Name: Uiterst dunne Porated elastisch Hydrogels als biomimetische kelder membraan voor Dual cel cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Leer een methode voor het maken van ultradunne, poreuze hydrogels als biomimetische basementmembranen voor duale celkweek. Deze techniek maakt tuneerbare mechanische en biochemische eigenschappen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedank Prof. Paul Van Tassel en Prof. Chinedum Osuji voor hun doordachte gesprekken en materiaalkunde expertise. Financiering voor dit werk werd verzorgd door de Dubinsky nieuwe initiatief Award en de nationale instituten van gezondheid NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.

Lees Material Safety Data Sheet (MSDS) van alle materialen vooraf tijden om te gebruiken en veiligheidsmaatregelen op alle.
1. synthese van zinkoxide naalden
<ol>
	<li>Bereiden van 250 mL een 0,04 M Zn (3)2* 6 H2O-oplossing door het toevoegen van 2.9749 g van zink nitraat aan 250 mL water.</li>
	<li>150 mL 1 M NaOH voorbereiden door 6 g NaOH aan 150 mL water toe te voegen.</li>
	<li>Instellen van een minerale oliebad op een hete plaat met roerder en een maatkolf van 500 mL ronde onderkant onderdompelen in het oliebad bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 250 mL Zn (3),2* 6 H2O aan op de maatkolf en beginnen met het roeren van de reactie.</li>
	<li>Voeg 150 mL NaOH-oplossing (een witte neerslag zal kort vormen en dan verdwijnen als de twee oplossingen blijven mengen). Roer gedurende 2 uur ontdekt.</li>
	<li>Verhit de kolf tot 55-60 ° C en blijven roeren gedurende 24 uur.</li>
	<li>Zet van het vuur en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en roeren.</li>
	<li>Filtreer de oplossing op een Büchner trechter met een poriegrootte 11 µm en laten drogen overnachting, vanuit een ongedekte positie. Wanneer het koffiefilter niet langer nat van de gegoten oplossing is en een wit poeder heeft gevormd over de gaten van de trechter, worden de deeltjes volledig gedroogd.</li>
	<li>ZnO naalden verzamelen en voorbereiden van scanning elektronen microscopie (SEM) om te bevestigen de naald-achtige morfologie. Kort, mount carbon tape op een pin-stub en gebruik een metalen spatel om uitstrijkje de ZnO naalden op de koolstof-tape. Jas met 8 mm iridium bij een dichtheid van 22.4 g/cm3 sputter en verwerven van beelden op 10 kV.</li>
</ol>
2. toevoeging van opofferende zinklaag op Microscoop dia's voor HCl geïnduceerde Release van PEG
<ol>
	<li>Bereid zink acetaat oplossing door ontbinding 1.756 g van zink acetaat in 200 mL methanol.</li>
	<li>Schoon 3 "x 1" gewone Microscoop dia's met 70% ethanol en een disposable doekje. Laat lucht droog gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Plaatsen van een 150-mm glas petrischaal op een warm bord en verwarm tot 150-160 ° C.</li>
	<li>Een glazen pipet met een pipet lamp, houdt het glas dia's met pincet en vacht glijbanen door 5 druppels van zink acetaat, vorming van een laagje verspreid op de dia toe te passen. Toestaan dat overtollige oplossing te druppelen terug in stock oplossing.</li>
	<li>Plaats de dia in de voorverwarmde petrischaal (150-160 ° C) met de zink acetaat gecoate zijde naar boven. Laat op de kookplaat gedurende 15 minuten.</li>
	<li>De dia verwijderen met een pincet en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. De dia wordt weergegeven om te worden bekleed met witte strepen.</li>
	<li>Verwijder alle overtollige zink, dat is nog op de dia's met een disposable doekje te verwijderen van prominente witte strepen. Het oppervlak moet uniform zijn.</li>
	<li>Bloot de de voorbereide dia's UV-licht in de kap van een bioveiligheid voor ten minste 1 uur om de steriliteit. Let op: UV-licht is schadelijk voor de ogen en huid blootgesteld. Vermijd directe blootstelling aan oog- of huidletsel en elektrische voeding uitschakelen wanneer deze niet gebruikt.</li>
</ol>
