Name: Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Verken de reactie van Dictyostelium discoideum op acute mechanische stimulatie met behulp van microscopische biosensorlokalisatie en eiwitactivering. Deze methode isoleert de initiële cellulaire respons zonder verstoring door mobiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie R35 GM118177 PND.

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24535823">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
<li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381519/">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2%2F3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methoden bieden een handige manier om te beoordelen van zowel de bevolking als afzonderlijke cel gedrag in antwoord als u wilt schuintrekken van stroom. Nog belangrijker is, terwijl eerdere studies geanalyseerd lokalisatie van leading en lagging rand markeringen tijdens de migratie, laat de huidige aanpak onderzoek van de onmiddellijke effecten door de stroom van de shear acuut toe te passen. Using zulks werkwijze wij aangetoond dat in feite de eerste reactie van cellen wilt schuintrekken stroom niet c...

Migratie van eukaryotische cellen is bevooroordeeld door middel van diverse chemische en fysische signalen in het milieu, met inbegrip van gradiënten van oplosbare of substraat-gebonden chemoattractants, variabele stijfheid van de substraten, elektrische velden of schuintrekken stroom. Hoewel er al veel vooruitgang in ons begrip van de moleculaire mechanismen chemotaxis rijden, minder is gekend over andere soorten gestuurde migratie en hoe deze uiteenlopende signalen zijn geïntegreerd op cellulair niveau tot een uniforme trekkende reactie.
Regie migratie naar een toenemende concentratie van een chemoattractant omvat drie gedrags componenten: beweeglijkheid, directionele sensing en polariteit1. Motility verwijst naar willekeurige verkeer van cellen bereikt door pseudopod uitsteeksel. Directionele sensing is de mogelijkheid van een cel om de oorzaak van een chemoattractant worden opgespoord, die kan optreden zelfs in cellen geïmmobiliseerd. Polariteit verwijst naar de meer stabiele asymmetrische distributie van intracellulaire componenten tussen de leading en lagging rand van een cel, die tot verhoogde persistentie in beweging leidt.
Cellulaire reactie op een chemoattractant hangt af van de activiteit van vier conceptueel gedefinieerde regulerende netwerken: receptor / G eiwit, signaaltransductie, actine cytoskelet en polariteit1. Chemoattractant binding aan de G eiwit-gekoppelde receptor stuurt het signaal via heterotrimeric G eiwitten α en βγ op het stroomafwaarts signaaltransductie netwerk, dat het signaal directionele versterkt. Meerdere trajecten binnen het netwerk signaaltransductie handelen in parallel en worden meegenomen bij het actine cytoskelet netwerk aan bias actine polymerisatie, en daaruit voortvloeiende pseudopod uitsteeksel, in de richting van het verloop. Belangrijke regulatoren van chemotaxis behoren tot Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K) fosfatase en Tenzin homolog (PTEN) en guanylyl cyclase. Feedbackmechanismen binnen het netwerk signaaltransductie en tussen de signaaltransductie en actine cytoskelet netwerken verder versterken het antwoord. Ten slotte, het slecht gedefinieerde polariteit netwerk ontvangt input van het cytoskelet actine, en verder vooroordelen het signaaltransductie netwerk ter bevordering van permanente migratie in de richting van het verloop.
Veel van onze mechanistische begrip van chemotaxis werd mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van fluorescently-tagged biosensoren voor verschillende onderdelen van de regulerende netwerken. Vele chemotaxis toezichthouders hebben een asymmetrische verdeling van de regelgevende molecuul zelf of haar activiteit. Bijvoorbeeld, biosensoren die herkent geactiveerd versies van kleine GTPases Ras en Rap1-Ras-bindende domeinen van Raf1 (hierna aangeduid als RBD hier) en RalGDS, respectievelijk – lokaliseren naar de voorrand van een chemotaxing cel2,3. Evenzo PI3K en haar product phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), erkend door een pleckstrin-homologie (PH) domein, Toon ook lokalisatie aan de voorzijde van een cel4,5. In tegenstelling, een 3-fosfatase-PTEN, die worden omgezet in PIP3 terug phosphatidylinositol (4,5)-difosfaat, lokaliseert aan de rand van de achterstand van de cel-6. Nog belangrijker is, is deze biosensoren wijzigen hun lokalisatie in reactie op de wereldwijde stimulatie met een chemoattractant. Leading edge markers, die cytosolische of op de toppen van de uitsteeksels in een cel rusten, relocalize naar de cortex, overwegende dat achtergebleven rand markeringen, die corticale lokalisatie en zijn afwezig vanaf de toppen van de uitsteeksels in een cel rusten, worden cytosolische na stimulatie. Analyse van biosensor distributie in reactie op de wereldwijde stimulatie met een chemoattractant minimaliseert de bijdrage van de motiliteit en polariteit, die vaak de opmerkingen verwarren. Globale of uniforme stimulatie van een celsuspensie met een chemoattractant wordt ook gebruikt als een instrument voor het beoordelen van wijzigingen voor de gehele bevolking in eiwit activering, vaak gedetecteerd door proteïne fosforylatie7,8,9 . Deze biochemische bepaling wordt voornamelijk gebruikt voor temporele informatie, terwijl microscopie wordt gebruikt om zowel temporele en ruimtelijke informatie verzamelen over het gedrag van verschillende onderdelen van de regulerende netwerken.
