Name: Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer het isoleren van zeldzame doelcellen uit bloed voor moleculaire analyse op enkelcellig niveau. Deze methode maakt karakterisering van circulerende tumorcellen mogelijk voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie is gefinancierd door de Oostenrijkse wetenschap Fonds (FWF), project-no. Ik 1220-B19 (naar P.S.) als onderdeel van de ERANET-project in translationeel kanker onderzoek (TRANSCAN) "Circulerend tumorcellen als biomerker voor Minimal Residual Disease in prostaatkanker (CTC-SCAN)". Promovendus S.C. werd opgeleid in het kader van de PhD programma Molecular Medicine van de medische universiteit van Graz. De auteurs erkennen dankbaar Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz en Johanna Schiller voor hun deskundige technische bijstand. De auteurs bedanken Georg Peinhaupt voor grafisch ontwerp steun.

<ol><li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
<li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li>
<li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li>
<li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li>
<li>Möhlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+Release%3A+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424(2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li>
<li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li>
<li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li>
<li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li>
<li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li>
<li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622(2017).</li>
<li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells%3A+a+clinical+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li>
<li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322(2016).</li>
<li>Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li>
<li>Czyż, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li>
<li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).</li>
<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-53661-3_12">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24556840">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S157478911600017X">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het beschreven protocol is gericht op het ophalen van cellen uit een functionalized draad (hierna: apparaat) p.a. ex vivo eencellige genomic. We testten drie cellijnen van de EpCAM-positieve (HT-29, LNCaP en VCaP), maar in principe, deze methode kan worden toegepast op elke regel van de cel uiting van EpCAM. EpCAM-positieve doelcellen kunnen worden voorgelegd aan het apparaat als pure celsuspensie (zie 2.1.) of gemengd in een overschot van achtergrond cellen (bv. perifere bloed, zie punt 2.2.). Overwegende dat vooral de laatste kunnen worden gebruikt voor het testen van isolatie capaciteiten onder zeldzame cel voorwaarden, fine tuning van het aantal cellen die zijn gekoppeld aan de draad kan gebeuren met behulp van de beschreven kleinschalige aanpak (zie 2.3.). Zoals verschillen tussen cellijnen zijn te verwachten, snelheid geschikt cel dichtheden voor het opladen van de draad, rotatie evenals incubatietijd moeten empirisch getest worden door het aantal gekoppelde cellen met behulp van een Microscoop immunofluorescentie te evalueren.
Voor genomic downstream toepassingen op het niveau van de eencellige WGA, is vereist. De WGA-methode van keuze kan verschillen tussen labs en onze methode is in principe open voor alle methoden dan monsters van micromanipulation of laser microdissection kan verwerken. In dit protocol gebruiken we een methode op basis van enzymatisch gefragmenteerde DNA als gevolg van een betere prestaties ten opzichte van een warmte-fragmentatie gebaseerd WGA7. Optionele, interne cellen kunnen worden doorgestuurd naar isothermische WGA waardoor latere DNA profielen van20,21.
Het beschreven protocol beoogt intact cellen te kunnen herstellen na zijn vastgemaakt aan een nieuwe generatie van matiemaatschappij draden voor genomic eencellige analyse. De eerste generatie van matiemaatschappij draden, die ook de afdrukapparaten alleen CE-gekeurd in vivo verrijking op de markt tot nu toe, werden gebruikt voor het opsommen van CTCs in patiënten met kanker uitgezaaid. Eerdere publicaties en onze eigen gegevens suggereren de in vivo isolatie techniek om gevoeliger zijn in vergelijking met de huidige goudstandaard technologie2. Dus, om deze in vivo isolatie techniek met een herstelfunctie uit te rusten, zoals gerealiseerd in het apparaat kunt combineren hoge CTC herstel met de karakterisering van het niveau van de eencellige.