3. bereiding van siliconen Isolators
<ol>
	<li>Gesneden siliconen blad in vierkanten van minder dan 1 "x 1" (isolators moeten kunnen passen in een 6-well schotel).</li>
	<li>8-12 mm gaten in het midden van de vierkantjes met een biopsie punch Punch.</li>
	<li>Autoclaaf siliconen isolatoren voor 20 min bij 121.0 ° C en 1,12 kg/cm.</li>
</ol>
4. voorbereiding van PEG oplossing en PEG Gel synthese
Opmerking: Functionalization en polymerisatie van PEG is uitgebreid onderzocht en gedetailleerde eerder door ons lab en anderen. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
<ol>
	<li>De RGD cel zelfklevende peptide combineren met acryloyl-PEG-NHS in 50 mM natriumbicarbonaat (pH 8,5) bij een verhouding 1:1 molair om functionalization voor de amine terminus van de peptide met de acrylaat-groep, een biochemische reactie die eerder is geweest gekenmerkt om het rendement hoger is dan 85% efficiëntie. 17</li>
	<li>Voorbereiden foto-initiator door het mengen van 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone met 1-Vinyl-2-pyrrolidon bij een concentratie van 300 mg/mL.</li>
	<li>In aparte 1,5 mL buizen, weeg het volgende: 20 mg ZnO naalden, 12,5 mg PEG-DA en 2,5 mg PEG-RGD.</li>
	<li>Schorten 20 mg ZnO naalden in 270 µL van 10% FBS/PBS-oplossing; Vortex te mengen (ongeveer 15 s).</li>
	<li>Kort (&#60; 1 s) draaien van de oplossing in een centrifuge benchtop mini om een ZnO-aggregaten aan de basis van de buis.</li>
	<li>250 µL verzamelen vanaf de bovenkant van de ZnO-oplossing, om ervoor te zorgen dat de aggregaten op de onderkant van de buis blijven. Combineren met PEG-DA en PEG-RGD maken een PEG-oplossing met ongeveer 2,5 mM RGD. Vortex te mengen (ongeveer 15 s).</li>
	<li>Voeg 2 µL van acetofenon/n-vinyl-pyrrolidon foto-initiator en vortex kort te mengen (ongeveer 5 s).</li>
	<li>Voeg 20 µL van de polymeeroplossing langs het midden van de ZnO bedekt dia's toe.</li>
	<li>Langzaam lager een tweede dia op de top, met het gezicht van de coating ZnO down (de PEG oplossing moet tussen twee ZnO gecoate lagen). Proberen te voorkomen van de vorming van alle luchtbellen. Verplaats de dia's lateraal langs de hoofdas om eventuele luchtbellen te ontsnappen en te verspreiden van de oplossing voor een dun laagje. De meerderheid van de dia met de polymeeroplossing dekken. Maak een kleine overhang met de bovenste dia om ervoor te zorgen dat de dia's uit elkaar in latere stappen kunnen worden getrokken.</li>
	<li>Dwarslijn de dia's onder een 365 nm UV lamp (ongeveer 10 mW/cm2) gedurende 15 minuten.</li>
</ol>
5. vrijgave van PEG Gels uit glas dia 's
<ol>
	<li>Druk uitoefenen op de overhangende dia en handmatig trek die de twee dia's apart in een traag tempo in volgorde voorkomen barsten van de dia's. Laat de gels te drogen voor ten minste 5 min, of 's nachts.</li>
	<li>Leg de dia in een steriele 25 mm glas petrischaal en zachtjes giet de 1 M HCl-oplossing op de dia, met slechts genoeg ter dekking van de dia (ongeveer 10-20 mL). Zachtjes rock de petrischaal; de gel moet beginnen om te heffen van de dia wegslepen zoals de HCl de opofferende zink coating en naalden lost. Zodra de gel vrij van de dia is, giet u de HCl terug in de stamoplossing.</li>
	<li>Spoel de gel door zachtjes binnenstromen ongeveer 25 mL 1 x PBS de petrischaal totdat de dia en de gel zijn ondergedompeld.</li></ol>Giet zorgvuldig af PBS in een afvalcontainer.
	<li>Giet voorzichtig ongeveer 25 mL 1 x PBS in de petrischaal totdat de gel is drijvend in de oplossing.</li>
	<li>Met pincet, zorgvuldig Schuif de silicone isolator onder de gel en de gel op het heffen.</li>
	<li>Breng de isolator en de gel in een 6-well schotel gevuld met steriele 1 x PBS.</li>
	<li>Herhaal dit proces totdat alle van de gels zijn verwijderd uit de dia's en zijn onderdompelen in PBS. Bloot de bereid gels aan UV-licht in de kap van een bioveiligheid voor ten minste 1 uur om de steriliteit.</li>

