Celcyclusanalyse
De celcyclus verwijst naar de reeks cellulaire en biochemische processen die binnen een cel plaatsvinden en die leiden tot celdeling. Een cel doorloopt verschillende stadia van de cyclus, en de tijd die nodig is om dit proces te voltooien is bijna constant voor een celtype. Elke afwijking van deze duur is indicatief voor abnormale celdeling. Daarom wordt celcyclusanalyse een zeer nuttig hulpmiddel voor biologen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van mechanismen van celdeling, wat uiteindelijk zal helpen bij de behandeling van patiënten met ziekten zoals kanker, waarbij de celcyclus verstoord is.
Deze video zal het principe en een gegeneraliseerd protocol van celcyclusanalyse bespreken. Ten slotte zullen we enkele toepassingen van deze veelgebruikte methode laten zien.
Laten we leren wat celcyclusanalyse is en hoe deze test werkt.
In essentie vertelt celcyclusanalyse van een gemengde populatie ons hoeveel cellen zich in elk van de verschillende fasen bevinden. Dit wordt meestal gedaan door het DNA-gehalte van de cel te evalueren. Je vraagt je misschien af: waarom DNA-gehalte? Om dit te begrijpen, laten we kort bekijken wat er met chromosomaal DNA gebeurt terwijl een cel door de cyclus vordert.
Tijdens de G1-fase verandert het DNA-gehalte binnen een cel niet. Door de S-fase vindt DNA-replicatie plaats en aan het einde van deze fase is het DNA-gehalte verdubbeld. In de G2-fase controleren de cellen of er geen fouten zijn in de DNA-duplicatie en ten slotte - aan het einde van de M-fase - wordt dit DNA gelijk verdeeld in twee dochtercellen. Daarom kan het labelen van DNA een wetenschapper helpen het celcyclusstadium te bepalen.
Een belangrijke overweging voor deze markering is de keuze van de DNA-bindende kleurstof. Bromodeoxyuridine, of BrdU, is een nucleïnezuur-analogon en bootst thymidine structureel na. Dit stelt BrdU in staat zich tijdens DNA-replicatie in de groeiende streng in te bouwen. Daarom labelt deze kleurstof alleen cellen in de S-fase. Na incorporatie van BrdU worden de DNA-strengen gescheiden en wordt BrdU gedetecteerd met behulp van fluorescerend getagde antilichamen.
Andere verbindingen, zoals propidiumjodide of PI, dat inherent fluorescerend is, intercaleert tussen dubbelstrengs nucleïnezuren en kleurt daarom cellen in alle stadia. Echter, de hoeveelheid PI-kleuring is evenredig aan de hoeveelheid DNA.
Hoewel de keuze van een kleurstof afhangt van het experiment, gebruiken onderzoekers vaak dubbele kleurprocedures. Moleculen zoals PI die evenredig aan alle cellen binden, kunnen gemakkelijk G1-cellen van G2 of M-fase cellen onderscheiden. S-fase cellen zijn echter nog in overgang. Daarom verhoogt het toevoegen van moleculen zoals BrdU die alleen S-fase cellen labelen de specificiteit van celcyclusstadiumdetectie. Ten slotte worden cellen geanalyseerd met behulp van flowcytometrie om cellen in verschillende celcyclusstadia te tellen.
Nu je de principes achter celcycluskleuring begrijpt, laten we een procedure bespreken met behulp van BrdU en PI.
Stel celkweekschijven op: één voor het experiment en drie extra als controles. Bij ongeveer 60% confluentie wordt BrdU, opgelost in kweekmedium, toegevoegd aan de levende cellen, gevolgd door incubatie. In dit stadium wordt BrdU ingebouwd in het replicerende DNA.
Na incubatie worden cellen gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Vervolgens worden de cellen gefixeerd door de celsuspensie druppelsgewijs toe te voegen aan ijskoud 70% ethanol terwijl voorzichtig wordt gevormd. Dit stopt de celdeling en voorkomt klontering.
Gefixeerde cellen worden opnieuw gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in PBS. Vervolgens wordt een geconcentreerde zure oplossing met een detergent, zoals Triton-X, druppelsgewijs aan de cellen toegevoegd. Het detergent maakt de cellen permeabel om de toegang van membraondoorlatende verbindingen mogelijk te maken, en het zuur verlaagt de pH en denatureert DNA, waardoor BrdU wordt blootgesteld. Cellen worden vervolgens gecentrifugeerd, supernatant wordt weggegooid en het pellet wordt opnieuw gesuspendeerd in alkalische oplossing om de pH te herstellen.
