Live beelden van GLUT4 eiwit mensenhandel muis primaire hypothalame neuronen met behulp van deconvolutie microscopie
7 december 2017
Dit protocol wordt een techniek beschreven voor observatie van de real-time groen fluorescentie proteïne (GFP) gelabeld Glucose Transporter 4 (GLUT4) eiwit mensenhandel op insuline stimulatie en karakterisering van de biologische rol van CCR5 in de insuline-GLUT4 signalering traject met deconvolutie microscopie.
Het algemene doel van dit experiment is om de real-time eiwitverplaatsing in primaire neuronale cellen zoals GLUT4 in hypothalamische neuronen te observeren met minimale schade. Deze methode kan sleutelvraagstukken verklaren met betrekking tot neuronale regulatie van insulinesignalering en metabolisme, zoals in het geval van type 2 diabetes mellitus. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat onderzoekers primaire celculturen kunnen isoleren en het door geneesmiddelen geïnduceerde effect in real-time kunnen observeren.
De implicatie van deze techniek is om een therapie te kiezen voor type 2 diabetes of hersengerelateerde insulineresistentie omdat we nu weten hoe dit insulinesignaal wordt gemodificeerd door de chemokine CCL5 in hypothalamische neuronen. Om dit proces te starten, bekleed de kweekschalen een dag voor de kweek met poly-D lysine. Voeg voor een zes-welschaal 1,5 mL poly-D lysine bij 0,05 mg/mL toe aan elke wel.
De volgende dag verwijdert u poly-D lysine en was de schalen twee keer met 2 mL ddH2O. Vul vervolgens de 10-cm Petri schotels met 20 mL wasmedium en bewaar ze op ijs. Vul de 15-mL buisjes met wasmedium en bewaar ze op ijs.
Voor isolatie van hersenweefsel, steriliseer het platform, het dissectiemicroscoop en de chirurgische gereedschappen met 75% ethanol om besmetting te voorkomen. Snijd daarna rond het gebied van de navelstreng om de pups te isoleren zonder ze te beschadigen. Verwijder vervolgens het hoofd van elke pup en zet het vast met behulp van de fijne, rechte pincet.
Gebruik een andere fijne, gebogen pincet om de buitenste huid en schedel van beide kanten te verwijderen en trek ze van de voorkant naar de dorsale richting af. Leg vervolgens de geïsoleerde hersenen in een schone Petri schotel met ijskoud wasmedium. Draai de hersenen en houd de ventrale kant omhoog.
Vervolgens isoleert u het hypothalamische weefsel met fijne, gebogen pincet. Houd de reukkwab vast met de scherpe pincet en verwijder de dunne hersenvliezen rond de hele hersenen met de gebogen pincet. Draai naar de onderkant van de cortex en scheid de hippocampus van de cortex door deze naar de zijkant te trekken.
Wanneer alle regio's van de hersenen zijn geïsoleerd, snijdt u deze weefsels in de 15-ml buisjes die ijskoud wasmedium bevatten. Was de weefsels in deze procedure door de weefselbevattende buis twee tot drie keer om te draaien. Houd vervolgens de buis recht om de weefsels te laten bezinken.
Verwijder het bovenste medium met behulp van de glazen Pasteur-pipet die aan een vacuümsysteem is bevestigd. Om het weefsel te wassen, voegt u 15 mL ijskoud wasmedium toe en draait u de buis twee tot drie keer om. Na de laatste wassing, verwijdert u het wasmedium met behulp van een 1-mL pipette.
Incubeer de weefsels met Papain-Trypsine-verteringsbuffer in een 37-graad Celsius waterbad gedurende zeven tot 14 minuten. Neutraliseer vervolgens de enzymactiviteit door één volume foetaal bovien serum toe te voegen. Houd de buis op het rek en wacht een tot twee minuten om de weefsels te laten bezinken.
Verwijder vervolgens het supernatant voorzichtig met een 1-mL pipette. Voeg 6 mL van het platingmedium toe aan de testbuis en pipetteer het weefsel 50 keer zachtjes op en neer met een 5-mL pipette. Houd de buis op het rek en wacht een tot twee minuten om de brokkelige, niet-gedissocieerde weefsels te laten bezinken.
Breng vervolgens de bovenste fase met gedissocieerde cellen over naar een nieuwe buis en verdun deze met platingmedium. Voeg vervolgens 2 mL volledig kweekmedium toe aan elke wel van de zes-welschaal. Om de cellen voor levende beeldvorming voor te bereiden, verwijdert u voorzichtig de deksels met neuronen met behulp van pincet en plaatst u ze voorzichtig op de glazen plaat.
Verwijder vervolgens overtollig medium met delicate doekjes door ze twee keer te vouwen en ze voorzichtig op de deksel te plaatsen zonder deze te verplaatsen. Het is essentieel om overtollig medium te verwijderen om onnodige beweging op de deksel te voorkomen. Behandel vervolgens de geselecteerde celmonsters met CCL5 bij 10 ng/mL of insuline bij 10 eenheden/mL gedurende één minuut.
Voeg vervolgens 1,5 mcL verdund insuline toe aan de rand van de deksels. Voeg vervolgens immersie-olie toe op een objectieflens met 60 keer vergroting en 1,52 NA. Plaats vervolgens de deksels op het deconvolutiemkros met de deksels naar beneden en goed vastgezet.
Gebruik helder veld of fluorescentie-verlichting om de doelcellen te identificeren. Pas vervolgens de focus aan totdat de doelcellen duidelijk kunnen worden waargenomen. Beweeg de objectieflens niet buiten het gebied van de deksel om onnodige krasjes te voorkomen.
Identificeer vervolgens GFP-GLUT4 door het GFP-signaal. Identificeer vervolgens de gewenste doelcellen voor beeldacquisitie. Stel vervolgens de juiste experimentele parameters in voor elke doelcel, inclusief pixelaantal, excitatiegolflengte, transmissiepercentage, belichtingstijd, stackdikte, tijdsinterval en totale beeldacquisitietijd.
Pas de belichtingsparameter aan op ongeveer 2000 tot 3000 tellingen om maximale pixelintensiteit te bereiken. Om fluorescentie-fotobleken te minimaliseren, verminder de percentage transmissie van het excitatielicht zoveel mogelijk terwijl de belichtingstijd minder dan één seconde blijft. Stel de boven- en ondergrens van de Z-stack in op elke doelcel door de microscoopstand te verplaatsen totdat de boven- en onderkant van de doelcel beide lichtjes onscherp zijn.
Het is zeer belangrijk om de fluorescente fotobleken in neurondood na lichtbeeld te minimaliseren. Deze figuur toont dat de primair gekweekte hypothalamische neuronen zijn gelabeld met neuronmarker MAP2. De hypothalamische neuronale marker POMC en hun co-expressie van CCR5.
De co-gelocaliseerde afbeelding toont dat CCL5 wordt geëxpresseerd in POMC-positieve hypothalamische neuronen. Deze afbeeldingen tonen de expressie van GFP-GLUT4-eiwit in wild
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het observeren van het real-time transport van GFP-gelabelde Glucose Transporter 4 (GLUT4) in primaire hypothalamische neuronale cellen na stimulatie met insuline. Daarnaast wordt de rol van CCR5 in de insuline–GLUT4-signaleringsroute onderzocht, wat bijdraagt aan inzichten in de neuronale regulatie van insulinering en metabolisme die relevant zijn voor diabetes type 2.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Endocrinologie
Achtergrond
- De studie richt zich op de transportmechanismen van GLUT4 als reactie op insuline.
- Er wordt ingegaan op gedragsmatige en metabole vragen met betrekking tot diabetes mellitus type 2.
- De betrokkenheid van CCR5 bij insulinesignalering biedt nieuwe therapeutische mogelijkheden.
- Primaire neuronale celculturen maken minimale beschadiging tijdens experimenten mogelijk.
Doel van de studie
- Om de dynamiek van GLUT4-transport te onderzoeken in reactie op insuline.
- Om de rol van CCR5 in de insulinestroom-signaalroute te evalueren.
- Om het inzicht in neuronale invloeden op de insulinergiculatie te vergroten.
Gebruikte methoden
- Er werden primaire celculturen van hypothalamische neuronen gebruikt voor live-imaging.
- De isolatie van hersenweefsels van pups werd onder steriele omstandigheden uitgevoerd.
- Live-imaging werd uitgevoerd met deconvolution-microscopie om het transport van GLUT4 te volgen.
- Cellen werden tijdens de imaging behandeld met insuline en CCL5 om de effecten te observeren.
- Belangrijke aanpassingen in de experimentele parameters werden doorgevoerd om fotobleken te minimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- Het transport van GFP-GLUT4 werd gevisualiseerd in reactie op stimulatie met insuline en CCL5.