Echter, het apparaat niet is uitgeschakeld voor het gebruik bij patiënten, dus geen klinische gegevens beschikbaar zijn. Ex vivo toepassingen (dwz isoleren CTCs uit perifeer bloed na bemonstering) zijn niet aanbevolen omdat de technologie aangepast aan de instellingen aanwezig zijn in de kubusvormige ijdel, bijvoorbeeld lage diameter is van de ijdele (verhogen de kans op direct contact tussen CTCs en antilichamen) en lange retentietijd (30 min, waardoor 2-3 L van bloed geschiedde de draad). Echter, als omschreven in punt 2.2. doelcellen kunnen ook worden geïsoleerd van gemengde monsters7.
Een huidige beperking van de methode is het inefficiënte herstel van losse cellen na detachement van de draden. Dit, echter kan worden verbeterd door een cel fixatie stap voorafgaand aan de behandeling van het detachement.
Kortom is dit protocol een eerste stap naar het gecombineerd gebruik van een in vivo isolatie techniek met terugwinning van de cel voor genetisch karakteriseren van afzonderlijke cellen. Verdere inspanningen moeten aanpakken van de optimalisering van de cel herstel en goedkeuring voor de toepassing ervan in patiënten1,2. Gepersonaliseerde geneeskunde voor monitoring en therapie behandelingsbeslissingen is echter buiten opsomming van CTCs. Deze methode is dus een eerste stap in de richting genomische karakterisering van de CTC op het niveau van één cel.
Toepassingen naar eencellige transcriptome analyse lijken haalbaar als intact cellen worden geoogst. Het blijft echter om te worden beoordeeld of de herstellende procedure heeft een impact op RNA integriteit (bijvoorbeeld doorsturen herstelde afzonderlijke cellen aan directe lysis gevolgd door RT-qPCR22). Als dat lukt, kan karakterisering van afzonderlijke cellen (bijvoorbeeld CTCs) worden verschoven naar het transcriptoom niveau, waardoor meer gedetailleerde analyses. In dit verband, RNA-seq met behulp van Smart-seq2 biedt een waardevol instrument voor RNA downstream analyse van enige cellen preamplified cDNA (verkregen tijdens RNA-seq bibliotheek voorbereiding) kan worden onderworpen aan kwantitatieve PCR. Hierdoor kan een gecombineerde doel en screening gebaseerde analyse van enkele van de teruggekregen cellen22,23.
De huidige functionalized draden zijn gebaseerd op de antilichamen van de anti-EpCAM die is een veel gebruikte epitheliale marker voor positieve selectie van CTCs24. Als verschillende CTCs downregulate epitheliale markeringen zoals Cytokeratines of EpCAM25 kunnen, zou toevoegen van antistoffen zoals HER2/nieuwe de kans verhogen van CTC isolatie. Verschillende antilichaam gebaseerd verrijking strategieën hebben ontwikkeld en herzien door Ferreira et al. in 201626. Een mengsel van antilichamen geïmmobiliseerd op een draad zou een toekomstige verbetering van de technologie die leidt tot de isolatie van een hoger nummer en extra subtypes CTCs.
Het is verplicht voor alle maatregelen waarbij draad omgaan om te houden van het functionele deel van de draad ondergedompeld in oplossing teneinde de functionaliteit. Het is raadzaam om de draad in 1 x PBS tijdens de beoordeling (Microscoop; bv. 3.1 stappen. -3.3.) en opslag. Om te voorkomen dat ongepaste kleuring, is het raadzaam de kleurstofoplossing in stappen 1.2.1 gebruik vers worden bereid. en 1.2.2. Zwak gekleurde cellen belemmeren cel tellen op de draad en kunnen leiden tot de onderschatting van de gekoppelde cellen.
Het is noodzakelijk om te voorkomen dat het inpluggen van de Pipet van Pasteur met de rubberen dop bij invoegen van de draad in de Pipet van Pasteur voor latere laden van de celsuspensie (stap 2.3.4.). De rubberen dop wordt gebruikt om de draad op zijn plaats te houden, zodat het functionele deel binnen het uiteinde van de Pipet van Pasteur ligt. Als het GLB te stevig wordt vastgemaakt aan de achterkant van de Pipet van Pasteur, is laden van de celsuspensie niet mogelijk. In dit geval het GLB te verlichten zodanig zijn dat de lucht die wordt verplaatst door de geladen celsuspensie de pipet laten kunt.
Buigen van de draad is van cruciaal belang voor zijn oriëntatie tijdens de cel tellen in stappen 3.2. en 3.3. Koppel de draden met behulp van het plakband, zodat de niet-functionele uiteinde van de draad komt te liggen aan de ene kant. Na het scannen van de hele lengte van het functionele deel, is de draad 180° gerold zodat de andere helft van de functionele draad kan worden gescand. Deze stap is belangrijk voor de eerste experimenten ter beoordeling van het aantal cellen op de draad. Zodra het aantal cellen voor een bepaalde cellijn en de procedure wordt geëvalueerd, de procedure kan worden herhaald zonder het tellen van de cel (bv. alleen controleren op de aanwezigheid van cellen of weglaten van deze stap). Zorgvuldige pipetteren is cruciaal voor het verlies van de cel kunt voorkomen vermindering van het volume van het supernatans dat in stap 4.8. Zorg ervoor dat soepel zonder turbulenties op de pellet pipetteren gebeurt.