Ten slotte worden cellen gewassen met PBS en geïncubeerd met een BrdU-antilichaam geconjugeerd aan een fluorescerende tag bij kamertemperatuur. Na deze stap moeten monsters worden beschermd tegen licht om fotobleking te voorkomen.
Bij dubbele kleuring worden cellen geïncubeerd met PI en RNase. RNase is noodzakelijk om RNA-RNA of RNA-DNA dubbelstrengs te verwijderen, die ook aan PI binden en valse positieve resultaten kunnen opleveren. Cellen worden vervolgens door een celzeven geleid om een enkele celsuspensie te maken, wat noodzakelijk is voor flowcytometrische analyse.
Nu je het protocol voor kleuring hebt geleerd, laten we bekijken hoe de verkregen gegevens worden geanalyseerd.
Kort gezegd, bij flowcytometrie schijnt een laserstraal op een smalle stroom van enkele celsuspensie en de emissie bij bepaalde golflengten van de kleurstoffen in elke cel wordt gedetecteerd als een enkele gebeurtenis op een spreidingsplot.
Hier toont de spreidingsplot van PI-gekleurde cellen twee verschillende clusters, één met bijna twee keer de hoeveelheid PI dan de andere. Na optimalisatie van de PI-detector verschijnen deze sets als twee pieken in een histogramanalyse. De piek bij grotere PI-intensiteit vertegenwoordigt G2/M-cellen en degene met lagere intensiteit vertegenwoordigt G1-cellen. De gebieden onder deze pieken vertegenwoordigen het aantal cellen in de overeenkomstige fasen.
Op soortgelijke wijze kunnen de BrdU-FITC-gebeurtenissen worden weergegeven in een histogramanalyse op een logaritmische schaal. Deze plot laat zien dat BrdU-positieve cellen duidelijk helderder zijn dan de ongekleurde cellen, en aangezien slechts een fractie van de populatie zich in de S-fase bevindt, kan een grotere piek van BrdU
De celcyclus verwijst naar de reeks gebeurtenissen waardoor een cel groeit, zijn genoom repliceert en uiteindelijk verdeelt in twee dochtercellen door…
De celcyclus verwijst naar de reeks cellulaire en biochemische processen die binnen een cel plaatsvinden en die leiden tot celdeling. Een cel doorloopt verschillende stadia van de cyclus, en de tijd die nodig is om dit proces te voltooien is bijna constant voor een celtype. Elke afwijking van deze duur is indicatief voor abnormale celdeling. Daarom wordt celcyclusanalyse een zeer nuttig hulpmiddel voor biologen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van mechanismen van celdeling, wat uiteindelijk zal helpen bij de behandeling van patiënten met ziekten zoals kanker, waarbij de celcyclus verstoord is.
Deze video zal het principe en een gegeneraliseerd protocol van celcyclusanalyse bespreken. Ten slotte zullen we enkele toepassingen van deze veelgebruikte methode laten zien.
Laten we leren wat celcyclusanalyse is en hoe deze test werkt.
In essentie vertelt celcyclusanalyse van een gemengde populatie ons hoeveel cellen zich in elk van de verschillende fasen bevinden. Dit wordt meestal gedaan door het DNA-gehalte van de cel te evalueren. Je vraagt je misschien af: waarom DNA-gehalte? Om dit te begrijpen, laten we kort bekijken wat er met chromosomaal DNA gebeurt terwijl een cel door de cyclus vordert.
Tijdens de G1-fase verandert het DNA-gehalte binnen een cel niet. Door de S-fase vindt DNA-replicatie plaats en aan het einde van deze fase is het DNA-gehalte verdubbeld. In de G2-fase controleren de cellen of er geen fouten zijn in de DNA-duplicatie en ten slotte - aan het einde van de M-fase - wordt dit DNA gelijk verdeeld in twee dochtercellen. Daarom kan het labelen van DNA een wetenschapper helpen het celcyclusstadium te bepalen.
Een belangrijke overweging voor deze markering is de keuze van de DNA-bindende kleurstof. Bromodeoxyuridine, of BrdU, is een nucleïnezuur-analogon en bootst thymidine structureel na. Dit stelt BrdU in staat zich tijdens DNA-replicatie in de groeiende streng in te bouwen. Daarom labelt deze kleurstof alleen cellen in de S-fase. Na incorporatie van BrdU worden de DNA-strengen gescheiden en wordt BrdU gedetecteerd met behulp van fluorescerend getagde antilichamen.
