Zoogdieren celdeling in 3D-Matrices via reflectie van kwantitatieve confocale microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om de verdeling van zoogdiercellen en interacties tussen cellen en matrix in een fysiologisch relevante 3D-omgeving te bestuderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een efficiënte en algemene benadering biedt om de verdeling van zoogdiercellen en interacties tussen cellen en matrix te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de celbiologie, zoals de moleculaire basis van de ontwikkeling van normaal en ziek weefsel.

Een dag voorafgaand aan de transfectie, plateer vijf miljoen HEK-293 T-cellen in een 100 milliliter celcultuurschaal in 10 milliliter normaal celcultuurmedium. Incubeer deze cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. De volgende dag, net voordat u met transfectie begint, haalt u een flesje van het transfectie reagens uit vier graden Celsius en laat u het op kamertemperatuur komen.

Voeg vervolgens een milliliter middel met verminderd serum toe aan een steriele microfugebuis. Voeg hieraan gespecificeerde hoeveelheden van lentivirale vectorplasmiden toe die gebruikt worden voor transfectie en meng door te pipetteren. Incubeer de buis gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.

Na vijf minuten, voeg 48 microliter van het transfectiereagens toe aan deze buis en meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer vervolgens dit mengsel gedurende minimaal 15 minuten op kamertemperatuur. Zodra de incubatie voltooid is, haalt u de plaat met HEK-293 T-cellen uit de incubator.

Voeg het voorbereide DNA transfectiereagens mengsel druppelsgewijs toe aan de cellen en draai de plaat voorzichtig om om een gelijkmatige verdeling in de plaat te garanderen. Plaats de plaat terug in de incubator. Ongeveer zes uur na transfectie, haalt u de plaat en aspireert u het medium.

Voeg 10 milliliter vers cultuurmedium toe en plaats de plaat terug in de incubator. Op verschillende tijdstippen, 24, 48 en 72 uur na transfectie, haalt u het cultuurmedium dat de lentivirale deeltjes bevat, in aparte buizen. Filter vervolgens het geoogste cultuurmedium door een steriele 0,45 micron filter om cellulaire resten te verwijderen.

Vervang met vers cultuurmedium na elke oogst. Het filtraat dat de lentivirale deeltjes bevat, kan direct worden gebruikt voor transductie of kan worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Plateer menselijke borstkankercellen MDA-MB-231 in een 35 millimeter cultuurschaal in normaal cultuurmedium.

Incubeer deze cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. De volgende dag, aspireert u het cultuurmedium van de plaat en voegt u een milliliter van de lentivirale deeltjes toe samen met een milliliter vers cultuurmedium. Incubeer de cellen in de incubator gedurende ongeveer 16 uur.

Nadat de incubatie met virale deeltjes voltooid is, haalt u de plaat om het medium te aspireren. Voeg vervolgens twee milliliter vers medium toe en plaats deze terug in de incubator gedurende 24 tot 72 uur. Controleer de expressie van H2B-mCherry in deze getransduceerde cellen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.

Om de synchronisatie-experimenten te starten, plateer eerst MDA-MB-231 cellen die H2B-mCherry tot expressie brengen op 50 tot 60% confluency in een 24-wells plaat. Incubeer de cultuur gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag, vervang het cultuurmedium met 0,5 milliliter medium dat twee millimolar Thymidine bevat.

Laat de plaat gedurende 24 uur in de incubator. Zodra de incubatie voltooid is, was de cellen drie keer met PBS om ze te bevrijden van de Thymidine behandeling. Laat de cellen vervolgens gedurende vijf uur in de incubator in 0,5 milliliter normaal cultuurmedium.

Voeg vervolgens Nocodazole toe aan het cultuurmedium om deze cellen in mitose te blokkeren. Laat de cellen gedurende 12 uur in de incubator. Na de Nocodazole behandeling, haalt u de plaat uit de incubator en schudt u de cellen gedurende 45 seconden tot een minuut met behulp van een orbitale shaker om mitotische cellen vrij te maken.

Transfer vervolgens het medium dat de geëxtraheerde mitotische cellen bevat, naar een nieuwe centrifugeerbuis. Voeg vervolgens 0,5 milliliter vers medium toe aan elke well. Herhaal het schudden en extraheren van cellen nog twee keer.

Pool het totaal verzamelde medium en centrifugeer het vervolgens om de mitotische cellen te pelletten. Na het centrifugeren, suspendeert u de cel pellet in 0,25 milliliter vers celcultuurmedium. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.

Bereidt aan het begin van deze stap 50 milliliter 10x DMEM oplossing voor en filter steriliseer het. Bepaal vervolgens de volumes van alle componenten die zullen worden gebruikt om de 3D collageen matrix te maken zoals gespecificeerd in het tekstprotocol. Koel al deze componenten op ijs voor om de gelering van collageen te vertragen.

Voeg nu, in een voorgekoelde 1,5 milliliter centrifugeerbuis, het vereiste aantal cellen toe in medium, gevolgd door 10x DMEM, FBS, gedeïoniseerd water, collageen en ten slotte natriumhydroxide. Meng voorzichtig met behulp van een één milliliter pipet. Zodra de oplossing goed gemengd is, voegt u 500 microliter van het mengsel toe aan elke well van de 24-wells plaat.

Plaats de 24-wells plaat in een incubator van 37 graden Celsius. Haal de plaat na 30 minuten uit de incubator en voeg 500 microliter voorverwarmd cultuurmedium toe bovenop de gel. Schakel voorafgaand aan beeldvorming de live cell eenheden van de fasecontrast en confocale microscopen in.

Om verdelende cellen vast te leggen, plaats de 24-wells plaat met de cellen ingebed in collageen matrices in de live cell eenheid van de fluorescentiemicroscoop. Gebruik het 10X objectief, vind de bodem van de plaat en beweeg deze omhoog tot de microscoop focust op ongeveer 500 micrometer van de bodem van de plaat. Beweeg de stage rond om cellen in verschillende