Onlangs, CellCollector DC01, een medische draad matiemaatschappij met anti-EpCAM antilichamen voor het isoleren van CTCs uit perifeer bloed van kankerpatiënten, werd toegevoegd aan het methodisch spectrum van CTC (opsomming)1,2,3 . In een momenteel lopend onderzoek in niet-gemetastaseerd prostaatkanker, deze functionalized draad verslagen bijna tweemaal zoveel patiënten CTC-positief en hogere CTC telt in CTC-positieve patiënten in vergelijking met CellSearch, de gouden standaard in CTC opsomming3 . Wegens deze bemoedigende prestatie, isolatie van cellen uit een functionalized medische draad voor eencellige analyse zou wenselijk zijn, maar enzymatische behandeling met cel detachement oplossingen (bijvoorbeeld trypsine) noch laser microdissection kunt het herstel van de onbeschadigde cellen (gegevens niet worden weergegeven).
Zodat het detachement van de opgenomen cellen, was een nieuwe generatie van matiemaatschappij draden uitgerust met een specifieke polymeer. Dit polymeer, die de antilichamen vastleggen met de draad verbindt, is gevoelig voor een release buffer behandeling waardoor detachement van onbeschadigde cellen (CellCollector DC03 apparaat genoemd). De nieuwe functionalized apparaat, u kunt isolatie van doelcellen van verschillende concentraties van cel kankercellen spiked in bovien serumalbumine (BSA) lijn / fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en perifeer bloed, respectievelijk.
Om te vereenvoudigen de visuele detectie van cellen op het apparaat en na herstel, de kankercellen doel worden geëtiketteerd met carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) en een DNA-vlek vóór de herstellende behandeling (dwz. opladen en loskoppelen). De behandeling van de effecten op DNA kwaliteit van afzonderlijke cellen werden eerder geëvalueerd na WGA door middel van een kwaliteitscontrole PCR4,5, matrix-CGH6,7 en gerichte sequencing7 tonen geen verschil in vergelijking met niet-behandelde cellen micromanipulated van cel schorsingen7. Het voordeel van deze methode ligt in de combinatie van zeldzame doelcel pre verrijking en het herstel van cellen p.a. eencellige stroomafwaarts (Figuur 1). Het huidige CE-geëtiketteerd in vivo collectie apparaat wordt meestal gebruikt voor het opsommen van CTCs in plaats van voor eencellige moleculaire karakterisering2,8. Echter, meer uitgebreide analyse te onderzoeken heterogeniteit onder CTCs lang voor analyse op het niveau van de individuele cel (dat wil zeggen gericht rangschikken op het niveau van eencellige). Andere cel-gebaseerde methoden zijn gebaseerd op isolatie van de immunomagnetic van EpCAM-positieve CTCs en eencellige behandeling op basis van diëlektroforese voor latere moleculaire genetische analyse9,10. Moleculaire karakterisering van CTCs is een belangrijke voorwaarde voor hun nuttige toepassing in een klinische setting, en is net zo belangrijk bij het basisonderzoek van de metastatische cascade. Parallel aan CTCs, is de circulerende tumor DNA (ctDNA) van groot belang geworden aangezien het toestaat DNA-analyse van de last van de tumor met minimale technische isolatie procedures11,12. De cellen gebaseerde benaderingen kunnen dienen als een aanvullende bijdrage omdat het zorgt voor RNA13,14 en eiwitten15 expressie analyse en ook voor de CTC afgeleid cel culturen of xenografts16, 17. Hoewel obstakels zoals lage cel herstel en goedkeuring voor het gebruik bij patiënten nog worden overwonnen moeten, de vangst- en release-methode neemt een belangrijke volgende stap karakterisering van zeldzame doelcellen.

<table><tbody><tr><td>Gilupi Release Buffer</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>Wordt gebruikt om cellen los te maken van de draad</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1x) aangevuld met L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>Kweekmedium gebruikt voor HT-29-cellen, pas kweekmedium aan voor cellijn die gebruikt wordt voor de experimenten</td></tr><tr><td>HEPES-bufferoplossing (1 M)</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>Aanvulling voor McCoy's 5A Medium</td></tr><tr><td>Fetale boviene serum Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Aanvulling voor McCoy's 5a gemodificeerd medium</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (100x)</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>Aanvulling voor McCoy's 5a gemodificeerd medium</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing (1x PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Celdetacheringsoplossing (celcultuur)</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>GFL</td><td>Type 1003</td><td>Wordt gebruikt om oplossingen voor te verwarmen</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Wordt gebruikt om cellen te incuberen (celcultuur)</td></tr><tr><td>50 mL reactiebuisjes</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>Rollermixer</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>Wordt gebruikt om cellen aan de draad te hechten terwijl de cellen niet bezinken</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE celproliferatiekit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Wordt gebruikt om levende cellen te labelen (cytoplasmatisch label)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Wordt gebruikt om DNA te kleuren (nucleaire contrakleur)</td></tr><tr><td>Centrifuge (uitgerust voor het houden van 15 mL en 50 mL reactiebuisjes)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Wordt gebruikt om cellen te pelleten</td></tr><tr><td>Observer Z1 (fluorescentie/laser microdissectiemicroscoop)</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td></td><td>Omgekeerde (immunofluorescence) microscoop die in staat is tot laser microdissectie; Fluorescerende microscopen moeten in staat zijn om Hoechst 33342 (DAPI-filter) en CFSE (FITC-filter) te detecteren</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>Wordt gebruikt voor het coaten van glas-/plasticoppervlakken</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td>Wordt gebruikt voor het vortexen</td></tr><tr><td>Vacutainer EDTA (of Na-heparine) buisjes</td><td>BD</td><td>366450 (of 366480)</td><td>Wordt gebruikt als reactiebuis voor ex vivo opvang van doelcellen</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>Functionele draad die in staat is om EpCAM-positieve cellen te isoleren en los te maken (ook wel catch&amp;release, C&amp;R genoemd)</td></tr><tr><td>Spuitnaalden (G20)</td><td>VWR</td><td>613-0554</td><td>Wordt gebruikt om rubberen doppen te prikken om de niet-functionele deel van de C&amp;R erdoorheen te laten leiden</td></tr><tr><td>Neubauer-kamer</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>Wordt gebruikt om cellen te tellen</td></tr><tr><td>Pasteur pipetten 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Wordt gebruikt voor de toepassing van een klein volume cellen op de C&amp;R</td></tr><tr><td>Vetpen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Wordt gebruikt op glazen platen om cellensuspensie op zijn plaats te houden</td></tr><tr><td>Steriele spuitfilter (0,2 &micro;m)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>Voor het filteren van vers bereide Gilupi Release Buffer</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>Wordt gebruikt voor agitatie tijdens celafscheiding</td></tr><tr><td>1,5 mL buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA Kit</td><td>Silicon Biosystems</td><td></td><td>Te bestellen via Silicon Biosystems</td></tr><tr><td>Axiovert M200 uitgerust met Mikromanipulator MMJ en CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>Gebruik micromanipulatie ter hand</td></tr><tr><td>Microcapillaren (25 &micro;m in diameter), CustomTip Type I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>Wordt gebruikt voor het micromanipuleren van cellen</td></tr><tr><td>0,2 mL PCR-buisjes</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge en apparatuur</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>Gebruik cytocentrifuge ter hand</td></tr><tr><td>Thermo cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>Elke thermo cycler met verwarmd deksel kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>Gebruik tafelcentrifuge ter hand</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>Membran-gecoate glazen platen gebruikt voor laser microdissectie</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Gebruik DNA cross linker ter hand</td></tr><tr><td>Standaard PCR-reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6x DNA Loading</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Gebruik gel loading dye ter hand</td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>Gebruik 100 bp ladder ter hand</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Gel elektroforese station</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Gebruik elektroforese systeem ter hand</td></tr><tr><td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Intercalerende kleurstof voor DNA visualisatie In agarose gels</td></tr></tbody></table>

target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige downstream karakterisering

