Name: Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer een microscopieprotocol voor hoogresolutiebeeldvorming en 3D-reconstructie van de bloed-hersenbarrière bij muizen. Deze methode maakt kwantificering van subcellulaire organellen in endotheelcellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.V. werk werd gesteund door een Roche Postdoctoral Fellowship (2014-2017).

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
<li>Chow, B. W., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Constituents+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier.</a> Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).</li>
<li>Niewoehner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Brain+Penetration+and+Potency+of+a+Therapeutic+Antibody+Using+a+Monovalent+Molecular+Shuttle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.</a> Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).</li>
<li>Yu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies+cross+the+blood-brain+barrier+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.</a> Sci Transl Med. 6 (261), 154(2014).</li>
<li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+rather+unexplored+terrain-transcellular+transport+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier.</a> Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).</li>
<li>Bien-Ly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+%28TfR%29+trafficking+determines+brain+uptake+of+TfR+antibody+affinity+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.</a> J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).</li>
<li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340(2014).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990(2015).</li>
<li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding%2C+uptake%2C+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li>
<li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li>
<li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer%27s+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li>
<li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+uptake+of+tau%2FpS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658(2016).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+permeability+of+the+blood-brain+barrier+upon+pericyte+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSibarita%2C+JB+%22Deconvolution+Microscopy%22">Deconvolution Microscopy</a>. 95, 201-243 (2005).</li>
<li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-0-387-45524-2_23">Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging</a>. , 453-467 (2006).</li>
<li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Foret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+theoretical+framework+to+infer+endosomal+network+dynamics+from+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis.</a> Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li>
<li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier%3A+are+they+related+to+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li>
<li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li>
</ol>

Auteurs zijn in loondienst van Roche.

Het hierboven beschreven protocol beschrijft de voorbereiding van de vrij zwevende secties van de hersenen, immunefluorescentie kleuring Beeldacquisitie en analyse gebruikte parameters voor hoge resolutie microscopie van de BBB. Deze methode is onlangs gebruikt om te onderzoeken van de lokalisatie van antilichaam levering platformen3, het vervoer van endogene IgG over de BBB-17en de heterogeniteit van de BBB op pericyte verlies18. Verschillende stappen in het protocol kunnen worden gewijzigd om aan te passen aan de specifieke doel van het experiment. Eerst, vergemakkelijkt het gebruik van dikke (100 µm) secties hun behandeling tijdens de procedures voor immunokleuring en montage. Het staat ook voor 3D reconstructie van het capillaire netwerk, de neurovasculaire eenheid, en voor de generatie van capillaire en NVU dwarsdoorsneden. Echter penetratie van antilichamen binnen de weefselsecties kan variëren en sommige antilichaam kleuring kan worden beperkt tot de oppervlakkige laag van het weefsel dicht bij het dekglaasje aan. Het protocol kan worden gewijzigd door verhoging van de concentratie van wasmiddel tijdens de stap van de permeabilization en/of de lengte van de permeabilization stap ter verbetering van antilichaam penetratie in het weefsel. Ten tweede kan beeldkwaliteit worden aangetast wanneer probeert te verwerven beelden dieper in het weefsel (meestal 20 tot 30 µm onder het oppervlak) wegens lichtverstrooiing evenals optische aberraties van brekingsindex wanverhouding. Om dit probleem te verhelpen, kunnen nieuwe methoden voor weefsel clearing en actieve antilichaam penetratie20 worden gecombineerd met dit protocol tot de grotere volumes afbeelding van weefsel. Ten derde, deconvolutie wordt uitgevoerd na Beeldacquisitie ter verbetering van de axiale resolutie van de afbeelding. De keuze van het algoritme van de blinde deconvolutie gebruikt in dit protocol was gebaseerd op (i) het gebruiksgemak, zoals geen voorafgaande berekening van de punt-spread functie vereist is, (ii) zijn robuustheid voor verbetering van de beeld kwaliteit21, en (iii) het ontbreken van artefacten op mIgG intracellulaire structuren na implementatie. Afhankelijk van de intracellulaire structuren gevisualiseerd in de steekproef, andere deconvolutie algoritmen kunnen leiden tot hogere beeldkwaliteit. De volgende verwijzingen21,22 bieden een uitgebreide discussie over de voordelen en beperkingen van aanvullende algoritmen voor afbeelding deconvolutie. Tot slot, het gebruik van de softwarepakket van een beeld-analyse toegestaan de segmentatie van haarvaten en intracellulaire structuren in drie dimensies. Duidelijk beeldanalyse is niet beperkt tot de software zoals beschreven in het protocol en de alternatieve pakketten, bijvoorbeeld die wordt besproken in referentie23, kan worden gebruikt om afbeeldingen van het segment. De geschiktheid van verschillende software programma's voor de analyse van intracellulaire structuren in de BBB moet empirisch worden geverifieerd door de beoordeling van de juistheid van beeldsegmentatie.
Aangezien deze methode is gebaseerd op vaste monsters, biedt geen rechtstreekse informatie over de dynamiek van transcytosis over de BBB. Echter, het kan worden gecombineerd met tijdsverloop experimenten24, bijvoorbeeld door het intraveneus injecteren de molecule van belang en het meten van de accumulatie binnen BECs op verschillende tijdstippen na injectie, te reconstrueren de kinetiek van intracellulair transport. Het voordeel van deze aanpak is dat het mogelijk voor de analyse van diepe hersengebieden, maakt zoals in18, dat momenteel niet toegankelijk zijn voor intravital levende imaging benaderingen. Een belangrijke stap tijdens het protocol is de zorgvuldige controle van weefsel fixatie. Fixatie met 4% PFA drastisch vermindert de immunogeniciteit van intracellulaire organellen en endogene of ook door de overheid gereguleerde immunoglobulinen17 (figuur 1B). Een beperking van dit protocol is de eis van kwalitatief hoogwaardige antistoffen (d.w.z., lage niet-specifieke kleuring, lage Kruisallergie) geschikt voor immunofluorescentie. Mits dergelijke reagentia beschikbaar zijn, kan de methode kan worden toegepast om te onderzoeken de intracellulaire lokalisatie van een proteïne van belang. Bijvoorbeeld, is het protocol gebruikt voor het identificeren van lysosomen in hersenen endotheliale cellen17. Ook opgemerkt moet worden dat aangezien dit protocol is gebaseerd op confocale microscopie, de laterale resolutie wordt beperkt door diffractie en niet structuren kleiner is dan ongeveer 175 tot 250 oplossen nm (Figuur 2).
Eerdere studies hebben gedetailleerde analyse van de cellulaire samenstelling van de eenheid van de neurovasculaire met behulp van de confocal microscopie25,26uitgevoerd. Echter berust onderzoeken intracellulair transport op de BBB meestal op het gebruik van Transmissie Electronenmicroscopie19,27,28. Hoewel deze methode de hoogste laterale resolutie van intracellulaire structuren biedt, blijft elektronenmicroscopie een uitdagende techniek met lage doorvoersnelheid. Bovendien is het aantal verschillende moleculaire doelwitten die kunnen worden gevisualiseerd door EM is zeer beperkt. Dit protocol biedt een toegankelijke alternatief om te onderzoeken van intracellulair transport op de BBB. De volledige procedure, uit hersenen collectie aan beeldanalyse, kan worden uitgevoerd in 5 à 6 dagen. Als geschikt antilichamen beschikbaar zijn, kan immunofluorescentie simultane detectie van meerdere cel typen/moleculen binnen hetzelfde monster. Bovendien kan dit protocol worden gecombineerd met super resolutie microscopie technieken te overwinnen van de beperkingen in ruimtelijke resolutie29. Globaal, kunnen via het protocol zoals hierboven beschreven de kwantificering van veranderingen in de intracellulaire lokalisatie van proteïnen van belang binnen de neurovasculaire eenheid. De toepassing ervan voor verschillende genetische of farmacologische verstoringen zal toestaan de intracellulaire structuur en transport functies van de BBB in vivoonderzoeken.

