Name: Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Leer een gebonden shRNA-schermmethode om regulatoren van X-chromosoom-inactivering te identificeren in muizenfibroblasten. Dit protocol combineert next generation sequencing met MeCP2-reportergenen voor genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Ross Dickins van de Universiteit van Melbourne genadig voorzien van de bibliotheek van de shRNA gebruikt in het scherm. Dit werk werd gefinancierd door de Rett syndroom onderzoek vertrouwen (A.B.).

Alle stappen waarbij dieren werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door het Fred Hutchinson Cancer Research Center institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Geen hier gebruikte reagentia is bekend dat de gezondheid van de mens van de aanzienlijke risico's met uitzondering van 5-azacytidine (5-AZA).
1. het genereren van een verslaggever cellijn met MeCP2- LUC-HR transgenic op de Xi
<ol><li>
Voorbereiding van muis pees fibroblasten uit een vrouwelijk XMeCP2-LUC-HR /XMeCP2 muis
	<ol>
<li>Een 10-12-daagse euthanaseren-oude vrouw XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2 muis.</li>
		<li>Met behulp van rechte dissectie schaar, maken een ze incisie via de huid van het gedeelte van de proximale staart.</li>
		<li>Houd de karkas in de buurt van de onderkant van de staart en trek de huid uit de buurt van de muis om het fibrocartilaginous gedeelte van de staart bloot te stellen. Verwijderen en snijd de terminal 10 mm van de blootgestelde weefsel in 1 mm lange fragmenten met een chirurgische scalpel.</li>
		<li>Overdracht de gefragmenteerde weefsel een conische 15 ml tube met 5 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 1 U/mL penicilline, 1 µg/mL streptomycine, en 1,5 mg/mL collagenase, vooraf gefilterd door 0,45 µm en dan 0,2 µm mesh filters. Incubeer gedurende 3-4 uur bij 37 ° C met continue rotatie.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij kamertemperatuur op 500 x g gedurende 10 min. resuspendeer de pellet in 10 mL DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum, 1 U/mL penicilline, en 1 µg/mL streptomycine (DMEM-10) en plaat op een 6-well weefselkweek plaat. Eenmaal passage van de cellen en uit te breiden naar een 10 cm plaat voordat u verdergaat met de volgende stap.</li>
		<li>De cellen door het uitvoeren van een transductie met een expressie vector uitvoering van HPV-16 virale oncogenen (E6/E7), zoals eerder beschreven7vereeuwigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selecteren van eencellige klonen en karakteriseren van MeCP2 verslaggever expressie
	<ol>
<li>Het oogsten van de cellen van een 10 cm plaat. Eerst, gecombineerd de media, voeg 1 mL trypsine-EDTA 0,05% en incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Doven met 9 mL van DMEM-10 en het verzamelen van de geresuspendeerde cellen in een conische tube van 15 mL.</li>
		<li>Verdun de cellen met de DMEM-10 tot en met een eindconcentratie van 1 cel/100 µL. overbrengen naar 96-wells-platen door pipetting 100 µL van de schorsing in elk putje.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C totdat de putten zijn heuvels, die tot 2-3 weken kan duren. Vervang de media met verse DMEM-10 elke 3-5 dagen. Wanneer confluente, mobiliseren de cellen met 20 µL van 0,05% trypsine-EDTA per putje en gesplitst in twee dubbele sets van 96-wells-platen.</li>
		<li>Één set platen gebruikt voor de gehaltebepaling voor luciferase activiteit. Gebruik een homogene firefly luciferase assay kit die geen media verwijderen vereist. Volg het protocol die bij de kit geleverd.</li>
		<li>De resultaten van stap 1.2.4 klonen met geen detecteerbare luciferase activiteit selecteren in het resterende aantal platen gebruiken. Vouw deze klonen tot 24-well en vervolgens 6-well platen.</li>
		<li>Voer hetzelfde uit voor een kloon met de hoogste luciferase activiteit; Dit zal als positieve controle worden gebruikt voor validatie doeleinden.</li>
		<li>Oogst een aliquoot gedeelte van elk putje in de 6-well plaat voor een westelijke vlek. Het mobiliseren van de cellen met 200 µL van 0,05% trypsine-EDTA. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Doven met 2 mL DMEM-10, en de helft van de cellen naar 1,5 ml centrifugebuis. Het wassen van de cellen een keer met PBS voor lysing voor westelijke vlek. U kunt ook overbrengen in de helft van de cellen een ander 6-well plaat. Wanneer de cellen aan de onderkant van de plaat koppelt, spoelen met PBS en lyse voor westelijke vlek.</li>