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Zeldzame doelcellen kunnen worden geïsoleerd uit een hoge achtergrond van doelsoort cellen met behulp van antilichamen specifiek voor oppervlakte proteïnen van de doelcellen. Een onlangs ontwikkelde methode maakt gebruik van een medische draad matiemaatschappij met anti-epitheliale cel adhesie molecuul (EpCAM) antilichamen voor in vivo isolatie van circulerende tumor cellen (CTCs)1. Een patiënt-matched cohort in niet-gemetastaseerde prostaatkanker bleek dat de isolatie in vivo techniek in een hoger percentage van de patiënten positief voor CTCs evenals hogere CTC graven ten opzichte van de huidige gouden standaard in CTC-opsomming resulteerde. Als cellen niet kunnen worden teruggevorderd van de huidige medische hulpmiddelen, werd een nieuwe functionalized draad (hierna: apparaat) vervaardigd waardoor vastleggen en latere detachement van cellen door enzymatische behandeling. Cellen kunnen hechten aan het apparaat, gevisualiseerd op een microscoop en vrijstaand met behulp van enzymatische behandeling. Herstelde cellen zijn cytocentrifuged in membraan beklede dia's en afzonderlijk geoogst door middel van laser microdissection of micromanipulation. Eencellige monsters worden vervolgens onderworpen aan het hele genoom eencellige versterking waardoor meerdere stroomafwaartse analyse, met inbegrip van screening en doelgroepen gerichte benaderingen. De procedure voor isolatie en herstel levert hoge kwaliteit DNA van afzonderlijke cellen en latere hele genoom versterking (WGA) niet wordt aangetast. Een eencellige versterkte DNA kan worden doorgestuurd naar screening en/of gerichte analyse zoals matrix vergelijkende genoom hybridisatie (matrix-CGH) of volgorde. Het apparaat kan ex vivo isolatie van kunstmatige zeldzame celsteekproeven (d.w.z. 500 doelcellen spiked in 5 mL van perifeer bloed). Overwegende dat detachement tarieven van cellen zijn aanvaardbaar (50-90%), de opbrengst van vrijstaande cellen in dia's omvat een breed scala afhankelijk van de cellijn gebruikt (< 10 - > 50%) en sommige verdere aandacht nodig heeft. Dit apparaat is niet uitgeschakeld voor het gebruik bij patiënten.