- Waarnemingen wezen op co-lokalisatie van CCR5 met neuronale markers, wat het GLUT4-transport beïnvloedde.
- Dit onderzoek onthult potentiële dysregulatie in insulinestureringsmechanismen als gevolg van CCR5.
- De resultaten benadrukken cruciale interacties tussen neuronale signalering en het metabolisme.
Conclusies
- De studie maakt real-time observatie mogelijk van insuline-geïnduceerd GLUT4-transport in neuronen.
- De bevindingen benadrukken de rol van CCR5, wat wijst op therapeutische richtingen voor diabetes type 2.
- De implicaties strekken zich uit tot het begrijpen van neuronale mechanismen die metabole stoornissen beïnvloeden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt real-time visualisatie van GLUT4-trafficking in primaire hypothalamische neuronen mogelijk, wat mechanistisch inzicht biedt in de dysregulatie van insulinestignalering die relevant is voor diabetes type 2. Door chemokine-signalering (CCL5) te koppelen aan de dynamiek van neuronaal glucosetransport, ondersteunt het de validatie van targets in metabole ziektepaden van het CZS. De aanpak vermindert de risico's van hypothesen in een vroeg stadium door kwantitatieve live-cell data te leveren over proteintranslocatie onder gecontroleerde stimulatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de functionele relatie tussen CCR5 en insuline-gestimuleerde GLUT4-translocatie in hypothalamische neuronen.
- Operationele waarde: Maakt directe observatie van proteïnedynamica in primaire cellen mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van surrogaatsystemen wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het mechanistische risicobeheer van CNS-targets die betrokken zijn bij de metabole regulatie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve meetwaarden van de efficiëntie van GLUT4-membraantranslocatie na stimulatie met insuline of chemokines.
- Operationele waarde: Vestigt een reproduceerbare live-imaging assay voor het volgen van transporteurdynamiek in neuronale modellen.
- Klaarheid van de assay: Levert ruimtelijk opgeloste time-lapse data die geschikt zijn voor het profileren van compound-effecten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Legt een verband tussen perifere chemokine-onbalans en defecten in de centrale insulinesignalering in een ziekterelevant neuronaal model.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van primaire hypothalamische neuronen van wild-type en CCR5-deficiënte modellen om genotype-afhankelijke responsen te beoordelen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en de in vivo pathofysiologie van obesitas en type 2 diabetes.
Pipeline- & workflowintegratie
De techniek past binnen workflows voor vroege ontdekking en ondersteunt de validatie van hypothesen voorafgaand aan de lead-identificatie en preklinische efficiëntietesten in programma's voor metabole ziekten.
- Discovery Biology: Test mechanistische verbanden tussen chemokine-receptoren en insulineregulatie van glucosetransport in neuronen.
- Screening: Levert kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde eindpunten voor het evalueren van effecten van verbindingen op GLUT4-trafficking.
- Analytics: Biedt op intensiteit gebaseerde metingen van GFP-GLUT4 puncta en membraanlokalisatie voor comparatieve analyse.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische modellen door het gebruik van primaire neuronen die neurale CCR5- en POMC-co-expressiepatronen weerspiegelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbaar live-imagingplatform dat toepasbaar is op andere fluorescentie-gelabelde transporters of receptoren in neuronale culturen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in doelhypothesen door real-time proteïnedynamiek te visualiseren in fysiologisch relevante cellen.
- Operationele waarde: Standaardiseert protocollen voor live-cell imaging met gedefinieerde parameters voor excitatie, belichting en z-stacking om fotobleken te minimaliseren.
- Strategische waarde: Onderbouwt go/no-go-beslissingen door te onthullen of een target de insulinesignalering in belangrijke neuronale populaties moduleert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van op het CZS gerichte metabole therapieën mogelijk op basis van mechanistisch bewijs uit mens-relevante neuronale modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire neuronale isolatie, steriele weefselverwerking en fluorescentiemicroscopie van levende cellen.
- Afhankelijk van toegang tot deconvolution-microscopiesystemen met 60x olie-immersieobjectieven en omgevingscontroles.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams voor celpreparatie, stimulatietiming en parameters voor beeldverwerving.
- Moet rekening houden met variabiliteit in de transfectie-efficiëntie van primaire cellen en de baseline GLUT4-expressie bij het vergelijken van condities.
- Beperkt door risico's op fototoxiciteit tijdens langdurige beeldvorming, wat wordt beperkt door het optimaliseren van de excitatie-intensiteit en de belichtingstijd zoals beschreven in het protocol.