		<li>Uitvoeren van een Western blot met anti-MeCP2 antilichaam om te bevestigen dat luciferase-negatieve cellen uitspreken, terwijl de luciferase-positieve cellen doen niet express wild-type MeCP2 uit het active X-chromosoom; Volg de eerder beschreven protocol8. Hersenweefsel lysate uit een wild type muis gebruiken als positieve controle.</li>
		<li>Verschillende negatieve klonen bij 2 x 10,5 cellen/well in een 6-well plaat plaat. Een keer behandelen met 10 µM 5-AZA, Incubeer gedurende 72 uur zonder de media en assay voor luciferase activiteit, zoals beschreven in stap 1.2.3.</li>
		<li>Kies een negatieve kloon (Xi kloon) dat luciferase activiteit met 5-AZA opgedaan en beginnen met het uit te breiden naar meerdere 10 cm platen. Het bevriezen van de resterende negatieve klonen in vloeibare stikstof als een back-up. De positieve kloon (Xa kloon) kan worden gehandhaafd in de weefselkweek of bevroren tot verder gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de screening van de bibliotheek voor het opnieuw activeren met behulp van hygromycin B selectie
<ol><li>
De test kloon infecteren, selectie toepassen en oogsten van DNA voor het rangschikken
	<ol>
<li>Verkrijgen van virale concentraten van retrovirale constructies uiten haarspelden uit een mediawisselaar shRNA of produceren van geconcentreerde virale bovendrijvende vloeistof via het protocol opgenomen met de gewenste bibliotheek.</li>
		<li>Titreer voordat u verdergaat met het scherm, de bibliotheek (met behulp van een GFP-marker, indien beschikbaar). Streven naar een veelheid aan infectie tussen 0,3 en 0,5. Opmerking: Voer ten minste vier onafhankelijke schermen om te minimaliseren van valse positieve tarieven. 20 platen per scherm te verkrijgen 100-fold dekking van de bibliotheek te handhaven adequate vertegenwoordiging van haarspelden en vermijden van willekeurige dropouts9gebruiken. Echter, gezien de positieve selectiescherm en de grootte van een grote bibliotheek, het is waarschijnlijk dat een lagere dekking zou volstaan.</li>
		<li>Plaat in de ochtend, 1 x 106 Xi cellen op 10 cm weefselkweek platen.</li>
		<li>In de namiddag, infecteren de platen door vervanging van de media met verse DMEM-10 met virale supernatant en 5-10 µg/mL polybrene. Gebruik maken van de hoeveelheid virale supernatant in stap 2.1.2 vastgesteld.</li>
		<li>Na 18-24 h, de media gecombineerd en voeg 10 mL van de verse DMEM-10 aan elke plaat. Cultuur voor een ander 48u.</li>
		<li>In de ochtend, de cellen 1 mL 0,05% trypsine-EDTA per plaat met mobiliseren en doven met 9 DMEM-10 mL per plaat. De schorsing doorlopen een 100 µm mesh filter. De gefilterde schorsingen samen bundelen en zaad van twee sets van 10 cm platen op 1 x 106 cellen/plaat.</li>
		<li>In de namiddag, door de media in één set platen te vervangen door DMEM-10 met 15 µg/mL van hygromycin B (dag 0). In de andere reeks, door de media te vervangen door verse DMEM-10 alleen.</li>
		<li>Na 48 uur, mobiliseren de cellen van onbehandelde aantal platen met behulp van 1 ml trypsine-EDTA 0,05%. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Doven met 9 mL van DMEM-10. Overbrengen in de cellen 15 ml conische buizen en centrifuge op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Het supernatant gecombineerd en meteen doorgaan met de extractie van DNA van de pellets. Anderzijds bundelen de cellen in de grotere buizen voor de stap van centrifugeren.</li>
		<li>Pak van DNA met behulp van een mengsel van fenol en chroroform en neerslag van DNA met natrium acetaat en koude ethanol als eerder beschreven10. Zwembad de individuele voorselectie DNA-monsters en bewaren bij-20 ° C tot verder gebruik.</li>
		<li>Blijven hygromycin B selectie instellen voor 4 meer dagen te kweken. Aanvullen van de media van de selectie met verse DMEM-10 met hygromycin B na 2 dagen.</li>
		<li>Op dag 7, door de media van de selectie te vervangen door verse DMEM-10 alleen. Toestaan van 2 tot 4 dagen voor herstel, en vervolgens het oogsten van de cellen zoals beschreven in stap 2.1.8. Ga verder met DNA-extractie, zoals beschreven in stap 2.1.9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Identificeren van haarspelden verrijkt in de monsters na selectie
	<ol>
