Tweede harmonische generatie signalen in konijn Sclera als een instrument voor de beoordeling van de therapeutische weefsel dwarsbinding (TXL) voor bijziendheid

Het algemene doel van dit protocol is om het gebruik van tweede harmonische generatie microscopie aan te tonen om het collageenkruisverbindingseffect in scleraal weefsel te visualiseren en te meten, zoals geïnduceerd door sub-tenon's injectie van een formaldehydeafgevend middel, en zoals bevestigd met differentiële scanning calorimetrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van therapeutische weefselkruisverbindingen door een niet-invasieve methode te bieden om de geïnduceerde kruisverbindingseffecten te evalueren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de gegenereerde tweede harmonische signalen zeer specifiek zijn voor collageenfibrillen, en als zodanig is er geen speciale weefselvoorbereiding, zoals antilichaamkleuring, vereist.

We hadden voor het eerst dat idee voor deze methode toen we las over de procedure die werd toegepast op therapeutische corneaal weefselkruisverbindingen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien succesvolle tweede harmonische generatie microscopie zorgvuldige plaatsing van het weefsel en correcte beeldvormingscondities vereist om weefselbeschadiging en artefacten in signaalmeting te voorkomen. Begin de behandeling met een sub-tenon's injectie in de oogbollen van de konijnen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Hier getoond is een schematische weergave van de sub-tenon's injectieplaats. Selecteer een optimaal gedimensioneerde speculum volgens de grootte van het oog. Na drieënhalf uur incubatie, trek de oogleden terug met behulp van de ooglidslijm om optimale toegang tot de oogbol te verkrijgen.

Separeer het conjunctiva rond de limbus en snijd de extraoculaire spieren op hun sclerale invoegpunten. Snijd het bovenste deel van de sclera met een schaar of een mes om een gebied van één op één centimeter te creëren met de injectieplaats centraal gelegen. Schrob de resterende retinale en choroïdelagen af en spoel twee keer met vers PBS, waarbij de stukken elke keer ongeveer 10 seconden in oplossing worden gelaten.

Plaats het weefsel in milliliterbuisjes gevuld met PBS-oplossing voor transport naar de beeldvormingsfaciliteit. Om het signaal en de resolutie te maximaliseren bij het uitvoeren van SHG-microscopie, gebruik een objectief dat is geoptimaliseerd voor het doorlaten van infrarood licht, en met een hoge numerieke apertuur. Pas de correctiehals van het objectief aan om de diepte van het monster te matchen.

In dit geval, 0,17 millimeter. Monteer het 25-voudige objectief op de microscoop en voeg een royale hoeveelheid watergebaseerde immersiegel toe om het objectiefoppervlak te bedekken. Het is belangrijk om de weefselbeeldvorming binnen 30 minuten na het monteren van het monster op de microscoop uit te voeren om het weefsel gehydrateerd te houden en het drogen van de immersiegel tussen het objectief en de glasplaat te voorkomen, aangezien dit resulteert in veranderingen in het SHG-signaal.

Monteer de celkamer door een 25 millimeter ronde dekglas op de onderste deel van de kamer te plaatsen. Plaats het stuk scleraweefsel op het dekglas en voeg 50 tot 100 microliter buffer toe. Bedek het weefsel met een tweede ronde dekglas en schroef het bovenste deel van de kamer vast zonder het weefsel te drukken of plat te maken.

Monteer vervolgens de celkamer met het weefselmonster op de microscoopstandaard. Positioneer de standaard en pas de hoogte van het objectief aan zodat het onderste oppervlak van het monster scherp staat, zoals bepaald door helderveldinspectie door het oogstuk. Schakel alle lichten uit behalve de computermonitor en blokkeer zoveel mogelijk licht van de monitor met aluminium foliebladen die over de microscoopstandaard zijn gedrapeerd.

In de software, schakel de Eye Port-modus uit. Controleer in het TI Pad-paneel of de lensdefinitie correct is. Kies in het A1 Compact Graphical User Interface-paneel de infraroodlaser voor beeldvorming, selecteer de Non Descanned Detectors en kies het DAPI-kanaal dat is uitgerust met een bandpassfilter van 400 tot 450 nanometer.

In het A1 Multi Photon Graphical User Interface-paneel, stel de golflengte van de infraroodlaser in op 860 nanometer en open de sluiter. Wacht tot de emissiegolflengte is veranderd, zoals aangegeven door het constante groene licht. Om de laserscancondities in het A1 Compact Graphical User Interface-paneel in te stellen, selecteer Galvano scanner, unitrichtingscannen, een framegrootte van 1024 bij 1024 pixels, pixelverblijftijd van 6,2 microseconden en lijngemiddelde van 2X.

Schakel vervolgens live beeldvorming in met de find-modus en stel de beeldcondities in het AI Compact Graphical User Interface-paneel in door de laservermogen en detectorversterking aan te passen. Stel het laservermogen in tussen 50 milliwatt en 150 milliwatt, dat wil zeggen tussen twee procent en zes procent voor een laser op 860 nanometer. Boven dit bereik kan weefselbeschadiging optreden.

Open het Lookup table-paneel dat een histogram van pixelintensiteitswaarden in het huidige beeld weergeeft en pas verder de versterking van de detector aan in de HV-gelabelde balk om het bereik van pixelwaarden te maximaliseren terwijl verzadiging wordt vermeden. Gebruik het monster met het hoogste SHG-signaal om de optimale laser- en versterkingsinstellingen te vinden. Houd identieke instellingen aan voor alle monsters die in één experiment worden vergeleken.

Deze praktijk zorgt ervoor dat geen enkel monster in het experiment de detector zal verzadigen. Om het weefselgebied in voorbeeldmodus te scannen, opent u de XYZ-overzichtstool. Stel de beeldvorming in op een lagere resolutie om de verwerving van beelden in deze modus te versnellen.

In het XYZ-overzichtspaneel, klikt u met de rechtermuisknop op de huidige positie en selecteert u scan vijf bij vijf, drie bij drie of enkele weergavevastlegging. Nadat het scannen is voltooid, gaat u naar een nieuwe locatie door te dubbelklikken op een gebied buiten het huidige voorbeeldgebied. Schakel de Live Scan-modus in en brengt u het weefsel scherp, omdat verschillende delen van het weefsel lichtjes verschillende posities in de axiale richting kunnen hebben.

Leg een nieuwe vijf