Celcyclusanalyse

De celcyclus verwijst naar de reeks cellulaire en biochemische processen die binnen een cel plaatsvinden en die leiden tot celdeling. Een cel doorloopt verschillende stadia van de cyclus, en de tijd die nodig is om dit proces te voltooien is bijna constant voor een celtype. Elke afwijking van deze duur is indicatief voor abnormale celdeling. Daarom wordt celcyclusanalyse een zeer nuttig hulpmiddel voor biologen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van mechanismen van celdeling, wat uiteindelijk zal helpen bij de behandeling van patiënten met ziekten zoals kanker, waarbij de celcyclus verstoord is.

Deze video zal het principe en een gegeneraliseerd protocol van celcyclusanalyse bespreken. Ten slotte zullen we enkele toepassingen van deze veelgebruikte methode laten zien.

Laten we leren wat celcyclusanalyse is en hoe deze test werkt.

In essentie vertelt celcyclusanalyse van een gemengde populatie ons hoeveel cellen zich in elk van de verschillende fasen bevinden. Dit wordt meestal gedaan door het DNA-gehalte van de cel te evalueren. Je vraagt je misschien af: waarom DNA-gehalte? Om dit te begrijpen, laten we kort bekijken wat er met chromosomaal DNA gebeurt terwijl een cel door de cyclus vordert.

Tijdens de G1-fase verandert het DNA-gehalte binnen een cel niet. Door de S-fase vindt DNA-replicatie plaats en aan het einde van deze fase is het DNA-gehalte verdubbeld. In de G2-fase controleren de cellen of er geen fouten zijn in de DNA-duplicatie en ten slotte - aan het einde van de M-fase - wordt dit DNA gelijk verdeeld in twee dochtercellen. Daarom kan het labelen van DNA een wetenschapper helpen het celcyclusstadium te bepalen.

Een belangrijke overweging voor deze markering is de keuze van de DNA-bindende kleurstof. Bromodeoxyuridine, of BrdU, is een nucleïnezuur-analogon en bootst thymidine structureel na. Dit stelt BrdU in staat zich tijdens DNA-replicatie in de groeiende streng in te bouwen. Daarom labelt deze kleurstof alleen cellen in de S-fase. Na incorporatie van BrdU worden de DNA-strengen gescheiden en wordt BrdU gedetecteerd met behulp van fluorescerend getagde antilichamen.

Andere verbindingen, zoals propidiumjodide of PI, dat inherent fluorescerend is, intercaleert tussen dubbelstrengs nucleïnezuren en kleurt daarom cellen in alle stadia. Echter, de hoeveelheid PI-kleuring is evenredig aan de hoeveelheid DNA.

Hoewel de keuze van een kleurstof afhangt van het experiment, gebruiken onderzoekers vaak dubbele kleurprocedures. Moleculen zoals PI die evenredig aan alle cellen binden, kunnen gemakkelijk G1-cellen van G2 of M-fase cellen onderscheiden. S-fase cellen zijn echter nog in overgang. Daarom verhoogt het toevoegen van moleculen zoals BrdU die alleen S-fase cellen labelen de specificiteit van celcyclusstadiumdetectie. Ten slotte worden cellen geanalyseerd met behulp van flowcytometrie om cellen in verschillende celcyclusstadia te tellen.

Nu je de principes achter celcycluskleuring begrijpt, laten we een procedure bespreken met behulp van BrdU en PI.

Stel celkweekschijven op: één voor het experiment en drie extra als controles. Bij ongeveer 60% confluentie wordt BrdU, opgelost in kweekmedium, toegevoegd aan de levende cellen, gevolgd door incubatie. In dit stadium wordt BrdU ingebouwd in het replicerende DNA.

Na incubatie worden cellen gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Vervolgens worden de cellen gefixeerd door de celsuspensie druppelsgewijs toe te voegen aan ijskoud 70% ethanol terwijl voorzichtig wordt gevormd. Dit stopt de celdeling en voorkomt klontering.

Gefixeerde cellen worden opnieuw gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in PBS. Vervolgens wordt een geconcentreerde zure oplossing met een detergent, zoals Triton-X, druppelsgewijs aan de cellen toegevoegd. Het detergent maakt de cellen permeabel om de toegang van membraondoorlatende verbindingen mogelijk te maken, en het zuur verlaagt de pH en denatureert DNA, waardoor BrdU wordt blootgesteld. Cellen worden vervolgens gecentrifugeerd, supernatant wordt weggegooid en het pellet wordt opnieuw gesuspendeerd in alkalische oplossing om de pH te herstellen.

Ten slotte worden cellen gewassen met PBS en geïncubeerd met een BrdU-antilichaam geconjugeerd aan een fluorescerende tag bij kamertemperatuur. Na deze stap moeten monsters worden beschermd tegen licht om fotobleking te voorkomen.

Bij dubbele kleuring worden cellen geïncubeerd met PI en RNase. RNase is noodzakelijk om RNA-RNA of RNA-DNA dubbelstrengs te verwijderen, die ook aan PI binden en valse positieve resultaten kunnen opleveren. Cellen worden vervolgens door een celzeven geleid om een enkele celsuspensie te maken, wat noodzakelijk is voor flowcytometrische analyse.

Nu je het protocol voor kleuring hebt geleerd, laten we bekijken hoe de verkregen gegevens worden geanalyseerd.

Kort gezegd, bij flowcytometrie schijnt een laserstraal op een smalle stroom van enkele celsuspensie en de emissie bij bepaalde golflengten van de kleurstoffen in elke cel wordt gedetecteerd als een enkele gebeurtenis op een spreidingsplot.

Hier toont de spreidingsplot van PI-gekleurde cellen twee verschillende clusters, één met bijna twee keer de hoeveelheid PI dan de andere. Na optimalisatie van de PI-detector verschijnen deze sets als twee pieken in een histogramanalyse. De piek bij grotere PI-intensiteit vertegenwoordigt G2/M-cellen en degene met lagere intensiteit vertegenwoordigt G1-cellen. De gebieden onder deze pieken vertegenwoordigen het aantal cellen in de overeenkomstige fasen.

Op soortgelijke wijze kunnen de BrdU-FITC-gebeurtenissen worden weergegeven in een histogramanalyse op een logaritmische schaal. Deze plot laat zien dat BrdU-positieve cellen duidelijk helderder zijn dan de ongekleurde cellen, en aangezien slechts een fractie van de populatie zich in de S-fase bevindt, kan een grotere piek van BrdU