Bestuderen van het signaal van de hypothalamische insuline naar perifere Glucose-intolerantie met een continue Drug infusie-systeem in de hersenen van de muis

Het algemene doel van dit experiment is om de rol van hypothalamische C-C-L-5 signalering in de insulinefunctie in het perifere systeem en glucosemetabolisme te onderzoeken door C-C-L-5 signalering te manipuleren door het toedienen van de antagonist Met-C-C-L-5 via een intercerebrale ventrikelafgiftesysteem, de micro-osmotische pomp. Dit medicijn kan helpen om de belangrijkste vragen in het biochemische fysiologieveld te beantwoorden, zoals chemokine C-C-L-5 bij het controleren van glucosemetabolisme in het lichaam en insulineresponsiviteit in de hersenen. Het grote voordeel van deze maatregel is dat de onderzoeker gemakkelijk bepaalde signalering in de hersenen gedurende een periode van tijd kan manipuleren, zoals de C-C-L-5 hier, zonder compensatoir effect of het ontwikkelen van een stoornis, wat meestal gebeurt wanneer we genetische manipulatie doen bij knaagdieren.

Visuele demonstratie van deze procedure is belangrijk omdat het inbrengen van de micro-osmotische pomp en de nauwkeurige meting van bloedinsuline en glucoseniveau vaardigheid en precisie vereist. Eén dag voor de operatie, bereid de hersenmicro-osmotische pompen voor door een enkele milliliter spuit en stompe kopnaald te gebruiken om de pompen te vullen met kunstmatige cerebrospinale vloeistof, of A-C-S-F. Dompel vervolgens de pomp in A-C-S-F en plaats deze op een shaker voor zacht overnacht schudden.

Op de volgende dag, verwijder de A-C-S-F van de pomp en vul deze volledig met eerder bereide medicijnoplossing verdund in A-C-S-F tot het overtollige uitlekt. Gebruik vervolgens chirurgische scharen om de katheterbuizen op de gewenste lengte te snijden. Gebruik een stompe herseninfusienaalden om de buizen aan het herseninfusiekit te bevestigen.

Vul vervolgens de buizen in het infusiekit met de medicijnoplossing. Na het samenstellen van het kit, bevestig het aan de micro-osmotische pomp. Ten slotte, om te voorkomen dat de pomp uitdroogt, dompel de osmotische pomp herseninfusiestelling in A-C-S-F in een gesteriliseerde 50 milliliter buis.

Om de operatie te starten, monteer en fixeer de kop van een verdoofde muis op een stereotactisch apparaat. Gebruik een paar chirurgische schaar en pincet om de buitenste huid die de schedel bedekt open te snijden. Gebruik vervolgens jodium om de perifere schedel schoon te maken.

Gebruik vervolgens een paar stompe kopschaar in de nekregio om de buitenste huidlaag van de onderhuidse huid te scheiden voor de implantatie van de osmotische pomp hersenfusiestelling. Gebruik het stereotactisch apparaat om het infusiepunt te markeren met verwijzing naar de hersenenkaart. Gebruik een nagelboor om een gat rond het gebied op de schedel te boren, wees voorzichtig om de hersenvliezen en bloedvaten van de muis niet te breken.

Plaats vervolgens de micro-osmotische pomp hersenfusiestelling die het medicijn van belang bevat, of A-C-S-F als controle, onder de huid achter de nekregio. Om het medicijn in de hersenen te infunderen, steek de herseninfusienaalden in het geboorde gat. Gebruik oppervlaktedesensitiserend gel om de naald op de schedel op zijn plaats te fixeren en wacht tot de lijm droogt.

Snijd het uitsteken van de naald af. Voordat u de glucosetolerantietest start, bereid de glucoseoplossing voor door 3,75 gram glucose en 15 milliliter gedistilleerd water op te lossen. Stel een tijdschema op met goede intervallen tussen elke bloedonderzoek om de metingen tijdens het experiment op te nemen.

Weeg vervolgens elke muis na het vasten om de juiste hoeveelheid glucose voor de injectie te berekenen. Bereid vervolgens op de werkbank een timer, glucosechip, glucometer, insulinespuit en scheermessen voor. Om het bloedglucoseniveau te meten, plaats eerst een nieuwe glucosechip in de glucometer en druk op de startknop om de nul in te stellen.

Pak vervolgens de muis bij de achterkant van de nek en strijk zijn staart om voldoende bloedstroom te garanderen. Gebruik een nieuw scheermes om een klein stukje van de staart af te snijden en knijp vervolgens een druppel bloed in de glucosechip. Gebruik intragastrische lavagetechniek om de muis glucose te voeren en start onmiddellijk de timer.

Meet het glucose op verschillende tijdstippen. Om de insulinetolerantietest te starten, bereid 0,25 eenheden humane insulineoplossing voor. Weeg vervolgens elke muis na het vasten om de juiste hoeveelheid insuline voor de injectie te berekenen.

Stel vervolgens een tijdschema op om de metingen tijdens het experiment op te nemen. Ten slotte, na de insuline-injectie, meet u het bloedglucoseniveau zoals eerder gedaan. Glucosemetabolisme werd gemeten door de orale glucosetolerantietest na de operatie, na de orale toediening van glucose bij muizen.

De veranderingen in het bloedglucoseniveau bij muizen geïnfundeerd met A-C-S-F, of geïnfundeerd met C-C-L-5 antagonist, worden hier geregistreerd en getoond. De insulinegevoeligheidstest werd ook uitgevoerd en het bloedglucoseniveau bij muizen geïnfundeerd met C-C-L-5 antagonist was slechts licht verminderd in vergelijking met controlemuizen, wat wijst op beperkingen in insulinefunctie op perifere glucosemetabolisme bij muizen behandeld met C-C-L-5. Om insulinesignaalactivatie te analyseren, werd de insulinereceptorsubstraatproteïne, of I-R-S-1 fosforylering, geëvalueerd in de hypothalamus.

Bij muizen behandeld met C-C-L-5 antagonist wanneer normaal gevoerd, was I-R-S-1 fosforylering opgereguleerd in vergelijking met de controlegroep. Om insulinesignaalactivatie verder te analyseren, werden ook niveaus van gefosforyleerde serine 4-7-3 Akt, insuline-downstream-signaleringsmolecuul, geëvalueerd. Na insuline uitdaging werd het A-K-T signaal verhoogd bij de controle A-C-S-F behandelde muizen, maar niet bij de C-C-L-5 antagonist behandelde muizen.

Eens de meesters de inbrenging van de micro-osmotische pomp hebben geïnserteerd, duurt het slechts een half uur als het goed wordt gedaan. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de kop van de muis licht opgetild is en de