Andere verbindingen, zoals propidiumjodide of PI, dat inherent fluorescerend is, intercaleert tussen dubbelstrengs nucleïnezuren en kleurt daarom cellen in alle stadia. Echter, de hoeveelheid PI-kleuring is evenredig aan de hoeveelheid DNA.
Hoewel de keuze van een kleurstof afhangt van het experiment, gebruiken onderzoekers vaak dubbele kleurprocedures. Moleculen zoals PI die evenredig aan alle cellen binden, kunnen gemakkelijk G1-cellen van G2 of M-fase cellen onderscheiden. S-fase cellen zijn echter nog in overgang. Daarom verhoogt het toevoegen van moleculen zoals BrdU die alleen S-fase cellen labelen de specificiteit van celcyclusstadiumdetectie. Ten slotte worden cellen geanalyseerd met behulp van flowcytometrie om cellen in verschillende celcyclusstadia te tellen.
Nu je de principes achter celcycluskleuring begrijpt, laten we een procedure bespreken met behulp van BrdU en PI.
Stel celkweekschijven op: één voor het experiment en drie extra als controles. Bij ongeveer 60% confluentie wordt BrdU, opgelost in kweekmedium, toegevoegd aan de levende cellen, gevolgd door incubatie. In dit stadium wordt BrdU ingebouwd in het replicerende DNA.
Na incubatie worden cellen gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Vervolgens worden de cellen gefixeerd door de celsuspensie druppelsgewijs toe te voegen aan ijskoud 70% ethanol terwijl voorzichtig wordt gevormd. Dit stopt de celdeling en voorkomt klontering.
Gefixeerde cellen worden opnieuw gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in PBS. Vervolgens wordt een geconcentreerde zure oplossing met een detergent, zoals Triton-X, druppelsgewijs aan de cellen toegevoegd. Het detergent maakt de cellen permeabel om de toegang van membraondoorlatende verbindingen mogelijk te maken, en het zuur verlaagt de pH en denatureert DNA, waardoor BrdU wordt blootgesteld. Cellen worden vervolgens gecentrifugeerd, supernatant wordt weggegooid en het pellet wordt opnieuw gesuspendeerd in alkalische oplossing om de pH te herstellen.
Ten slotte worden cellen gewassen met PBS en geïncubeerd met een BrdU-antilichaam geconjugeerd aan een fluorescerende tag bij kamertemperatuur. Na deze stap moeten monsters worden beschermd tegen licht om fotobleking te voorkomen.
Bij dubbele kleuring worden cellen geïncubeerd met PI en RNase. RNase is noodzakelijk om RNA-RNA of RNA-DNA dubbelstrengs te verwijderen, die ook aan PI binden en valse positieve resultaten kunnen opleveren. Cellen worden vervolgens door een celzeven geleid om een enkele celsuspensie te maken, wat noodzakelijk is voor flowcytometrische analyse.
Nu je het protocol voor kleuring hebt geleerd, laten we bekijken hoe de verkregen gegevens worden geanalyseerd.
Kort gezegd, bij flowcytometrie schijnt een laserstraal op een smalle stroom van enkele celsuspensie en de emissie bij bepaalde golflengten van de kleurstoffen in elke cel wordt gedetecteerd als een enkele gebeurtenis op een spreidingsplot.
Hier toont de spreidingsplot van PI-gekleurde cellen twee verschillende clusters, één met bijna twee keer de hoeveelheid PI dan de andere. Na optimalisatie van de PI-detector verschijnen deze sets als twee pieken in een histogramanalyse. De piek bij grotere PI-intensiteit vertegenwoordigt G2/M-cellen en degene met lagere intensiteit vertegenwoordigt G1-cellen. De gebieden onder deze pieken vertegenwoordigen het aantal cellen in de overeenkomstige fasen.
Op soortgelijke wijze kunnen de BrdU-FITC-gebeurtenissen worden weergegeven in een histogramanalyse op een logaritmische schaal. Deze plot laat zien dat BrdU-positieve cellen duidelijk helderder zijn dan de ongekleurde cellen, en aangezien slechts een fractie van de populatie zich in de S-fase bevindt, kan een grotere piek van BrdU
De celcyclus verwijst naar de reeks cellulaire en biochemische processen die binnen een cel plaatsvinden en die leiden tot celdeling. Een cel doorloopt verschillende stadia van de cyclus, en de tijd die nodig is om dit proces te voltooien is bijna constant voor een celtype. Elke afwijking van deze duur is indicatief voor abnormale celdeling. Daarom wordt celcyclusanalyse een zeer nuttig hulpmiddel voor biologen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van mechanismen van celdeling, wat uiteindelijk zal helpen bij de behandeling van patiënten met ziekten zoals kanker, waarbij de celcyclus verstoord is.