<li>Gebruik 5' context (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') en 3' reverse lus inleidingen (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') aan het versterken van de half-haarspelden van pre- en post selectie DNA-monsters. Gebruik alle geëxtraheerd DNA in aparte PCR reacties met 100-200 ng van DNA per reactie. Opmerking: Deze context primer 5' en 3' omgekeerde lus inleidingen komen overeen met de miR-30 kader volgorde stroomopwaarts van het donormateriaal shRNA en de volgorde bij de shRNA lus, respectievelijk. Verschillende bibliotheken zal vereisen verschillende oligos. Zuivering stappen om te isoleren van verschillende product maten zo nodig aanpassen.</li>
		<li>Gebruik grootte-selectie kralen primers en genomic DNA verwijderen en herstellen van PCR producten tussen 100 en 200 bp. Volg het protocol opgenomen met de kralen.</li>
		<li>Bereiden een sequencing bibliotheek aan het volgnummer van de half-haarspelden. Minstens 50 miljoen leest per scherm genereren. Volg het protocol geschikt voor de sequencing kit en apparatuur. Opmerking: 50 miljoen leest per scherm biedt 1000-fold vertegenwoordiging van elke shRNA in de bibliotheek en ongeveer 10-fold dekking van elke onafhankelijke infectie (uitgevoerd bij 100-fold vertegenwoordiging van elke shRNA), die zorgt voor een adequate vertegenwoordiging van elk evenement van de infectie.</li>
		<li>Het opsommen van elke shRNA met behulp van een perlmanuscript dat sequenties met perfecte matches telt. Koos voor shRNAs die ten minste 10 leest had in de preselectie pool voor verdere analyse. Bereken de verrijking en ratio's van post naar preselectie telt valse ontdekking tarief (FDR) bepalen op basis van 1000 permutaties. Koos van genen gericht door shRNAs met < 5% FDR als "hits" voor verder onderzoek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. het valideren van de geïdentificeerde haarspelden ("hits")
<ol><li>
Verpakking lentivirussen met shRNAs geïdentificeerd in het scherm
	<ol>
<li>Zaad 8 x 106 293 FT cellen per plaat op 10 cm platen.</li>
		<li>De volgende dag, vervangen de media met 9 mL antibioticum-gratis DMEM-10 per plaat; deze 30 minuten vóór de Transfectie te doen.</li>
		<li>Tijdens het interval van 30 minuten, twee mixen voor Transfectie te bereiden:<ol>
<li>Voorbereiden Meng 1 (per plaat/shRNA; opschalen volgens het totaal aantal shRNAs): 10 µL van 2 mg/mL polyethylenimine (PEI) in 0,5 mL van optimale minimale essentiële media. Meng door pipetteren en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
			<li>Mix 2 (per shRNA) bereiden: 4 µg van de vector shRNA worden verpakt, 1,5 µg van de vector envelop VSV-G (pMD2.G) en de verpakking vector (psPAX2), 2,5 µg gemengd in 0,5 mL van optimale minimale essentiële media. Opmerking: Een lege lentivirale vector in de verpakking te gebruiken in latere infecties als een negatieve controle opnemen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voeg 0,5 mL voor mix 1 aan elk aliquot van mix 2, en meng zachtjes door pipetteren. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.</li>
		<li>Breng het mengsel op elk bord uit stap 3.1.2 op een dropwise wijze; Swirl de plaat voorzichtig te mengen.</li>
		<li>De volgende dag, vervangen de media met 5 mL van de verse DMEM-10.</li>
		<li>48 uur na eerste transfectie, verzamelen het supernatant en voer het uit door een 0,22 µm filter. Vooraf nat het filter met DMEM-10 tot herstel te maximaliseren.</li>
		<li>Aliquot het gefilterde supernatant in bedragen ideaal voor het infecteren van een plaat van 6-well goed.</li>
		<li>Bevriezen van de aliquots bij-80 ° C voor later gebruik, of gaan onmiddellijk met transductie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transductie en testen van individuele haarspelden voor luciferase verslaggever reactivering en reactivering van wild-type MeCP2 gen op de Xi.
	<ol>
<li>Plaat in de ochtend, 1 x 105 Xi cellen per putje op 6 goed platen.</li>
		<li>In de namiddag, infecteren de platen door de media te vervangen door 2 mL verse DMEM-10 met lentivirale supernatant en 5-10 µg/mL polybrene. Infecteren een besturingselement goed met virale bovendrijvende vloeistof geproduceerd uit een lege lentivirale vector.</li>
		<li>De volgende dag, vervangen de media met 2 mL DMEM-10 bevat 1 mg/mL puromycin. Cultuur voor vier dagen.</li>
		<li>De media te vervangen door 2 mL verse DMEM-10 en toestaan van 48-72 uur voor herstel.</li>