De bloed - hersenbarrière (BBB) is een continue cellulaire barrière gevormd door astrocyten, pericytes, neuronen en endotheliale cellen die het centrale zenuwstelsel (CNS) de bloed omloop1 scheidt. De verordening van het vervoer over de BBB speelt een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase van de hersenen en is bemiddeld door gespecialiseerde eigenschappen van endothelial hersencellen (BECs). De aanwezigheid van strakke intercellulaire kruispunten tussen BECs en een lage basale snelheid van transcytosis beperken de paracellular en transcellulair vervoer van bloed overgedragen moleculen, respectievelijk2. Onlangs, heeft het transcytosis traject in BECs zijn aangewend om te verbeteren van therapeutische grote moleculen naar de hersenen3,4. Echter zijn de mechanismen van transcytosis over de BBB nog niet volledig gekenmerkt5,6.
Uitgebreide werk verricht in vitro om te ontcijferen van de cellulaire en moleculaire mechanismen tot regeling van intracellulair transport over BECs7,8,9,10, 11, maar dergelijke systemen niet recapituleren de complexe architectuur en de Fysiologie van de neurovasculaire eenheid (NVU). Aan de andere kant, studies in vivo12,13 verstrekken gedetailleerde kwantitatieve informatie over vrachtprijzen over de BBB maar bieden geen inzicht in de intracellulaire mechanismen van vervoer. Onderzoek naar de cellulaire en intracellulaire componenten van de NVU blijft in vivo en ex vivo derhalve zeer uitdagend14. Slechts een beperkt aantal technieken zijn vatbaar voor het analyseren van subcellular structuren binnen cellen van de NVU. De meeste studies gebruik elektronenmicroscopie, maar deze techniek is beperkt door de complexe protocollen die nodig zijn voor goede weefsel voorbereiding en behandeling van het monster. Daarom we ingesteld een methode gebaseerd op hoge resolutie confocale microscopie die de verwerking van de monsters van de hersenen, de analyse en de kwantificering van subcellular compartimenten binnen cellen van de NVU vergemakkelijken zou.
Hier beschrijven we een protocol die gebruik maakt van de muis hersenen vrij zwevende secties voor het uitvoeren van kwantitatieve beeldvorming van de BBB en NVU de cellulaire en subcellular niveau. We geteste en gevalideerde een aantal antilichamen beeld te reconstrueren van de NVU in drie dimensies. Bovendien staat dit protocol beeldvorming bij de maximale optische resolutie van de diffractie-limited van organellen binnen de hersenen haarvaten. Samen met beeldanalyse, kan dit protocol worden gebruikt om te onderzoeken het intracellulair transport van macromoleculen in de BBB onder verschillende experimentele omstandigheden, bijvoorbeeld in muismodellen van de ziekte van neurodegeneratie.

<table><tbody><tr><td>Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td>MCA2388</td><td>Labels Brain Endothelial Cells Gebruik bij verdunning 1:100 detecteer met donkey polyclonaal anti-rat IgG (H+L) gekoppeld aan geschikte AlexaFluor-kleurstof, gebruikt bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>Rat monoclonal antibody against Podocalyxin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1556</td><td>Labels Lumen van haarvaten Gebruik bij verdunning 1:100 detecteer met donkey polyclonaal anti-rat IgG (H+L) gekoppeld aan geschikte AlexaFluor-kleurstof, gebruikt bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>Labels Basal membraan van haarvaten Gebruik bij verdunning 1:100 detecteer met donkey polyclonaal anti-rabbit IgG (H+L) gekoppeld aan geschikte AlexaFluor-kleurstof, gebruikt bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>Goat polyclonal antibody against CD13</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF2335</td><td>Labels Pericyten Gebruik bij verdunning 1:100 detecteer met donkey polyclonaal anti-goat IgG (H+L) gekoppeld aan geschikte AlexaFluor-kleurstof, gebruikt bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP gekoppeld aan Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>Labels Astrocytes Gebruik bij verdunning 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal antibody against Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Labels Microglia Gebruik bij verdunning 1:100 detecteer met donkey polyclonaal anti-rat IgG (H+L) gekoppeld aan geschikte AlexaFluor-kleurstof, gebruikt bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>Rat monoclonal antibody ABL93 tegen LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>Labels Lysosomen Gebruik bij verdunning 1:100 detecteer met donkey polyclonaal anti-rat IgG (H+L) gekoppeld aan geschikte AlexaFluor-kleurstof, gebruikt bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>donkey polyclonal antibody tegen mouse IgG (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>Gebruik bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>donkey polyclonal antibody tegen mouse IgG (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>Gebruik bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>goat polyclonal antibody tegen mouse IgG (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>Gebruik bij verdunning 1:400</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman voorgeplooid kwalitatief filterpapier Kwaliteit 0858 1/2, gegraind</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm</td><td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>Fluorescent montagemedium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dako fluorescent montagemedium</td></tr><tr><td>Volwassen muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>C57BL/6J mannelijke of vrouwelijke muizen tussen de 9 en 19 maanden oud</td></tr><tr><td>Vibratoom</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Leica VT100S trillingsmes microtoom</td></tr><tr><td>Laserscanning confocale microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X met HyD-detectoren en wit lichtlaser</td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF versie 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Bitplane wetenschappelijke software</td><td>NA</td><td>Imaris versie 7.6.5 build 31770 voor x64</td></tr><tr><td>Fluorescentie SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /celanalyse/labelingchemie/fluorescentie-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

hoge resolutie confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: imaging, 3d reconstructie en kwantificering van transcytosis