6. het zaaien van cel Bilayers
<ol>
	<li>Voorbereiden op A549 cellen zaaien. Kort spoelen een 75 cm2 kolf met 5 mL 1 x PBS, voeg 3 mL van 0,25% trypsine-EDTA en laat zitten voor 2-3 minuten bij 37 ° C.<ol>
		<li>Mechanisch doorroeren van de kolf, doven de reactie met 3 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine en verzamelen in een conische kolf van 15 mL. Spoelen met een extra 4 mL van de volledige Dulbecco bewerkt Eagle Media en in hetzelfde conische verzamelen. Spin cellen bij 475 x g gedurende 6 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoewel cellen zijn spinnen neer, voegt u een kleine daling van de volledige Dulbecco bewerkt Eagle Medium aan elk putje van de plaat van een 6-well. Gebruik pincet de isolators silicone met de gels overbrengen naar de nieuwe plaat van de 6-well, zodanig dat de gel op de daling van de media rust. Nu dat gels zijn verspreid in een dun laagje, controleren om ervoor te zorgen dat er geen grote gaten zichtbaar voor het oog zijn. Dit moet gebeuren vóór cel zaaien Voorkom drogen en barsten van de gels.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine met een concentratie van 6 x 105 cellen/mL. Voeg de cel schorsing druppel wijze naar het midden van de gel, proberen te houden een meniscus geponste uit inzake het siliconen-membraan. Cellen te houden gedurende 4 uur toestaan.</li>
	<li>Na 4 uur, Voeg 0,5 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Complete Medium naar de waterput en na een nacht bebroeden bij 37 ° C te voorzien in volledige hechting.</li>
	<li>De volgende dag, voorbereiden HUVECs cel zaaien.<ol>
		<li>Spoel de kolf met een 75 cm-2 met 5 mL 1 X PBS, voeg 3 mL van 0,25% trypsine-EDTA en laat zitten voor 2-3 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Mechanisch doorroeren van de kolf, doven de reactie met 3 mL M199 media met de foetale runderserum 20%, 1% penicilline-streptomycine en 1% groei supplement en verzamelen in een 15-mL kegelvormig.</li>
		<li>Spoel met 4 mL M199 volledige media en in hetzelfde conische verzamelen. Spin cellen bij 475 x g gedurende 6 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Terwijl cellen zijn spinnen neer, toevoegen een kleine daling van volledige medium 199 aan elk putje in een nieuwe 6-well-plaat. Plaats een nieuwe siliconen isolator in de put met de daling van de media in het midden van de siliconen.</li>
	<li>De siliconen isolator ter ondersteuning van de PEG gel met A549 cellen op de isolator in de nieuwe 6-well plaat met pincet, zorgvuldig worden gespiegeld.</li>
	<li>Resuspendeer HUVECs bij een concentratie van 6 x 105 cellen/mL en voeg de celsuspensie naar het midden van de daling van de gespiegelde gel verstandig, proberen te houden een meniscus op de gel binnen het geponste uit het siliconen-membraan. Toestaan dat cellen te houden gedurende 2 uur.</li>
	<li>Na 2 uur zachtjes Voeg 2 mL M199 volledige media aan elk putje.</li>
</ol>
7. immunofluorescentie
<ol>
	<li>Zorgvuldig Verwijder medium van de gel met een handmatige pipet en voeg ongeveer 500 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) naar het midden van de gel waar de cellen worden overgeënt. Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zitten. Let op: PFA is een giftige chemische stof; dragen van bescherming en zorgen voor behandeling wordt gedaan in een biologische veiligheidskast.</li>
	<li>Verwijder de PFA voorzichtig en ongeveer 500 µL van 2% BSA in PBS toevoegen aan elke gel. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur zitten.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de BSA. Bereiden van primaire antilichamen bij een verdunning 1:100 in 2% BSA in PBS en 500 µL toevoegen aan elke gel. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur zitten. Spoel zachtjes met 500 µL van 1 x PBS.<ol>
		<li>Herhaal hetzelfde proces met de secundaire antilichamen. Gebruiken na antilichamen: 1) anti-menselijke CD144 (VE-cadherine) kloon 16B1; 2) anti-menselijke CD324 (E-cadherine) kloon 6714; 3) anti-menselijke CD31 (PECAM-1) kloon C-20; 4) anti-A549; 5)-antimuis FITC; 6) anti-geit Alexa Fluor 647. Om te visualiseren F-actine, voeg 500 µL van Phalloidin (10 µg Fe/mL in PBS) voor 20 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verwijder voorzichtig secundaire antilichamen of phalloidin en het toevoegen van 500 µL van de DAPI (0,1 µg/mL) voor 20 min. Verwijder voorzichtig DAPI oplossing en 1,5 mL 1 x PBS aan elk putje voorzichtig toe te voegen zodat gels in suspensie zijn.<ol>
		<li>Met behulp van pincet en siliconen isolatoren, overbrengen in een gel een glasplaatje. Doe dit voor elke gel onmiddellijk vóór imaging en gels in PBS oplossing vervangen na imaging.</li>
		<li>Als alternatief, monteren met behulp van een medium van de montage DAPI gels. Zegel goed de monsters met nagellak, verwerven van beelden binnen 2 dagen drogen en barsten van de gel te voorkomen. Zie tabel 1 voor probleemoplossing.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li>
<li>Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+pores+in+human+bronchial+epithelium%3A+a+conduit+for+infiltrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells.</a> Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composite+model+of+the+human+postcapillary+venule+for+investigation+of+microvascular+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment.</a> FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).</li>
<li>Mul, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+migration+of+neutrophils+across+monolayers+of+endothelial+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells.</a> J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).</li>
<li>Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cell+lines+in+coculture+with+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%3A+development+of+an+alveolo-capillary+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro.</a> Lab Invest. 84, 736-752 (2004).</li>
<li>Birkness, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+tissue+culture+bilayer+model+to+examine+early+events+in+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Infect Immun. 67, 653-658 (1999).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+attenuate+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+permeability+under+septic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions.</a> PLoS One. 8, 55311(2013).</li>
<li>Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+biomimicry+for+the+creation+of+investigational+and+therapeutic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Nanomed+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices.</a> Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).</li>
<li>Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+to+investigate+the+impact+of+ECM+chemistry+and+mechanics+on+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).</li>
<li>West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-patterned+hydrogels%3A+Customized+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments.</a> Nat Mater. 10, 727-729 (2011).</li>
<li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J Control Release. 109, 139-148 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Taite, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+hydrogel+substrates%3A+probing+leukocyte+receptor-ligand+interactions+in+parallel+plate+flow+chamber+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies.</a> Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S2339547814500113">Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis.</a> Technology. 02, 133-143 (2014).</li>
<li>DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+gradients+of+bFGF+on+hydrogel+scaffolds+for+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration.</a> Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic%2C+ultrathin+and+elastic+hydrogels+regulate+human+neutrophil+extravasation+across+endothelial-pericyte+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers.</a> PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).</li>
<li>Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28Ethylene+Glycol+Hydrogel+Scaffolds+Containing+Cell-Adhesive+and+Protease-Sensitive+Peptides+Support+Microvessel+Formation+by+Endothelial+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).</li>
<li>Schwartz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+strategy+for+mimicking+the+extracellular+matrix+provides+new+insight+about+tumor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration.</a> Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membranes%3A+structure%2C+assembly+and+role+in+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).</li>
<li>Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Poly%28ethylene+glycol%29-based+Tumor+Angiogenesis+Model+to+Study+the+Influence+of+Vascular+Cells+on+Lung+Tumor+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior.</a> Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).</li>
<li>Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+the+translocation+of+Mycobacterium+tuberculosis+across+a+bilayer+of+epithelial+and+endothelial+cells+as+a+model+of+the+alveolar+wall+is+a+consequence+of+transport+within+mononuclear+phagocytes+and+invasion+of+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells.</a> Infect Immun. 70, 140-146 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hier gedetailleerde heeft ons maken een afstembare PEG hydrogel om te dienen als een biomimetische BM steiger toegestaan. In het bijzonder door verschillende PEG molecuulgewichten, peptide vervoeging strategieën, en zinkoxide microkristallijne structuren of concentraties, de elasticiteitsmodulus, kunnen biochemische eigenschappen en poreuze structuur van de hydrogels worden gewijzigd, respectievelijk. De uiterst dunne PEG steiger beschikt over een hogere dichtheid van de poriën en een kleinere diameter van d...