		<li>Het mobiliseren van de cellen met 150 µL van 0,05% trypsine-EDTA. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Doven met 1,5 mL van DMEM-10. Overbrengen in de cellen 15 ml conische buizen en centrifuge op 500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het medium en resuspendeer de cellen in 100 µL lysis-buffermengsel waarin de luciferase assay kit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. De lysates overbrengen in een witte 96-wells-plaat en assay voor luciferase activiteit met behulp van het protocol die bij de kit geleverd. Xa cellen worden gebruikt als positieve controle en Xi-cellen geïnfecteerd met een lege lentivirale vector als een negatieve controle. Opmerking: Vermijd blootstelling van de witte platen te kunstlicht vóór de bepaling; Dit vermindert de achtergrond en verhogen van de gevoeligheid van de test. Het protocol waarin de assay kit bleek te zijn meest effectieve als uitgevoerd in het donker mogelijk.</li>
		<li>Om te bepalen of de haarspeld een effect gehad op het niveau van de expressie van MeCP2 op het actieve x-chromosoom, RNA van tranduced Xi cellen isoleren en MeCP2 mRNA meten met behulp van kwantitatieve PCR met inleidingen ter versterken alleen wild type MeCP2 (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').</li>
		<li>
Optioneel: Het verhogen van de gevoeligheid van de test door 5-AZA toe te voegen aan een definitieve concentratie van 0,2 µM, nadat de cellen van puromycin selectie zijn hersteld. Cultuur van de cellen gedurende 72 uur zonder vervanging van de media, en vervolgens assay voor luciferase activiteit met behulp van de commerciële luciferase assay kit.</li>
		<li>Reactivering van het zwijgen wild-type MeCP2 meten. Xa-cellen, die het wild type MeCP2 op de Xi, met de vector met individuele haarspelden haven, als volgt het protocol 3.2.1 infecteren. -3.2.4. RNA van cellen isoleren en MeCP2 mRNA meten met behulp van kwantitatieve PCR met inleidingen ter versterken alleen wild type MeCP2 (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nat Genet. 23, 185-188 (1999).</li>
<li>Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+neurological+defects+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome.</a> Science. 315, 1143-1147 (2007).</li>
<li>Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+the+Puzzle+Pieces%3A+the+Bigger+Picture+of+XCI%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI.</a> Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).</li>
<li>Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+of+the+sex+chromosomes+and+autosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes.</a> Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+microglia+do+not+reverse+pathology+in+mouse+models+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome.</a> Nature. 521, E1-E4 (2015).</li>
<li>Sripathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screen+for+reactivation+of+MeCP2+on+the+inactive+X+chromosome+identifies+the+BMP%2FTGF-beta+superfamily+as+a+regulator+of+XIST+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).</li>
<li>Foster, S. A., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+type+16+E7+alleviates+a+proliferation+block+in+early+passage+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells.</a> Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26160567">The Western Blot.</a> Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Strezoska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+PCR+conditions+and+increased+shRNA+fold+representation+improve+reproducibility+of+pooled+shRNA+screens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens.</a> PLoS One. 7, e42341(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High-Molecular-Weight+DNA+from+Mammalian+Tissues+Using+Proteinase+K+and+Phenol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).</li>
<li>Goto, Y., Takagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+embryos+rescue+embryonic+lethality+caused+by+an+additional+maternally+inherited+X+chromosome+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse.</a> Development. 125, 3353-3363 (1998).</li>
<li>Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+Xist+RNA%2C+DNA+methylation%2C+and+histone+hypoacetylation+in+maintaining+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation.</a> J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349, (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521, 232-236 (2015).</li>
<li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mbd1-Atf7ip-Setdb1+pathway+contributes+to+the+maintenance+of+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation.</a> Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+of+inactive+X+chromosome+reactivation+identifies+the+enhancement+of+DNA+demethylation+by+5-aza-2%27-dC+upon+inhibition+of+ribonucleotide+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).</li>
</ol>