Deze video zal het principe en een gegeneraliseerd protocol van celcyclusanalyse bespreken. Ten slotte zullen we enkele toepassingen van deze veelgebruikte methode laten zien.
Laten we leren wat celcyclusanalyse is en hoe deze test werkt.
In essentie vertelt celcyclusanalyse van een gemengde populatie ons hoeveel cellen zich in elk van de verschillende fasen bevinden. Dit wordt meestal gedaan door het DNA-gehalte van de cel te evalueren. Je vraagt je misschien af: waarom DNA-gehalte? Om dit te begrijpen, laten we kort bekijken wat er met chromosomaal DNA gebeurt terwijl een cel door de cyclus vordert.
Tijdens de G1-fase verandert het DNA-gehalte binnen een cel niet. Door de S-fase vindt DNA-replicatie plaats en aan het einde van deze fase is het DNA-gehalte verdubbeld. In de G2-fase controleren de cellen of er geen fouten zijn in de DNA-duplicatie en ten slotte - aan het einde van de M-fase - wordt dit DNA gelijk verdeeld in twee dochtercellen. Daarom kan het labelen van DNA een wetenschapper helpen het celcyclusstadium te bepalen.
Een belangrijke overweging voor deze markering is de keuze van de DNA-bindende kleurstof. Bromodeoxyuridine, of BrdU, is een nucleïnezuur-analogon en bootst thymidine structureel na. Dit stelt BrdU in staat zich tijdens DNA-replicatie in de groeiende streng in te bouwen. Daarom labelt deze kleurstof alleen cellen in de S-fase. Na incorporatie van BrdU worden de DNA-strengen gescheiden en wordt BrdU gedetecteerd met behulp van fluorescerend getagde antilichamen.
Andere verbindingen, zoals propidiumjodide of PI, dat inherent fluorescerend is, intercaleert tussen dubbelstrengs nucleïnezuren en kleurt daarom cellen in alle stadia. Echter, de hoeveelheid PI-kleuring is evenredig aan de hoeveelheid DNA.
Hoewel de keuze van een kleurstof afhangt van het experiment, gebruiken onderzoekers vaak dubbele kleurprocedures. Moleculen zoals PI die evenredig aan alle cellen binden, kunnen gemakkelijk G1-cellen van G2 of M-fase cellen onderscheiden. S-fase cellen zijn echter nog in overgang. Daarom verhoogt het toevoegen van moleculen zoals BrdU die alleen S-fase cellen labelen de specificiteit van celcyclusstadiumdetectie. Ten slotte worden cellen geanalyseerd met behulp van flowcytometrie om cellen in verschillende celcyclusstadia te tellen.
Nu je de principes achter celcycluskleuring begrijpt, laten we een procedure bespreken met behulp van BrdU en PI.
Stel celkweekschijven op: één voor het experiment en drie extra als controles. Bij ongeveer 60% confluentie wordt BrdU, opgelost in kweekmedium, toegevoegd aan de levende cellen, gevolgd door incubatie. In dit stadium wordt BrdU ingebouwd in het replicerende DNA.
Na incubatie worden cellen gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Vervolgens worden de cellen gefixeerd door de celsuspensie druppelsgewijs toe te voegen aan ijskoud 70% ethanol terwijl voorzichtig wordt gevormd. Dit stopt de celdeling en voorkomt klontering.
Gefixeerde cellen worden opnieuw gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in PBS. Vervolgens wordt een geconcentreerde zure oplossing met een detergent, zoals Triton-X, druppelsgewijs aan de cellen toegevoegd. Het detergent maakt de cellen permeabel om de toegang van membraondoorlatende verbindingen mogelijk te maken, en het zuur verlaagt de pH en denatureert DNA, waardoor BrdU wordt blootgesteld. Cellen worden vervolgens gecentrifugeerd, supernatant wordt weggegooid en het pellet wordt opnieuw gesuspendeerd in alkalische oplossing om de pH te herstellen.
Ten slotte worden cellen gewassen met PBS en geïncubeerd met een BrdU-antilichaam geconjugeerd aan een fluorescerende tag bij kamertemperatuur. Na deze stap moeten monsters worden beschermd tegen licht om fotobleking te voorkomen.