Extracellulaire matrices (ECM) make-up de eiwit-steigers die het ondersteunen van cel bijlage en dienen als de barrières tussen de verschillende celtypen en zijn een essentieel onderdeel van complexe weefsels en organen. In tegenstelling tot interstitiële bindweefsel is de kelder membraan (BM) een gespecialiseerde vorm van ECM die als een barrière fungeert voor het verdelen van weefsel compartimenten van elkaar. BMs ongeveer 100 µm dik zijn, en daarom zorgen voor directe en indirecte communicatie tussen cellen aan weerszijden. Twee veelvoorkomende voorbeelden van BMs zijn vasculaire BMs, gevonden in de microvasculaire muur tussen pericytes en endotheliale cellen, en luchtweg-BMs die zijn gevonden tussen endotheel en epitheliale cellen. BMs dienen een belangrijke rol bij het reguleren van de functie van de cel, zoals cel polariteit en migratie, in gezondheid en ziekte. 1 de samenstelling, stijfheid, architectuur en porositeit van BMs verschilt orgaansystemen te vergemakkelijken van verschillende fysiologische functies. Bijvoorbeeld, zijn BM poriën cruciaal voor het behoud van cel-cel communicatie, oplosbare molecuul diffusie, en voor de migratie van immuuncellen tijdens ontsteking of bacterie tijdens de infectie. In de luchtwegen uitstrekken poriën over de volledige dikte van de BM, met een diameter variërend van 0,75 tot 3.86 µm.2
De dunne aard van de BM garandeert dat hoewel celtypes fysiek van elkaar gescheiden zijn, intercellulaire communicatie via het paracrine - en contact-bemiddelde signalering behouden blijft. Dus, om te studeren ziekten bij de mens in vitro, onderzoekers hebben vertrouwd op poreuze doorlaatbare steun inzetstukken aan cultuur cellulaire bilayers. 3 deze modellen zijn cruciaal voor het begrip van de cellulaire communicatie een rol in gezondheid en ziekte speelt. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 doorlaatbare steun inzetstukken voldoen aan de basisvereisten voor het begrijpen van hoe cel signalering regelt fysiologische processen, zoals leukocyte werving en bacteriële infiltratie; echter de inserts aanzienlijke beperkingen hebben en niet na te bootsen van een menselijke BM. Permeable ondersteuning inzetstukken ontbreken zowel mechanische en biochemische tunability, en de simplistische poreuze structuur doet niet na te bootsen de vezelige structuur waarmee de onregelmatige poriën typisch van BMs. Daarom is er een groeiende behoefte aan afstembare systemen die de inheemse BM eigenschappen die van invloed zijn cellulaire processen kunt recreëren.
Polymeer gebaseerde substraten zijn ideale kandidaten voor de ontwikkeling van biomimetische BMs te bestuderen van cellulaire bilayers in een context die nauwer de omgeving in vivo bootst . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polymeren worden mechanisch afstembare en chemisch kunnen worden aangepast voor het nemen van biomimetische peptide fragmenten. 11 , 12 , 13 het bioinert polymeer polyethyleenglycol (PEG) kan worden gebruikt voor het construeren van biomimetische BMs en recente werk is de synthese van mechanisch afstembare PEG arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) gels met poreuze netwerken die ondersteuning bieden voor celgroei gedetailleerde en inflammatoire cel chemotaxis. 14 hoewel gepubliceerd PEG gebaseerde substraten verstrekt een realistischer model voor een menselijke ECM dan permeabele ondersteunt, veel van deze modellen zijn zeer dikke, met een diepte van ongeveer 775 µm die beperkt het vermogen dubbelgelaagde culturen maken met cel-cel contactpersonen. 14
Hier presenteren we een protocol voor de oprichting van een PEG polymeer gebaseerde BM mimic overwint veel van de beperkingen van de huidige cel dubbelgelaagde cultuur technologieën. Hebben we een templating methode waarin zinkoxide, een veel gebruikt materiaal voor de vervaardiging van microkristallijne productie, in het polymeer tijdens de synthese en crosslinking, dat vervolgens en selectief verwijderd is van de resulterende bulk polymeer. Dit proces genereert een willekeurige poreuze netwerk, het nabootsen van de porie van het moeizame en onderling verbonden netwerk van menselijke BMs. Verder kan de porositeit worden gewijzigd door het veranderen van de grootte en vorm van de zinkoxide microcrystals via wijziging van de reactie stoichiometrie tijdens de productie van de naald. De techniek ontwikkeld hier maakt u een uiterst dunne hydrogel die de dikte van een menselijke BM. ten slotte, de monteurs, de poreusheid bootst, en de biochemische samenstelling van deze BM-achtige constructies kan gemakkelijk worden veranderd voor het genereren van een communicatie die het meest vergelijkbaar met dat gezien in vivo.