Dr. Leko droegen tot dit artikel als een medewerker van het Fred Hutchinson Cancer Research Center.  De standpunten zijn van zijn eigen en niet noodzakelijkerwijs de visie van de National Institutes of Health of de regering van de Verenigde Staten

In onze recente studie6, we genereerden een lymfkliertest cellijn met luciferase en hygromycin resistentiegenen gesmolten tot MeCP2 op de Xi, en het transduced met een bibliotheek van > 60.000 shRNAs targeting > 25.000 genen. We vonden 30 genen waarvan knock-down toegekende overleving voordeel onder hygromycin B selectie suggereren hun rol in de controle van het MeCP2 en het x-chromosoom zwijgen. Deze resultaten werden gevalideerd door het transducing van de gerapporteerde cellij...

Één de meest voorkomende vormen van erfelijke geestelijke stoornis bij vrouwtjes, Rett syndroom, wordt veroorzaakt door heterozygoot mutaties in MeCP2, een x-chromosoom-gen dat codeert voor een eiwit dat essentieel is voor de normale functie van de neuronale1. Een mogelijke aanpak voor de behandeling van deze aandoening zou reactivering van het wild-type MeCP2 -allel op de Xi, zoals herstel van MeCP2 expressie bleek te keren neurologische tekorten in een muismodel van deze ziekte1, 2 , 4. echter strak epigenetische monddood maken van één van de twee X chromosomen in vrouwelijke cellen wordt gehandhaafd gedurende de levensduur van een organisme3,4, en robuuste reactivering van een Xi-gen zou waarschijnlijk vereisen een grote verstoring in meerdere epigenetische regelgevende trajecten.
Om te identificeren factoren nodig zijn voor onderhoud MeCP2 monddood maken, ontwikkelden we eerst een transgeen muismodel uitvoering een MeCP2- luciferase - hygromycin weerstand gene fusion (MeCP2-LUC-HR) op één van de twee X chromosomen (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Hoewel het MeCP2 uitgedrukt uit de fusion-constructie bleek instabiel en resulteerde in een verlies van functie, fenotypische nabootsen MeCP2 schrapping in hemizygous mannen (XMeCP2-LUC-HR/Y), de uitdrukking van de genen van de verslaggever was in een patroon overeen met de uitdrukking van endogene MeCP25gemakkelijk worden opgespoord. Wij vervolgens gegenereerd vereeuwigd fibroblast klonen met de constructie op actieve of inactieve x-chromosoom, en bevestigd dat voormalig uitgedrukt wild type MeCP2 en niet de verslaggever constructie; de inverse Gold voor de laatstgenoemde. Wanneer blootgesteld aan een DNA demethylating agent bekend te trekken gene silencing, 5-azacytidine (5-AZA), de cellen met de verslaggever op de Xi ("verslaggever cellen") activiteit in een bioluminescentie assay, die aangeeft dat onze constructie kan worden gereactiveerd opgedaan en daarom gebruikt voor genetische screening.
Volgende ontwikkelden we een scherm high-throughput genetische voor regelgevers MeCP2 monddood maken. De verslaggever-cellijn werd eerst besmet met een retrovirale bibliotheek met > 60.000 verschillende shRNAs targeting > 25.000 genen in de muis genoom5,6, en vervolgens onderworpen aan hygromycin B selectie. Haarspeld frequentie bedroeg vergeleken in pre en post selectie monsters met behulp van de volgende generatie sequencing, als verslaggever reactivering verleende groei voordeel onder hygromycin B-selectie en resulteerde in de verrijking van verantwoordelijk haarspelden. Met behulp van deze aanpak, we geïdentificeerd 30 genen betrokken bij MeCP2 monddood maken, en vervolgens de bevindingen bevestigd door transducing de verslaggever cellen met individuele haarspelden en het meten van hun luciferase activiteit.