Het signaaltransductie netwerk omvat functies van een prikkelbaar systeem10,11. Reacties op supra-drempel Chemotactische stimuli zijn "all-or-none" en vuurvaste punten weergegeven. Reacties zijn ook stochastically geactiveerd en oscillerende gedrag kunnen tonen. Signaaltransductie gebeurtenissen zijn gelokaliseerd aan regio's van de cortex die als golven12,13,14,15 verspreiden. Voorste, terug, markeringen worden gerekruteerd voor of distantiëren van, de actieve zones van het teeltmateriaal golven. Als gevolg van de achterstand van de actieve zone vuurvaste regio vernietigen de tegengesteld gerichte golven als ze elkaar ontmoeten. Het teeltmateriaal signaaltransductie golven ten grondslag liggen aan de cellulaire uitsteeksels die cel migratie10bemiddelen.
Veel van de bovengenoemde informatie over chemotaxis kwam van de studies op de sociale Amoebe Dictyostelium discoideum, hoewel soortgelijke regulerende mechanismen zijn ook van toepassing op de neutrofielen en andere zoogdieren cel typen16 . Dictyostelium is een reeds lang gevestigde modelorganisme dat een robuuste Chemotactische reactie tijdens hongersnood, heeft wanneer duizenden afzonderlijke cellen naar een aggregatie midden migreren, uiteindelijk de vorming van een meercellig fruiting body met sporen. Chemotaxis is ook essentieel in de fase van de eencellige groei van dit organisme voor het lokaliseren van bacteriële voedselbronnen. Belangrijker, is migratie van afzonderlijke Dictyostelium cellen opvallend vergelijkbaar met de migratie van zoogdieren neutrofielen of metastatische kankercellen, die allemaal zeer snelle Wortelpotigen-type migratie ondergaan. In feite, worden zowel de algemene topologie van de regulerende netwerken, evenals veel van de individuele signaaltransductie trajecten die betrokken zijn bij chemotaxis bewaard tussen Dictyostelium en zoogdieren leukocyten17. Bovendien andere cellen, zoals fibroblasten, receptor tyrosine kinases (RTK) gebruiken in plaats van GPCRs; RTKs kunnen echter voeden in soortgelijke netwerken.
In tegenstelling tot chemotaxis ontbreekt grondig inzicht in de signalering mechanismen die verschillende andere vervoerswijzen gestuurde migratie rijden. Ook naar cellen migreren in een chemoattractant verloop verscheidene studies hebben gemeld activering en/of de lokalisatie van typische voorrand markers, met inbegrip van actine polymerisatie, PIP3 en/of extracellulaire signaal-gereglementeerde kinase (ERK) 1/2, op de voorkant van cellen ondergaan regisseerde migratie in reactie op stroom of veranderingen in elektrische velden18,19,20,21schuintrekken. Echter, in deze studies continue blootstelling aan de prikkel ook resulteerde in cel migratie, bloot de vraag, bijvoorbeeld, de toonaangevende markers lokaliseren speciaal in reactie op een prikkel, of als ze gewoon lokaliseren op de voorrand vanwege toegenomen aantal pseudopods aan de voorzijde van een migreren cel.
We ontwikkeld testen die ons toelaten te observeren de reactie van cellen op acute mechanische perturbation geleverd als schuintrekken stroom zowel op het bevolkingsniveau en als afzonderlijke cellen22. Vergelijkbaar met de globale stimulatie met een chemoattractant, acute stimulation met schuintrekken stroom maakt de studie van een cellulaire reactie op een mechanische prikkel zonder de storende bijdrage van beweeglijkheid of polariteit. Deze biochemische en microscopische tests te combineren met genetische of farmacologische verstoringen ons toelaat om te leren over hoe mechanische stimuli worden waargenomen en verzonden. Bovendien biedt deze aanpak ook een nieuwe methode voor te tikken in het systeem stroomafwaarts van de chemoattractant receptor in het ontbreken van een chemoattractant, waardoor het isoleren van de netwerken van de signaal transductie en actine de cytoskelet van de receptor/G eiwit netwerk.