Cellen na CFSE en stikstofbase kleuring kunnen worden geëvalueerd met behulp van een Microscoop van de immunofluorescentie uitgerust met filters voor DAPI en FITC. Kernen presenteren met een heldere counterstain in de DAPI kanaal terwijl het cytoplasma van de cellen Toon uniforme etikettering met CFSE met heterogene Inter cel intensiteit (figuur 2A en 2E). Soortgelijke vorm en kleuring intensiteiten zijn van cellen die zijn gekoppeld aan de draad (figuur 2B en 2F) verwacht evenals losgekoppeld van de draad en hersteld op een dia (figuur 2D en 2 H).
Hoge cel dichtheden (b.v. > 1 000 000 cellen/mL) kan leiden tot totale dekking van de draad met cellen tijdens het opladen van de draden. Echter lager cel dichtheden, veranderingen in de rotatiesnelheid tijdens de incubatie en het gebruik van verschillende cellijnen invloed op de efficiëntie van isolatie en moeten afzonderlijk worden getest. Wanneer de draden werden geïncubeerd met 5 mL van de HT-29 cellen bij 100 000 cellen / mL als beschreven in punt 2.1., een gemiddelde van 254 ± 103 cellen (n = 5) werden vastgelegd op de draden. Experimenteren met de zelfde LNCaP cuvetten, een gemiddelde van 440 ± 319 cellen (n = 5) per draad was verkregen.
Presentatie van de cellen in de 500, 5 000 en 50 000 de HT-29 op een achtergrond van 5 mL van perifeer bloed aan draden (volgens protocol punt 2.2.) resulteerde in de verovering van 75 ± 18 cellen, 25 ± 9 cellen en 47 ± 57 cellen (n = 3, elk), respectievelijk. Als de draad is belast met 15 µL celsuspensie (1 000 000 cellen/mL) volgens het protocol in punt 2.3., maximaal 1 000 personen (HT-29) cellen kunnen hechten aan een draad.
Cel detachement efficiëntie varieerden van 81% in HT-29 cellen (variëren 54,9% - 93,2%, en n = 5) naar 81% (variëren van 63.51-92.87%, n = 6) en 91% (assortiment 84,7% - 95,3%, n = 6) in LNCaP en VCaP cellen, respectievelijk. Ook het herstel van vrijstaande cellen verschilt tussen cellijnen: een gemiddelde van 28% van de vrijstaande HT-29 cellen werden teruggevonden door cytocentrifugation. Overwegende dat de opbrengst voor LNCaP lager dan 10% was, was de gemiddelde terugvinding voor VCaP cellen 55%.
Ongeveer 75% van de afzonderlijke cellen onderworpen aan producten van de WGA van hoge kwaliteit van de opbrengst van WGA: dit is 1) uitstrijkje van WGA producten variërend van 0.1 tot > 1 kb (Figuur 4, bovenste paneel) en 2) drie of vier bands in de 4plex-kwaliteit controle PCR (Figuur 4, onderste paneel) . WGA producten gebruikt kunnen worden voor 1) matrix-CGH profilering voldoen aan de kwaliteitscriteria voor 6,7 van de profielen van de eencellige matrix-CGH en 2) gerichte NGS na opnieuw versterking WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figuur 1: Workflow bij het opsporen en herstellen van doelcellen eencellige p.a.. (A) cellen worden gekweekt tot 90% confluentie en (B) geoogst om te verkrijgen van een eencellige schorsing. Na kleuring met CFSE en een stikstofbase vlek, (C) de functionalized draad is geïncubeerd in aanwezigheid van de cellen in een volume van 5 mL met behulp van reactie buizen of in een laag volume met behulp van een Pasteur pipette uiteinde. Deze laatste voorziet in toepassing van cel schorsing volumes zo laag als 15 µL. (D) cellen moeten worden losgemaakt binnen 4 uur na het opladen. Dus de draad in een 1,5 mL reactiebuis gevuld met release buffer geplaatst. Na 15 minuten incubatie op een rocker en 10 min centrifugeren, de draad wordt verwijderd en de celsuspensie gecentrifugeerd om de pellet van de cellen. (E) hersteld cellen zijn ofwel overgebracht naar een glasplaatje voor eencellige micromanipulation (boven) of cytocentrifuged op een membraan beklede dia en doorgestuurd om laser microdissection (onder). (F) ten slotte geoogste afzonderlijke cellen worden versterkt door middel van versterking van de hele genoom (WGA). WGA producten zijn compatibel met matrix-CGH en gerichte NGS downstream analyse. EpCAM epitoop: groene cirkel op het celoppervlak. Matiemaatschappij draad: apparaat, grijze triple-helix draden. Polymer: paarse lijnen. Anti-EpCAM antilichamen: oranje. Vrijgeven van buffer activiteit: rode pijl. Vet marker aan celsuspensie op zijn plaats houden: donker blauwe ellips. Celsuspensie hersteld: lichtblauw. Capillaire voor micromanipulation: zwarte lijn. Vergroting: herstelde cel geoogst door micromanipulation, cytospin op het membraan bedekte Schuif met herstelde cellen (grijs opgevulde ovaal). Vergroting: herstelde cel wordt laser microdissected (grijs cirkelvormige lijn: membraan van membraan dia serveren als backbone voor laser microdissection), objectieve met laserstraal (blauwe lijn naderen de membraan dia uit de onderstaande lijst). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figuur 2: visualiseren van gelabelde cellen. (A, E) Cellen voordat het opladen: cellen zijn voorzien van CFSE en counterstained met een DNA intercalating kleurstof toont de signaalsterkte van een bereik van CFSE (groen). (B,F) Gelabelde cellen gevangen op de draad. (C,G) Draad na mobiele-detachement procedure. (D,H) Cellen los van draad en door de cytocentrifugation op een dia hersteld. CFSE: FITC kanaal (groen). DNA vlek: DAPI kanaal (blauw). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figuur 3: draad en opslag compartiment. (A) compartimenten van de draad. (B) Detail van het functionalized deel. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figuur 4: kwaliteitscontrole van WGA producten verkregen uit één micromanipulated cellen. BOVENPANEEL: WGA producten verkregen uit afzonderlijke cellen meestal resultaat in DNA uitstrijkjes variërend van 0.2 kb tot > 1.0 kb met een intensiteit van de piek bij ongeveer 0,5 kb. Monsters nummer 1, 7 en 13 (aangegeven met een sterretje) Toon suboptimaal of geen DNA uitstrijkjes. Onderste paneel: WGA producten van voldoende kwaliteit zijn als de 4plex PCR resulteert in drie of vier van vier PCR producten (op 100, 200, 300 en 400 bp). Monsters 1, 7, 10 en 13 Toon minder dan drie bands en zouden worden uitgesloten van verdere analyse. Lane M bevat een 100 bp ladder en sterretjes geven de monsters van onvoldoende kwaliteit van de producten van de WGA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer volgorde</td>
			<td>OPMERKING</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 '</td>
			<td>100 bp voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 '</td>
			<td>100 bp omgekeerde primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tgg agc gag gct agc-3 '</td>
			<td>200 bp voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 '</td>
			<td>200 bp omgekeerde primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3 '</td>
			<td>300 bp voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-tcc wet aac cag tca gcg tc-3 '</td>
			<td>300 bp omgekeerde primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc kat gcc atc handelen gc-3 '</td>
			<td>400 bp voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gct tga caa agt ggt cgt GS-3 '</td>
			<td>400 bp omgekeerde primer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primer sequenties voor de controle van de kwaliteit van de 4plex PCR

Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Het algemene doel van deze procedure is om cellen te isoleren uit een celsuspensie om ze beschikbaar te maken voor downstream-analyse op enkelcelniveau. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in de context van vloeibare biopsieën en cellulaire heterogeniteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het antilichaam-gebaseerde isolatie van enkele cellen mogelijk maakt en hun herstel voor latere moleculair-genetische analyse op enkelcelniveau.Zodra het is goedgekeurd voor gebruik bij patiënten, zal deze techniek de karakterisering van circulerende tumorcellen bij kankerpatiënten mogelijk maken. Omdat deze methode inzicht kan geven in de heterogeniteit tussen enkele cellen, kan het worden toegepast op alle soorten celsuspensies die subpopulaties bevatten, zoals bloedmonsters, monsters uit celculturen of gedissocieerde weefsels en organen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we een in vivo verrijkingsapparaat gebruikten dat niet in staat was cellen vrij te geven voor downstream-analyse.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor het oogsten van enkele cellen met behulp van laser microdissectie of micromanipulatie moeilijk succesvol uit te voeren zijn, omdat het proces van het oogsten van enkele cellen gevoelig is voor celverlies en een hoge mate van expertise vereist. Resuspendeer de HT-29 CFSE-gelabelde cellen in één milliliter voorverwarmd celkweekmedium en laat ze 30 minuten regenereren bij 37 graden Celsius. Om de cellen te oogsten, centrifugeer bij 300 g gedurende drie minuten.Resuspendeer vervolgens het cellenpellet in één milliliter gebruiksklare Hoechst 33342 DNA-kleuringsoplossing bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 300 g gedurende drie minuten. Gooi vervolgens het supernatant weg en resuspendeer het cellenpellet in vier milliliter 1X fosfaatgebufferd zoutwater.Tel vervolgens het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en controleer op fluorescentiemarkering met een fluorescentiemicroscoop. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 300 g gedurende drie minuten, gooi het supernatant weg en resuspendeer het pellet op ongeveer 500.000 cellen per milliliter en plaats de cellen op ijs. Voeg in vijf milliliter perifeer bloed ongeveer 500 tot 500.000 cellen toe en meng door de buis te keren.Nadat het staal is verwijderd uit het opslagcompartiment, verwijdert u de rubberen dop die het staal vasthoudt en was het staal in 1X fosfaatgebufferd zoutwater en monteer het in de dop van de buis. Incubeer vervolgens de buis op een schuine rolmixer met vijf rotaties per minuut gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Na incubatie, spoel het staal driemaal af in 1X fosfaatgebufferd zoutwater.Bewaar vervolgens het staal in een 15-milliliterbuis met 1X fosfaatgebufferd zoutwater in het donker. Teken een rechthoekig gebied op een glasplaat met een vetpen, voeg vervolgens 500 microliter 1X fosfaatgebufferd zoutwater toe. Om het functionele deel van het staal in 1X fosfaatgebufferd zoutwater te dompelen, buig het niet-functionele deel van het staal en plaats het op de glasplaat.Om het aantal gevangen cellen te tellen, inspecteert u beide zijden van het staal visueel. Na inspectie, brengt u het staal terug in de 15-milliliterbuis met 1X fosfaatgebufferd zoutwater en bewaart u het in het donker. Los vier milligram van de releasebuffercomponent op in één milliliter 1X fosfaatgebufferd zoutwater, filter vervolgens de oplossing door een 0,2 micrometer steriele filter om de gebruiksklare buffer te verkrijgen.Verwarm vervolgens de releasebuffer gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Zodra het is verwarmd, brengt u 1,6 milliliter releasebuffer over om een 1,5-milliliter reactiebuis volledig te vullen. Incubeer vervolgens het functionele deel van het staal in de releasebuffer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius in een waterbad.Na de incubatie, plaatst u het staal gedurende 15 minuten op een shaker bij 500 rotaties per minuut. Centrifugeer vervolgens het staal bij 300 g gedurende 10 minuten. Zodra de centrifugatie voorbij is, verplaatst u het staal uit de buis, sluit de dop en centrifugeert u de buis opnieuw bij 300 g gedurende 10 minuten.Om het volume celsuspensie te verminderen, gooit u alles weg behalve 100 microliter supernatant voor micromanipulatie of 300 microliter voor latere cytocentrifugatie en laser microdissectie. Ga vervolgens snel door naar enkele celbemonstering. Voor micromanipulatie, brengt u de volledige 100 microliter celsuspensie over op een glasplaat.Plaats vervolgens de glasplaat op een microscoop uitgerust met een micromanipulator en laat de cellen vijf minuten bezinken. Pipetteer vervolgens twee microliter cel lysis master mix in 0,2-milliliter PCR-buisjes en breng het over op ijs. Gebruik de micromanipulator om een enkele cel te verzamelen in één microliter 1X fosfaatgebufferd zoutwater.Breng vervolgens de cel direct over in twee microliter cel lysis master mix. Gebruik een desktop microfuge om de monsters snel naar beneden te centrifugeren bij 2.000 g gedurende drie seconden om de vloeistof aan de onderkant van het buisje te verzamelen. Breng vervolgens het monster over op ijs en ga door naar adapter-linker gebaseerde volledige genoomversterking.Zuig slechts één cel aan met één microliter buffer op zijn maximum. Zorg ervoor dat u bellen ziet ontstaan uit de oplossing wanneer u de cel overbrengt naar de lyse-oplossing, wat aangeeft dat al het aangezogen volume is overgebracht. Voor laser microdissectie, cytocentrifugeer de volledige 300 microliter celsuspensie op een membraan-gecoate schuif bij 300 g gedurende vijf minuten.Plaats vervolgens de membraan-gecoate schuif op een microscoop die laser microdissectie mogelijk maakt. Pipetteer vervolgens 4,5 microliter cel lysis master mix in de dop van de 0,2-milliliter PCR-buis. Plaats de dop boven het monster en oogst een enkele