Bij dubbele kleuring worden cellen geïncubeerd met PI en RNase. RNase is noodzakelijk om RNA-RNA of RNA-DNA dubbelstrengs te verwijderen, die ook aan PI binden en valse positieve resultaten kunnen opleveren. Cellen worden vervolgens door een celzeven geleid om een enkele celsuspensie te maken, wat noodzakelijk is voor flowcytometrische analyse.
Nu je het protocol voor kleuring hebt geleerd, laten we bekijken hoe de verkregen gegevens worden geanalyseerd.
Kort gezegd, bij flowcytometrie schijnt een laserstraal op een smalle stroom van enkele celsuspensie en de emissie bij bepaalde golflengten van de kleurstoffen in elke cel wordt gedetecteerd als een enkele gebeurtenis op een spreidingsplot.
Hier toont de spreidingsplot van PI-gekleurde cellen twee verschillende clusters, één met bijna twee keer de hoeveelheid PI dan de andere. Na optimalisatie van de PI-detector verschijnen deze sets als twee pieken in een histogramanalyse. De piek bij grotere PI-intensiteit vertegenwoordigt G2/M-cellen en degene met lagere intensiteit vertegenwoordigt G1-cellen. De gebieden onder deze pieken vertegenwoordigen het aantal cellen in de overeenkomstige fasen.
Op soortgelijke wijze kunnen de BrdU-FITC-gebeurtenissen worden weergegeven in een histogramanalyse op een logaritmische schaal. Deze plot laat zien dat BrdU-positieve cellen duidelijk helderder zijn dan de ongekleurde cellen, en aangezien slechts een fractie van de populatie zich in de S-fase bevindt, kan een grotere piek van BrdU
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is DNA content used to determine cell cycle phases?
DNA content changes predictably during the cell cycle, making it an ideal marker for phase identification. During G1, DNA remains constant; during S phase, DNA replicates and doubles; during G2, cells verify replication accuracy; and during M phase, DNA divides equally into daughter cells. These characteristic changes allow scientists to sort cells by their current cycle stage.
Q2: What is the difference between BrdU and propidium iodide staining?
BrdU, a thymidine analog, incorporates only into newly synthesized DNA during S phase, labeling replicating cells exclusively. Propidium iodide intercalates between all double-stranded DNA and stains cells at every cycle stage, with fluorescence proportional to DNA amount. Dual staining combines both dyes to increase specificity: PI differentiates G1 from G2/M cells, while BrdU identifies S phase cells in transition.
Q3: How does flow cytometry detect cells in different cycle phases?
Flow cytometry passes a single cell suspension through a laser beam, detecting fluorescent emissions from DNA-binding dyes at specific wavelengths. Each cell's signal appears as a single event on a scatter plot. PI-stained cells produce two distinct peaks in histogram analysis: higher intensity represents G2/M cells with doubled DNA, while lower intensity represents G1 cells with normal DNA content.
Q4: Why is RNase added during the dual staining protocol?
RNase removes RNA-RNA and RNA-DNA double strands that also bind to propidium iodide, which would produce false positive results and skew data interpretation. By eliminating these non-DNA targets, RNase ensures that PI fluorescence reflects only DNA content, improving the accuracy of cell cycle phase determination and allowing reliable quantification of cells in each phase.
Q5: What does the horseshoe pattern indicate in a BrdU and PI scatter plot?
The horseshoe pattern in a dual-stained scatter plot displays the progression of cells through the cell cycle. The pattern shows cells transitioning from G1 (lower PI, no BrdU) through S phase (increasing PI and BrdU signal) to G2/M (high PI, no BrdU). This visual representation helps researchers quantify the proportion of cells in each gated area and understand population dynamics during cell cycle progression.
Q6: How can cell cycle analysis reveal protein roles in cell division?
By combining genetic manipulations with cell cycle analysis, scientists can observe how altering specific proteins affects cycle progression. For example, overexpressing p27 in mouse fibroblasts reduced S phase cell numbers, demonstrating that p27 regulates cell cycle progression. This approach allows researchers to identify critical proteins involved in cell division, with applications for understanding cancer and developing therapeutic strategies.
Q7: What is the purpose of fixing cells in ice-cold ethanol during the protocol?
Ice-cold 70% ethanol fixes cells by ceasing cell division and preventing clumping, which would compromise analysis accuracy. The cold temperature and gentle vortexing preserve cell integrity while stopping metabolic activity. Fixed cells can then be safely permeabilized with detergent and acid solutions to expose BrdU and allow antibody penetration without cellular degradation.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:56
Principle Behind Cell Cycle Analysis
3:33
Generalized Protocol for BrdU and PI Staining
5:43
Flow Cytometric Analysis
7:26
Applications
9:07
Summary