Met behulp van de technieken die hieronder we onlangs aangetoond dat acute shear stress leidt tot activatie van meerdere onderdelen van de Chemotactische signaal transductie en actine cytoskelet netwerken22. Door de acute mechanische stimulus toe te passen op verschillende tijdstippen, we laten zien dat ook aan chemoattractants, reactie op mechanische stimuli ook kenmerken van een prikkelbaar systeem vertoont, met inbegrip van het all-or-none gedrag van de reactie onder verzadigen van de voorwaarden en de aanwezigheid van een refractaire periode. Tot slot, door een combinatie van mechanische en chemische stimulatie we bleek dat de twee prikkels aandeel signaal transductie en actine cytoskelet netwerken, waardoor waarschijnlijk voor de integratie van meerdere stimuli bias cel migratie.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Gebruik voor het bereiden van HL-5 media en SM platen (stappen 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Proteose pepton</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Gebruik voor het bereiden van HL-5 media (stap 1.1)</td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Gebruik voor het bereiden van HL-5 media en SM platen (stappen 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van HL-5 media en 10X fosfaat buffer (stappen 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van HL-5 media, SM platen en 10X fosfaat buffer (stappen 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomycine (dihydrostreptomycine sulfaat)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Gebruik voor het bereiden van HL-5 media (stap 1.1)</td></tr><tr><td>Pepton (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Gebruik voor het bereiden van SM platen (stap 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Gebruik voor het bereiden van SM platen (stap 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van SM platen (stap 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van DB buffer (stap 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van DB buffer (stap 1.4)</td></tr><tr><td>Caffeïne</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van caffeïne (stap 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclisch Monofosfaat, Natriumzout)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Gebruik voor het bereiden van cAMP (stap 1.6)</td></tr><tr><td>Foliumzuur</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Gebruik voor het bereiden van foliumzuur (stap 1.7)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)</td></tr><tr><td>Natrium dodecylsulfaat (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)</td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Gebruik voor het bereiden van 3X sample buffer (stap 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Gebruik voor het bereiden van sample buffer met protease en fosfataseremmers (stap 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Gebruik voor het bereiden van sample buffer met protease en fosfataseremmers (stap 1.8)</td></tr><tr><td>Natriumpyrofosfaat decahydraat</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Gebruik voor het bereiden van sample buffer met protease en fosfataseremmers (stap 1.8)</td></tr><tr><td>Complete EDTA-vrije protease remmer cocktail (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Gebruik voor het bereiden van sample buffer met protease en fosfataseremmers (stap 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculine A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Gebruik voor het bereiden van Latrunculine A (stap 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)</td></tr><tr><td>Polyvinylideenfluoride membraan</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Konijnen antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>2060</td><td>Primair antilichaam voor gebruik in immunoblotting (stap 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Primair antilichaam voor gebruik in immunoblotting (stap 3.3)</td></tr><tr><td>Konijnen IgG HRP Gekoppeld Heel Ab (van Ezel)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Secundair antilichaam voor gebruik in immunoblotting (stap 3.3)</td></tr><tr><td>Verbeterde chemiluminescentie substraat (Clarity Western ECL Substraat)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)</td></tr><tr><td>Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Gebruik voor immunoblotting (stap 3.3)</td></tr><tr><td>K. aerogenes stam (niet-pathogeen)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Materialen en apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitale shaker (model G-33, of een vergelijkbaar alternatief)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Gebruik voor het kweken van K. aerogenes (stap 2.1.1), en voor het basaleren en stimuleren van D. discoideum cellen (stap 3). De gyroradius van deze shaker is 9,5 mm.</td></tr><tr><td>10 cm Petri schotel</td>

beoordeling van dictyostelium discoideum reactie op acute mechanische stimulatie

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, of de migratie van een verloop van een chemoattractant, is het best te begrijpen wijze van gestuurde migratie. Studies met behulp van sociale amoeba Dictyostelium discoideum bleek dat een complex signaaltransductie netwerk van parallelle trajecten de respons op chemoattractants versterkt, en leidt tot vooringenomen actine polymerisatie en uitsteeksel van een pseudopod in de richting van een verloop. Moleculaire mechanismen rijden van andere soorten gestuurde migratie, bijvoorbeeld als gevolg van blootstelling aan het schuintrekken stroom of elektrische velden, zijn daarentegen niet bekend. Vele regulatoren van chemotaxis vertonen lokalisatie bij de regelafstand of de achterblijvende hoek van een cel, migreren, evenals tijdelijke wijzigingen worden weergegeven in de lokalisatie of activering na globale stimulatie met een chemoattractant. Om te begrijpen van de moleculaire mechanismen van andere soorten gestuurde migratie ontwikkelden we een methode waarmee onderzoek van cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie op basis van korte (2-5 s) blootstelling aan stroom schuintrekken. Deze stimulatie kan geleverd worden in een kanaal terwijl imaging cellen uiten fluorescently-geëtiketteerden biosensoren te onderzoeken van de individuele cel gedrag. Bovendien kan celpopulatie worden gestimuleerd in een plaat, lysed, en immunoblotted met behulp van antilichamen die actieve versies van proteïnen van belang herkent. Door het combineren van beide tests, kan men een breed scala van moleculen geactiveerd door veranderingen in subcellular localisatie en/of fosforylatie onderzoeken. Using zulks werkwijze vastbesloten wij dat acute mechanische stimulatie activering van de Chemotactische signaal transductie en actine cytoskelet netwerken activeert. De mogelijkheid te onderzoeken van cellulaire reacties op acute mechanische stimulatie is belangrijk voor het begrijpen van de initiatiefnemende gebeurtenissen nodig zijn voor de beweeglijkheid van de stroom-geïnduceerde schuintrekken. Deze aanpak biedt een instrument voor de studie van de Chemotactische signaaltransductie netwerk zonder de storende invloed van de chemoattractant receptor.

