Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Het algemene doel van deze procedure is om het metabolisme van meerdere nutriëntenbronnen kwantitatief te onderzoeken met behulp van gelabelde substraten. Deze workflow maakt het mogelijk om het lot van geconsumeerde nutriënten en de metabolische oorsprong van door gisten gesynthetiseerde verbindingen te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van microbieel metabolisme, zoals hoe alle metabolismen werken afhankelijk van omgevingsomstandigheden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de verduidelijking en kwantificering van de eiwitverdeling van nutriënten uit meerdere bronnen mogelijk maakt. Deze methode werd gebruikt om het stikstofmetabolisme van gist te onderzoeken, maar kan ook worden toegepast op andere metabolismen en micro-organismen. De sleutel tot succes met dit experiment ligt in de reproduceerbaarheid van fermentaties.

Gebruikers moeten bijzondere aandacht besteden aan het verzamelen van de cellen in dezelfde gedefinieerde fysiologische fase. De procedure wordt gedemonstreerd door Christian Picou van ons technisch personeel, Pauline Seguinot, een promovendus van het laboratorium, en Stephanie Rollero, een post-doctoraal fellow. In een autoclaaf, pasteuriseer elk synthetisch medium dat is voorbereid voor elke stikstofbron in een fles van één liter met een magnetische roerlat.

Los de juiste hoeveelheid gelabelde molecuul op om de gewenste eindconcentratie in het medium te bereiken. Steriliseer het medium met behulp van een wegwerpvacuümfiltratiesysteem. Verdeel het medium met behulp van een steriele meetcilinder tussen twee voorgesteriliseerde fermentoren die een magnetische roerlat bevatten en zijn uitgerust met fermentatievergrendelingen om de toetreding van zuurstof te voorkomen, maar het vrijkomen van koolstofdioxide toe te staan.

Na het kweken van een cerevisiae-stam in YPD-medium, verzamel een pre-cultuur-aliquot onder laminaire stroming en bepaal de celpopulatie met behulp van een elektronische deeltjesteller die is uitgerust met een opening van 100 micrometer. Na het centrifugeren van de pre-cultuur, suspendeer het pellet in een geschikt volume steriel water om een ​​eindconcentratie van 2,5 keer 10 tot de 9e cellen per milliliter te verkrijgen. Vervolgens, inoculeer elke fermentor met één milliliter van de celsuspensie.

Bereidt hierna een fermentatieplatform voor door de fermentoren te installeren in de ondersteuningsgeleiders die op de juiste plaats zijn geplaatst op de roerplaten met 21 posities en stel de roersnelheid in op 270 RPM. Om het online bewaken van elke fermentatie te starten, start u de robotbesturingsapplicatie, klikt u op de knop Start Assay en selecteert u het fermentatievolume dat moet worden uitgevoerd. Om ervoor te zorgen dat de weergegeven interface de indicatie van het aantal en de positie van fermentoren op het platform toestaat, klikt u met de rechtermuisknop op de sleuflocatie en kiest u Uitschakelen om de monitoring van de lege posities te deactiveren.

Om de berekeningssoftware te initialiseren, klikt u op de knop Initializer en valideert u met OK. Klik vervolgens op de Start-knop van de robotbesturingsapplicatie om de gewichtsmetingen te starten. Centrifugeer vervolgens twee zes-milliliter monsters uit de fermentoren bij 2.000 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Wanneer dit is voltooid, brengt u elk bevroren supernatant over in twee buisjes en bewaart u deze bij min 80 graden Celsius.

Was elk pellet twee keer met vijf milliliter gedistilleerd water en bewaar het bij min 80 graden Celsius voor de meting van isotopenverrijking. Voeg 200 microliter van een 25% sulfosalicylzuur-oplossing die 2,5 millimolair norleucine als interne standaard bevat toe aan 800 microliter monster om moleculen met hoge molecuulgewichten te verwijderen. Na incubatie en centrifugatie, filtert u het mengsel door een nitrocellulosemembraan met een poriëngrootte van 0,22 micrometer en plaatst u het monster in een aminozuuranalysesysteem.

Klik in het programma of de software van het analysesysteem op de knop Uitvoeren om de vloeistofchromatografie-analyses te starten met de analyzator die is uitgerust met een kationenuitwisselingskolom. Bereid vervolgens een geoxideerde extractie voor door een eerder bereide gelabelde cellenpellet op te schorsen in 200 microliter performinezuur. Na incubatie gedurende vier uur bij vier graden Celsius, stopt u de reactie door 33,6 milligram natriumsulfaat toe te voegen.

Voeg 800 microliter van zes normale zoutzuur toe aan het geoxideerde extract en incubeer het monster in een hermetisch afgesloten glazen buis gedurende 16 uur bij 110 graden Celsius in een droog-hitteoven. Nadat u het monster heeft laten afkoelen tot kamertemperatuur, voegt u 200 microliter van 2,5 millimolair neuroleucine toe en verwijdert u het waterstofchloridegas met een stroom stikstof. Was het gedroogde extract twee keer met 800 microliter gedistilleerd water en vervolgens 800 microliter ethanol.

Voeg vervolgens 800 microliter van een 200-millimolair lithiumacetaatbuffer toe aan het extract. Bepaal de relatieve concentraties van aminozuren binnen eiwitten in het monster met behulp van de eerder beschreven chromatografische methode. Hydrolyseer een gelabelde cellenpellet door 1,2 milliliter zes-molair zoutzuur toe te voegen en het monster gedurende 16 uur bij 105 graden Celsius in een goed gesloten glazen buis in een droog-hitteoven te incuberen.

Laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur en voeg vervolgens 1,2 milliliter gedistilleerd water toe. Na centrifugatie om de cellulaire debris te verwijderen, verdeel het supernatant in zes fracties van 400 microliter in open glazen buisjes. Droog de fracties in de droog-hitteoven bij 105 graden Celsius gedurende vier tot vijf uur totdat ze de consistentie van siroop hebben.

Tijdens de biomassahydrolyse, droogt u de fractie tot de consistentie van een siroop door de zuurgraad van de werking regelmatig te controleren. Voor ECF-derivatisering, lost u het gekoelde gedroogde hydrolysaat op in 200 microliter van 20-millimolair zoutzuur en 133 microliter van een een-op-vier mengsel van pyridine en ethanol. Voeg 50 microliter ethylchloroformiaat toe om de aminozuren te derivatis