<table><tbody><tr><td>1M Hydrogel Chloride (HCl)</td><td>EMD</td><td>HX0603-75 2.5L</td><td>Steriele. Gebruik in een afzuigkap met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133 500 mL</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2&bull;6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228737-500g</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Macron Chemicals</td><td>278408-500g</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+&bull;2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45180010 1 kg</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Methanol (CH3OH)</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-05 4L</td><td>Gebruik in een afzuigkap met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Steriele filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS&nbsp;</td><td>PLD-B280B</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Round bottom flask</td><td>ChemGlass</td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Stir bar</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td>Spuit met ethanol en laat drogen voor gebruik.</td></tr><tr><td>Glass pasteur pipets</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>1 mL rubber bulbs</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Plastic 100 mm petri dishes</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sterile forceps</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Silicone isolators</td><td></td><td></td><td>0.8 mm dik</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) punches</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Glass bottles</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>Cellstar</td><td>657 160</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Stirrer-hot plate</td><td>VWR Dya-Dual</td><td>12620-970</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24650-42-8</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)</td><td>Aldrich</td><td></td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)</td><td>Fluka</td><td>81280-1kg</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>RGDS</td><td>Life Tein</td><td>180190</td><td>Gebruik met oogbescherming en handschoenen.</td></tr><tr><td>Blak-Ray long wave UV lamp</td><td>UVP</td><td>Model B 100AP</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