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

De bloed - hersenbarrière (BBB) is een dynamische meercellige interface die het vervoer van moleculen tussen het verkeer en de hersenen regelt. Transcytosis over de BBB regelt de levering van hormonen, metabolieten en therapeutische antistoffen aan de hersenen parenchym. Hier presenteren we een protocol dat immunofluorescentie van vrij zwevende secties met laser scannen confocale microscopie en beeldanalyse combineert te visualiseren subcellular organellen binnen endotheliale cellen bij de BBB. Deze gegevensset te combineren met de software van de analyse van de 3D-afbeelding staat voor de semi-automatische segmentatie en kwantificering van capillaire volume en oppervlakte, alsmede het aantal en de intensiteit van intracellulaire organellen op de BBB. De detectie van de muis endogene immunoglobuline (IgG) binnen de intracellulaire vesikels en hun kwantificering op de BBB wordt gebruikt ter illustratie van de methode. Dit protocol kan mogelijk worden toegepast op het onderzoek naar de beheersing van BBB transcytosis van verschillende moleculen in vivomechanismen.

Als representatieve voorbeelden van afbeeldingen zijn verkregen van het protocol beschreven hier, muis hersenen secties werden gekleurd met antistoffen herkennen van de verschillende onderdelen van de NVU met inbegrip van de kelder membraan, astrocyten, pericytes, en endotheliale cellen (Zie Tabel van materialen voor specifieke antilichamen gebruikt) (figuur 1A, D, en E). Bij deze resolutie is het mogelijk om te onderscheiden van de afzonderlijke astrocytic processen en einde-voeten die in direct contact met de haarvaten.
Nadruk wordt gelegd op de geschiktheid van dit protocol voor de detectie van intracellulaire structuren, werden secties van de hersenen van dieren ook ingespoten met de menselijke anti-Tau mAb86 antilichaam16 gekleurd met een fluorescently geëtiketteerde anti-menselijke antilichaam ( Figuur 1B). mAb86 is bekend dat specifiek doel neuronen uitdrukken van een pathologische vorm van Tau16. Met het protocol beschreven hierin, werd mAb86 met diffractie-beperkte resolutie binnen individuele vesiculaire structuren binnen neuronen (Figuur 1-B-C) ontdekt. Bovendien, werd endogene muis IgG ontdekt in de intracellulaire structuren binnen endotheliale cellen maar niet in pericytes (Figuur 1D-E en Figuur 2).
De overname van high-resolution confocal z-stapels van de therapieën van de hersenen zorgt voor driedimensionale segmentatie van de haarvaten en intracellulaire vesikels bij de BBB. Figuur 2 toont een voorbeeld van het proces van opbouw en segmenteren van een capillair gekenmerkt met CollagenIV en muis IgG-positief intracellulaire vesikels. Door het kwantificeren van een volledige dataset van gesegmenteerde afbeeldingen, bijvoorbeeld door het meten van het aantal blaasjes per capillaire volume, is het mogelijk om te bestuderen van de veranderingen in intracellulair transportprocessen onder verschillende omstandigheden. Figuur 3 B-C toont de verschillen in mIgG blaasje nummer en fluorescentie intensiteit overeenkomt met mIgG op de hersenen parenchym, respectievelijk, na uitputting van het pericyte in de pdgf-bret/ret muismodel als eerder gemeld 17. dezelfde aanpak werd onlangs ook gebruikt voor het analyseren van wijzigingen in intracellulair transport op de BBB tussen verschillende hersenen regio's18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Figuur 1: Etikettering van meerdere celtypen en subcellular structuren van de neurovasculaire apparaat Representatieve beelden van de neurovasculaire eenheid (A en D) en de intracellulaire vesikels neuronen (B) deel uitmaakt of de endotheliale cellen (E) verkregen met dit protocol. De maximale intensiteit projectie afbeelding in A (boven) toont de verdeling van GFAP-positieve astrocyten (rood) omliggende haarvaten geëtiketteerd door CollagenIV (groen). Pijlen wijzen naar afzonderlijke astrocytic processen. Schaal bar = 20 µm. Bij deze resolutie zijn de individuele Astrocyt processen en einde-voeten duidelijk zichtbaar, zoals in het gezoomde beeld van de boxed Gewest (onder). Pijlpunten wijs astrocytic einde-voeten. Schaal bar = 10 µm. De afbeelding b toont de accumulatie van een antilichaam ook geïnjecteerd, mAb86 (groen), binnen een hippocampal neuron. Individuele mAb86-positieve blaasjes wijs pijlpunten. Schaal bar = 10 µm. De grafiek in C toont de lijn profiel intensiteit van een enkele blaasje. De grootte van het vesikel was geraamd helft maximaal een Gaussiaanse pasvorm (zwarte ononderbroken lijn) van de curve van de intensiteit (groene lijn en cirkels) uit de volle breedte. De afbeeldingen in D tonen een drie-dimensionale reconstructie van een endothelial cel (groen), omringd door een pericyte (rood) binnen de basale lamina (CollagenIV, grijs). De lagere panelen tonen de individuele fluorescentie-kanalen. Schaal bar = 10 µm. De afbeeldingen in E tonen de lokalisatie van mIgG (rood) in intracellulaire vesikels binnen endotheliale cellen (links paneel, CD31 in het groen) maar niet in pericytes (juiste paneel, CD13 in het groen). DAPI gekleurd kernen worden in alle afbeeldingen weergegeven in blauw. Schaal bar = 5 µm. panelen D en E zijn gewijzigd van17van de referentie. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Figuur 2 : Driedimensionale weergave van haarvaten en intracellulaire vesikels bij de bloed - hersenbarrière. Met het protocol beschreven, confocal resolutieafbeeldingen van CollagenIV-positieve haarvaten (groen) en muis IgG intracellulaire vesikels (rood) werden verworven (A). Het linker paneel toont een interne optische sectie met dwarsdoorsneden. De pijlen wijzen naar de afzonderlijke mIgG-positieve blaasjes binnen endothelial hersencellen. Het panel voor de juiste toont de 3D reconstructie van het gebruik van de volledige z-stack beeld processing software (Zie Tabel van materialen). De capillaire volume (B) en individuele blaasjes (C) werden weergegeven in drie dimensies en gekwantificeerd aan de hand van beeld processing software (Zie Tabel van materialen). DAPI gekleurd kernen worden in alle afbeeldingen weergegeven in blauw. Schaal bars = 5 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Figuur 3 : Kwantificering van de intracellulaire lokalisatie van de mIgG op de BBB. Representatieve afbeeldingen tonen (A) driedimensionele reconstructies van haarvaten (voorzien van collagenIV, groen) en de verdeling van de mIgG (rood) in C57BL/6 muizen en pdgf-bret/ret pericyte uitgeput muizen eerder beschreven in19. Schaal bars = 10 µm. De afbeeldingen in B tonen de segmentatie van intracellulaire vesikels binnen het CollagenIV masker. The grafiek b toont de kwantificering en de vergelijking van mIgG blaasje nummer per volume capillair. Elk punt vertegenwoordigt metingen van afzonderlijke capillaire segmenten. De ononderbroken lijn toont het gemiddelde en de foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de gegevens. De afbeeldingen in C Toon de mIgG fluorescentie signaal buiten het CollagenIV masker. Ook de grafiek in C toont de kwantificering en de vergelijking van mIgG fluorescentie intensiteit in de hersenen parenchym tussen C57BL/6 muizen en pdgf-bret/ret pericyte uitgeput muizen. Fluorescentie intensiteit eenheden waren genormaliseerd door de gemiddelde mIgG parenchym intensiteit, gemeten in alle C57BL/6 muizen. Dit cijfer is gewijzigd van referentie17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we een microscopie gebaseerde protocol voor hoge resolutie beeldvorming en een drie-dimensionale reconstructie van de muis neurovasculaire eenheid en bloed - hersen barrière met behulp van vrij zwevende secties van de hersenen. Deze methode zorgt voor de visualisatie, analyse en kwantificering van intracellulaire organellen op de BBB.

