Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Begin deze procedure met de voorbereiding van muispeesfibroblasten, zoals beschreven in het tekstprotocol. Haal de cellen uit een 10-centimeter plaat door eerst het medium af te zuigen. Voeg vervolgens één milliliter 0,05% trypsin EDTA toe en incubeer gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Na incubatie, blus de trypsin met negen milliliter DMEM-10 en verzamel de gesuspendeerde cellen in een 15-milliliter conische buis. Verdun de cellen met DMEM-10 tot een eindconcentratie van één cel per 100 microliters. Breng vervolgens de cellen over naar 96-well platen door 100 microliter van de suspensie in elke well te pipetten.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius tot de wells confluëren, wat twee tot drie weken kan duren. Ververs het medium elke drie tot vijf dagen met vers DMEM-10. Wanneer confluërend, mobiliseer de cellen met 20 microliter 0,05% trypsin EDTA per well en verdeel ze in twee dubbele sets van 96-well platen.

Test op luciferase-activiteit in één set platen. Gebruik een homogene Firefly luciferase-test die geen verwijdering van het medium vereist, volgens het protocol dat bij de luciferase-testkit is inbegrepen. Gebruik de testresultaten om klonen met geen detecteerbare luciferase-activiteit te selecteren uit de resterende set platen.

Breng deze klonen eerst uit naar een 24-well plaat en vervolgens naar een zes-well plaat. Doe hetzelfde voor een klon met de hoogste luciferase-activiteit. Deze zal worden gebruikt als positieve controle voor validatiedoeleinden.

Na uitbreiding in de zes-well plaat, haal een aliquot van elke well voor een Western blot. Mobiliseer de cellen met 200 microliter 0,05% trypsin EDTA. Incubeer de cellen gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Blus de cellen met twee milliliter DMEM-10 en breng de helft van de cellen over naar een andere zes-well plaat. Wacht tot de cellen zich aan de bodem van de plaat hechten. Was vervolgens de cellen eenmaal met PBS voor het lyseren voor de Western blot.

Plateer verschillende negatieve klonen op 0,2 miljoen cellen per well in een zes-well plaat. Behandel de cellen eenmaal met 10 micromolar 5-azacytidine. Incubeer vervolgens gedurende 72 uur zonder het medium te verversen voordat u test op luciferase-activiteit, zoals eerder.

Kies vervolgens een negatieve klon die luciferase-activiteit heeft verkregen met 5-azacytidine voor de screening en begin met uitbreiden naar meerdere 10-centimeter platen. Vries de resterende negatieve klonen in vloeibare stikstof als back-up. De positieve klon kan in het weefselkweek of bevroren worden bewaard tot verder gebruik.

In de ochtend, plateer één miljoen inactieve X cellen op 10-centimeter weefselkweekplaten. In de middag, infecteer de platen door het medium te vervangen door vers DMEM-10 met een vooraf bepaalde hoeveelheid virale supernatant en vijf tot 10 microgram per milliliter polybreen. Na 18 tot 24 uur, zuig het medium af en voeg 10 milliliter vers DMEM-10 toe aan elke plaat.

Cultiveer platen nog eens 48 uur. In de ochtend, mobiliseer de cellen met één milliliter 0,05% trypsin EDTA per plaat en blus de cellen met 9 milliliter DMEM-10 per plaat. Laat de suspensie door een 100-micron mesh filter lopen.

Breng de gefilterde suspensies samen en zaai twee sets van 10-centimeter platen op één miljoen cellen per plaat. In de middag, vervang het medium in één set platen met DMEM-10 bevattend 15 microgram per milliliter Hygromycin B. In de andere set, vervang het medium met vers DMEM-10 alleen. Na 48 uur, mobiliseer de cellen van Hygromycin B onbehandelde platen met één milliliter 0,05% trypsin EDTA.

Incubeer gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Blus vervolgens de cellen met 9 milliliter DMEM-10. Neem de individuele monsters en ga onmiddellijk door met het extraheren van DNA.

Ga door met het cultiveren van de Hygromycin B selectieset gedurende zes extra dagen, waarbij het selectiemedium elke andere dag wordt aangevuld met vers DMEM-10 bevattend Hygromycin B. Op dag zes, vervang het selectiemedium met vers DMEM-10 alleen. Laat vier dagen voor herstel en haal vervolgens het DNA van de post-selectie monster zoals eerder.

Ga door met het identificeren van hairpins verrijkt in de post-selectie monsters, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de hits te valideren, zaai eerst acht miljoen 293-FT cellen per plaat op 10-centimeter platen. De volgende dag, vervang het medium met negen milliliter antibioticumvrij DMEM-10 per plaat 30 minuten voor de transectie.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter van transfectiemix een toe aan elke aliquot van transfectiemix twee en meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer vervolgens het mengsel gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Breng het mengsel druppelsgewijs aan op elke plaat en zwiep voorzichtig om te mengen.

De volgende dag, vervang het medium met vijf milliliter vers DMEM-10.48 uur na de initiële transfectie, verzamel het lentivirale supernatant en laat het lopen door een 0,22-micron filter dat is voorbevochtigd met DMEM-10 om de herstel te maximaliseren. De volgende ochtend, plateer 0,1 miljoen inactieve X cellen per well op zes-well platen. In de middag, infecteer de platen door het medium te vervangen door twee milliliter vers DMEM-10 bevattend lentivirale supernatant en vijf tot 10 microgram per milliliter polybreen.

Besmet een controlewell met virologisch supernatant geproduceerd uit een leeg lentiviraal vector. De volgende dag, vervang het medium met twee milliliter DMEM-10 bevattend één milligram per milliliter puromycine. Gebruik selectie gedurende vier dagen.

Na vier dagen, vervang het medium met twee milliliter vers DMEM-10 en laat 48 tot 72 uur voor herstel. Na het mobiliseren van de cellen met 150 microliter 0,05% trypsin EDTA, incubeer ze gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius.