determination and supports scalable production of defined neuronal subtypes. This capability is critical for de-risking early neurodevelopmental targets and establishing robust in vitro models for disease-relevant mechanistic studies. The approach facilitates portfolio decisions by providing reproducible access to functionally distinct interneuron populations for downstream screening and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of interneuron lineage specification and fate determination mechanisms.
- Supports biological de-risking by generating Nkx2.1-expressing progenitors and post-mitotic interneuron subtypes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental and neuropsychiatric disorder research.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of defined interneuron subgroups for assay standardization.
- Enables quantitative assessment of differentiation efficiency and marker expression via FACS and immunostaining.
- Supports scalable preparation of PV and SST interneuron-enriched populations for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling by generating interneuron populations implicated in neuropsychiatric disorders.
- Enables continuity from in vitro differentiation to in vivo transplantation studies for functional integration analysis.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapeutic strategies targeting interneuron dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical model development, supporting both mechanistic studies and translational applications.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing on interneuron fate and molecular drivers of differentiation.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs for evaluating differentiation protocols and compound effects.
- Analytics: Enables robust measurement of marker expression and population purity using FACS and immunostaining.
- Translational Research: Bridges in vitro differentiation with in vivo transplantation for functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating interneuron subtypes across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in interneuron-targeted discovery and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes differentiation and enrichment protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for interneuron-focused programs and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neuronal differentiation, and FACS-based cell sorting.
- Demands access to specialized instrumentation for fluorescence imaging and flow cytometry.
- Necessitates cross-team standardization of differentiation and enrichment protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different stem cell lines or species-specific models.
- Dependent on maintenance of pluripotency and health of starting mESC populations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Culturing mESCs
2:14
Differentiation mESCs Toward MGE-like Telencephalic Progenitors
4:57
Somatostatin-enriching Protocol: "DD12 GFP High Sonic Hedgehog (SHH)"
6:36
PV-enriching Protocol: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi"
7:53
Generation of Nkx2.1::mCherry and Lhx6::GFP Interneuron Precursors
9:11
Conclusion