uiterst dunne porated elastisch hydrogels als biomimetische kelder membraan voor dual cel cultuur

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

De membraan van de kelder is een essentieel onderdeel van de cellulaire bilayers die in de stijfheid, samenstelling, architectuur en poreusheid variëren kan. In vitro studies van endotheel-epitheliale bilayers traditioneel hebben vertrouwd op doorlaatbare steun modellen waarmee dubbelgelaagde cultuur, maar doorlaatbare ondersteunt zijn beperkt in hun vermogen om te repliceren de diversiteit van menselijke kelder membranen. Daarentegen hydrogel modellen waarvoor chemische synthese zijn zeer afstembare en zorgen voor wijzigingen van de materiële stijfheid én de biochemische samenstelling via opneming van peptiden biomimetische of eiwitten. Traditionele hydrogel modellen zijn echter beperkt in functionaliteit wegens hun gebrek aan poriën voor cel contacten en functionele in vitro migratie studies. Bovendien, als gevolg van de dikte van de traditionele hydrogels, heeft opneming van poriën die zich uitstrekken over de volledige dikte van de hydrogels geweest uitdagend. In de huidige studie gebruiken we poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels en een roman zinkoxide templating methode om de vorige tekortkomingen van biomimetische hydrogels. Dientengevolge, presenteren we een uiterst dunne, kelder membraan-achtige hydrogel waartoe de cultuur van confluente cellulaire bilayers op een aanpasbare steiger met variabele porie platforms, mechanische eigenschappen en biochemische samenstelling.