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Het algemene doel van deze methode is om een microscopie-gebaseerd protocol te bieden voor beeldvorming met hoge resolutie en 3-dimensionale reconstructie van de bloed-hersenbarrière van de muis. Het combineert immunofluorescentie van vrij zwevende secties met confocale microscopie om subcellulaire organellen binnen de hersenendotheelcellen te analyseren. Deze methode leert ook de voorbereiding van vrij zwevende hersensecties, immunofluorescentiekleuring, beeldverwerving en analyseparameters voor hoge resolutie microscopie van de bloed-hersenbarrière. Het grote voordeel van de techniek is dat het de kwantificering van subcellulaire organellen binnen cellen van de neurovasculaire eenheid mogelijk maakt. Roberto Villase zal de procedure demonstreren.

high-resolution-confocal-imaging-blood-brain-barrier-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om de afbeelding fluorescent gelabelde cellen in semi-dikke hersenen plakken. Door de vaststelling van, snijden, en optisch clearing hersenweefsel beschrijven we hoe standaard epifluorescerende of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om individuele cellen en neuronale netwerken binnen intact zenuwweefsel te visualiseren.

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Source: Villaseñor, R and Collin. L. High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates high-resolution 3D imaging of the blood-brain barrier (BBB) using confocal microscopy, showing antibody-stained mouse brain sections to analyze BBB components and intracellular structures, applicable for studying brain homeostasis, neurovascular interactions, and disease-related BBB...

High-Resolution Three-Dimensional Confocal Imaging of the Blood-Brain Barrier in a Mouse Brain Section

Source: Bagheri, M., et. al. Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the imaging of fluorescently labeled astrocytes in a mouse brain section using a confocal microscope. The brain section is positioned under the appropriate objective lens, and suitable fluorophores and filters are selected. After optimizing the exposure automatically, the scanning parameters are defined to ensure high-resolution 2D images. Z-stack...

Three-dimensional Imaging of Immunolabeled Astrocytes Using Confocal Microscopy

Om beelden met hoge resolutie te verkrijgen van fluorescerend gelabelde cellen binnen grote weefsels, zouden de biologische monsters ideaal geïmagingd moeten worden zonder te snijden. 3DISCO is een eenvoudige weefselklaringsprocedure gebaseerd op sequentiële incubatie met organische oplosmiddelen. Na klaring worden de organen transparant, waardoor een volledige laserscan van het specimen mogelijk is.

Imaging Ontruimde Intact Biological Systems op cellulair niveau door 3DISCO

Dit document beschrijft een methode waarmee de vasculaire architectuur in de hersenen kan worden gekwantificeerd met behulp van in vivo en ex vivo twee-foton microscopie.

Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation

Drug targeting aan tumoren van het centrale zenuwstelsel is een grote uitdaging. Hier beschrijven we een protocol om te produceren van een in vitro nabootsen van de bloed-hersen tumor-barrière lymfkliertest en/of menselijke cellen gebruiken en bespreken het belang ervan voor de voorspelbaarheid van het centrale zenuwstelsel tumor targeting in vivo.

Predicting In Vivo Payloads levering met behulp van een bloed-hersen Tumor-barrière in een schotel

Transcraniële optische beeldvorming maakt het mogelijk om het transport van cerebrospinale vloeistof in de cortex van levende muizen door middel van een intacte schedel te Imaging.

In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie

De bloed-hersenbarrière (BBB) kan tijdelijk worden verstoord met microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS). Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor BBB-opening met hoge doorvoer in vivo met behulp van een modulair FUS-systeem dat toegankelijk is voor niet-echografie-experts.

Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren

Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en kweken van een bloed-hersenbarrière gemetastaseerde tumor micro-omgeving en vervolgens kwantificeren van de toestand met behulp van confocale beeldvorming en kunstmatige intelligentie (machine learning).

Kwantificeren van de Brain Gemetastatische Tumor Micro-Environment met behulp van een Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning en Confocal Tomography

Dit protocol beschrijft de chirurgische en technische procedures die real-time in vivo multifotonenfluorescentiebeeldvorming van de knaagdierhersenen mogelijk maken tijdens gerichte echografie en microbubbelbehandelingen om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te verhogen.

Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

Leer een microscopieprotocol voor hoogresolutiebeeldvorming en 3D-reconstructie van de bloed-hersenbarrière bij muizen. Deze methode maakt kwantificering van subcellulaire organellen in endotheelcellen mogelijk.

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis (Video) | JoVE Journal

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

Meer video's verkennen