<table><tbody><tr><td>293FT Cell Line</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>5-Azacytidine</td><td>Sigma</td><td>A2385-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MECP2 antibody</td><td>Millipore</td><td>07-013</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C2674-1G</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-336</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV)</td><td>Open Biosystems</td><td>EAV4679</td><td></td></tr><tr><td>Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library</td><td>Open Biosystems</td><td>RMM3796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisherbrand</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash;401&ndash;2501</td><td>Of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Calbiochem</td><td>400051-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>Homogeen Assay voor Screening Kolonies</td></tr><tr><td>Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Niet-Homogeen Assay voor Testen Individuele Haarspeldjes</td></tr><tr><td>Luminometer TopCount NXT</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>Of soortgelijke luminometer</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2001</td><td>Gebruik kit compatibel met uw apparatuur</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>VSV-G envelop vector</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td>Packaging vector</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), fenolrood</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

gebundelde shrna scherm voor de heractivering van het mecp2 op het inactieve x-chromosoom

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Voorwaartse genetische schermen met behulp van verslaggever genen ingevoegd in de heterochromatin zijn uitgebreid gebruikt om de mechanismen voor controle van de epigenetische in modelorganismen onderzoeken. Technologieën met inbegrip van korte haarspeld RNAs (shRNAs) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) hebt ingeschakeld op dergelijke schermen in diploïde cellen van zoogdieren. Hier beschrijven we een grootschalige shRNA scherm voor regelgevers van x-chromosoom inactivering (XCI), met behulp van een lymfkliertest cellijn met firefly luciferase en hygromycin resistentiegenen klopte in het C-terminus van de methyl CpG bindend-proteïne 2 (MeCP2) gen op het inactieve x-chromosoom (Xi). Reactivering van de constructie in de verslaggever cellijn verleende overleving voordeel onder hygromycin B selectie, waarmee we een grote shRNA bibliotheek scherm en identificeren van haarspelden dat gereactiveerd de verslaggever door te meten met behulp van hun na selectie verrijking volgende-generatie sequencing. De verrijkte haarspelden werden vervolgens individueel gevalideerd door het testen van hun vermogen om het activeren van de luciferase verslaggever op Xi.

Muis pees fibroblasten zijn geoogst uit een eerder beschreven XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2 vrouwelijke muis, vereeuwigd door retrovirale transductie van E6 en E7 oncogenen van HPV-16 virus7, gekloond beperkende verdunning wordt toegepast en getest voor Luciferase activiteit en expressie van wild-type MeCP2 eiwit (figuur 1A en 1B). Luciferase activiteit was robuust als de verslaggever op Xa was, en kan niet worden getraceerd als op Xi; de inheemse MeCP2 expressi...