target-cell-pre-enrichment-whole-genome-amplification-for-single-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

This video describes the technique for isolating single cells from a pool of target cells to carry out downstream analysis. In this method, a micromanipulator fitted to a microscope is used for high-precision isolation of a single target cell.

Single Cell Sampling Using Micromanipulation: A Technique to Isolate Single Cells from Cancer Cell Suspension

This video describes the technique for obtaining a single cell from a heterogeneous cell population using laser capture microdissection. The single isolated cell can be used for further genomic studies or cancer research.

Single Cell Sampling Using Laser Capture Microdissection: A Technique to Harvest Target Cells from a Heterogeneous Cell Population

Dit protocol beschrijft hoe de expressie van een groot scala van genen op het klonale niveau te beoordelen. Single-cell RT-qPCR levert zeer betrouwbare resultaten met een sterke gevoeligheid voor honderden monsters en genen.

Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Enkele cel sequencing is een steeds populairder en toegankelijk instrument voor de aanpak van genomische veranderingen op hoge resolutie. Wij bieden een protocol dat enkele cel sequencing gebruikt om het aantal kopieën veranderingen te identificeren in enkele cellen.

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Een eenvoudige maar effectieve methode die magnetische nanodeeltjes in dienst aan antigeen-reactieve B-cellen voor functionele en fenotypische analyse op te sporen en te verrijken wordt beschreven.

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Hier presenteren we een cel dissociatie protocol voor het efficiënt isoleren van cellen aanwezig bij lage overvloed binnen het visuele systeem van Drosophila door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS).

Zuivering van Low-overvloedig cellen in het visuele systeem van Drosophila

Hier presenteren we een geïntegreerde workflow om fenotypische en moleculaire kenmerken te identificeren die circulerende tumorcellen (CTCs) karakteriseren. Wij combineren levende immunokleuring en robotachtige micromanipulatie van enige en geclusterde CTCs met enige cel-gebaseerde technieken voor stroomafwaartse analyse en beoordeling van metastasen-zaait capaciteit.

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Het huidige protocol beschrijft een eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met behulp van een herbruikbare enkele cel. De herbruikbare enkele cel maakt analyses van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel en statistische validatie van de resultaten mogelijk.

Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

Leer het isoleren van zeldzame doelcellen uit bloed voor moleculaire analyse op enkelcellig niveau. Deze methode maakt karakterisering van circulerende tumorcellen mogelijk voor kankeronderzoek.

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Meer video's verkennen