PEG-RGD hydrogels werden gevormd door sodat het polymeeroplossing tussen twee opofferende zinkoxide lagen en het creëren van porie sjablonen met zinkoxide naalden. Offer zinkoxide onderdelen werden vervolgens verwijderd met zoutzuur, het genereren van uiterst dunne PEG hydrogels met continue poriën (Figuur 1). De morfologie van zinkoxide naalden werd bevestigd door het scannen van elektronen microscoop (SEM), en de gemiddelde lengte en breedte werden bepaald ...

Actuele modellen van de cultuur van de dubbelgelaagde toegestaan niet voor functionele in vitro studies die in vivo microenvironments na te bootsen. Met behulp van polyethyleenglycol en een methode van zinkoxide templating, beschrijft dit protocol de ontwikkeling van een uiterst dunne biomimetische kelder membraan met afstembare stijfheid, porositeit en biochemische samenstelling die nauw samen van de Nabootsers van in vivo extracellulaire matrices.

Uiterst dunne Porated elastisch Hydrogels als biomimetische kelder membraan voor Dual cel cultuur

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Het algemene doel van dit protocol is om een methode met polyethyleenglycol en zinkoxide als mal te beschrijven om een poreuze, ultradunne, biomimetische basement membraan te creëren die een dubbele celcultuur ondersteunt en afstembare mechanische en chemische eigenschappen heeft. Het grote voordeel van deze techniek is dat we hydrogels kunnen maken die ultradun, geperforeerd, mechanisch en biochemisch afstembaar zijn. Ze maken ondersteuning mogelijk voor zowel enkele als dubbele celcultuur.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het gebied van weefselengineering, inclusief hoe dubbele celculturen reageren op en interageren met micro-omgevingen die menselijke basement membranen nabootsen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar een breed scala aan biologische systemen en weefsels, wat uiteindelijk meer biomimetisch onderzoek mogelijk maakt met een verbeterde translatie voor menselijke ziekten. Voeg 250 milliliter zinknitraat toe aan een kolf en begin met roeren van de reactie.Voeg vervolgens 150 milliliter natriumhydroxideoplossing toe. Er zal kort een witte neerslag ontstaan die vervolgens verdwijnt terwijl de twee oplossingen blijve

ultrathin-porated-elastic-hydrogels-as-biomimetic-basement-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid...

Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering aan het verstrekken van niet-continu verlopende statische spanningen op een concentrische cel-beladen hydrogel te reguleren celuitlijning voor weefselengineering.

Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

Engineering en analyse van dragende weefsels met heterogene celpopulaties is nog steeds een uitdaging. Hier beschrijven we een methode voor het maken van bi-gelaagde alginaat-hydrogelschijven als platform voor co-cultuur van diverse celpopulaties binnen één constructie.

Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Recombinant eiwit-engineered hydrogels zijn voordelig voor 3D-celkweek als ze toe voor volledige tunability van de ruggengraat van het polymeer, en dus de cel communicatie. Hier beschrijven we het proces van recombinante elastine-achtige EiwitReiniging en de toepassing ervan in 3D hydrogel cel inkapseling.

Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D

Weefselkweekinserts met plastic membranen zijn de gouden standaard in celkweeklaboratoria als permeabele dragers om cellagen en modellen van barrièreweefsels te vestigen. Hierin presenteren we een eenvoudige methode om het plastic membraan te vervangen door een biologisch relevanter membraan gemaakt van een recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde-eiwit.

Nanofibrillaire basale membraan nabootsen gemaakt van recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde in op maat gemaakte weefselkweekinzetstukken

Cultuur van normale cellen in hun drie-dimensionale context is een alternatieve methode voor vroege gebeurtenissen die nodig is voor cellulaire transformatie en tumorvorming te bestuderen. Deze methode wordt gebruikt om de normale eierstokken en oviductal cellen groeien naar vroege gebeurtenissen bij eierstokkanker vorming te bestuderen.

Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders

Leer een methode voor het maken van ultradunne, poreuze hydrogels als biomimetische basementmembranen voor duale celkweek. Deze techniek maakt tuneerbare mechanische en biochemische eigenschappen mogelijk.

Uiterst dunne Porated elastisch Hydrogels als biomimetische kelder membraan voor Dual cel cultuur

Meer video's verkennen