Wij rapporteren een kleine haarspeld RNA (shRNA) en de volgende generatie sequencing-gebaseerd protocol voor het identificeren van de regelgevers van de inactivering van het x-chromosoom in een lymfkliertest cellijn met firefly luciferase en hygromycin resistentiegenen gesmolten aan de methyl CpG bindende eiwit 2) MeCP2) gen op het X-chromosoom inactief.

Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Begin deze procedure met de voorbereiding van muispeesfibroblasten, zoals beschreven in het tekstprotocol. Haal de cellen uit een 10-centimeter plaat door eerst het medium af te zuigen. Voeg vervolgens één milliliter 0,05% trypsin EDTA toe en incubeer gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius.Na incubatie, blus de trypsin met negen milliliter DMEM-10 en verzamel de gesuspendeerde cellen in een 15-milliliter conische buis. Verdun de cellen met DMEM-10 tot een eindconcentratie van één cel per 100 microliters. Breng vervolgens de cellen over naar 96-well platen door 100 microliter van de suspensie in elke well te pipetten.Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius tot de wells confluëren, wat twee tot drie weken kan duren. Ververs het medium elke drie tot vijf dagen met vers DMEM-10. Wanneer confluërend, mobiliseer de cellen met 20 microliter 0,05% trypsin EDTA per well en verdeel ze in twee dubbele sets van 96-well platen.Test op luciferase-activiteit in één set platen. Gebruik een homogene Firefly luciferase-test die geen verwijdering van het medium vereist, volgens het protocol dat bij de luciferase-testkit is inbegrepen. Gebruik de testresultaten om klonen met geen detec

pooled-shrna-screen-for-reactivation-mecp2-on-inactive-x

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier gebruiken we een menselijke LentiPlex samengevoegde bibliotheek en traditionele sequencing methoden om gen-doelstellingen het bevorderen van overleving van de cel te identificeren. Laten we zien hoe op te zetten en deconvolute een LentiPlex scherm en valideren van de resultaten.

MISSIE LentiPlex Gepoolde shRNA Library Screening in zoogdiercellen

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het identificeren van homologe recombinatie gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern blotting en/of PCR. Deze methode wordt geïllustreerd door de generatie van nonmuscle myosin II genetische vervanging Muismodellen met behulp van traditionele embryonale stamcel gebaseerde homologe recombinatie-gemedieerde targeting technologie.

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een levensvatbare vrouwelijke muizenmodel met niet-Random X-chromosoom inactivatie, dat wil zeggen, de moederlijke erfelijke X-chromosoom is inactief in 100% van de cellen. We beschrijven ook een protocol om de haalbaarheid, tolerantie, en de veiligheid van farmacologische reactivering van het inactieve X-chromosoom in vivo te testen.

Een niet-willekeurig muis model voor farmacologische reactivering van Mecp2 op het inactieve X-chromosoom

Een nauwkeurige en robuuste polymerase kettinggebaseerde assay test voor het kwantificeren van Cytosine-guanine-guanine trinucleotide herhalingen in het fragiele X mentale retardatie-1 gen vergemakkelijkt de moleculaire diagnose en screening van fragiel X-syndroom en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met kortere turn-around tijd en investering in apparatuur.

Een robuuste polymerase kettingreactie op basis van Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide herhalingen in fragiele X mentale retardatie-1 gen

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

Technieken voor het genereren van een bibliotheek van korte peptiden die mestcellen kunnen activeren via de MRGPRX2-receptor worden beschreven. Bijbehorende technieken zijn eenvoudig, goedkoop en kunnen worden uitgebreid naar andere celreceptoren.

Screening van peptiden die MRGPRX2 activeren met behulp van Engineered HEK Cells

High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA's kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.

Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

Leer een gebonden shRNA-schermmethode om regulatoren van X-chromosoom-inactivering te identificeren in muizenfibroblasten. Dit protocol combineert next generation sequencing met MeCP2-reportergenen voor genetisch onderzoek.

Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Meer video's verkennen