Temporele reactie van chemotaxis regelgevers op acute mechanische stimulatie
Om te beoordelen van de reactie van D. discoideum cellen op mechanische stimulatie, werden aanhangend aggregatie-bevoegde cellen blootgesteld aan een korte puls van shear stroom. Aggregatie-bevoegde D. discoideum cellen afscheiden kamp, dat kan worden gevoeld door naburige cellen. Om te overwinnen de bijdrage van signalering van cel-cel, ...

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Het algemene doel van deze procedure is om de activiteit van verschillende componenten van het intracellulaire signaaltransductienetwerk te onderzoeken na een korte mechanische verstoring. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celmigratie, zoals hoe cellen omgevingssignalen detecteren en directioneel migreren naar diverse omgevingssignalen, inclusief mechanische stimuli. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeker in staat stelt de initiële respons op mechanische stimulus te onderzoeken zonder de storende bijdrage van mobiliteit of polariteit aan de respons.We hadden het idee voor deze methode toen we de respons van adhesieve cellen op chemoattractant testten, die werd afgeleverd met een lichte agitatie, en we merkten een robuuste respons van cellen die werden gestimuleerd met voertuigcontrole. Om te beginnen, bereid Klebsiella aerogenes voor door een kleine hoeveelheid cellen uit een bevroren voorraad in HL5-medium zonder antibiotica te inoculeren en de cultuur overnacht te incuberen. De groei van Dictyostelium in de aanwezigheid van Klebsiella aerogenes-bacteriën zal het aantal macropinosomen verminderen, wat de responsiviteit van de cellen op externe stimuli zal verbeteren.Tijd het experiment zo dat wanneer de bacteriën klaar zijn, er Dictyostelium exponentieel groeit. Verzamel deze Dictyostelium-cellen en tel ze met behulp van een hemocytometer. Verspreid vervolgens 260 microliter van de bacteriële suspensie die 100.000 Dictyostelium-cellen bevat op een SM-plaat.Ook ter zekerheid, bereid platen voor met tweemaal zoveel en half zo veel Dictyostelium-cellen. Na een dag groeien bij kamertemperatuur, draai de plaat om en blijf de plaat kweken totdat de Dictyostelium-cellen de bacteriële lawn beginnen te verwijderen, maar nog niet zijn begonnen met aggregatie. Voeg vervolgens vijf milliliter DB-buffer toe aan de plaat en schraap de Dictyostelium met een glazen spreider af.Breng de cellen en oplossing over in een 50 milliliter polypropyleenbuis, spoel de plaat daarna met nog eens vijf milliliter DB en voeg dit ook toe aan de 50 milliliter buis. Herhaal indien nodig. Om de Dictyostelium te wassen, breng de buis tot 50 milliliter met DB, pellet de cellen en aspibeer en gooi het supernatant weg.Was de cellen herhaaldelijk totdat het supernatant helder is. Eindelijk, suspendeer de Dictyostelium in DB-buffer tot ongeveer vijf miljoen cellen per milliliter. Om te beginnen, plateer twee miljoen aggregatie-competente Dictyostelium op 35 millimeter schalen met twee milliliter DB. Bereid een plaat voor voor elk tijdstip en een niet-gestimuleerde controle.Laat de cellen bij kamertemperatuur 10 minuten om aan de plaat te hechten. Was vervolgens de niet-bevestigde cellen van de plaat af met twee spoelingen met één milliliter DB. Zodra de platen zijn ontdaan van niet-bevestigde Dictyostelium, incubeer de bevestigde cellen in basolatiebuffer gedurende 30 minuten zonder de platen te verstoren. Het is erg belangrijk om elke beweging van de platen tijdens de incubatie van een half uur te vermijden om voortijdige stimulatie van de cellen te voorkomen.Nu, om een gecontroleerde hoeveelheid mechanische stimulatie toe te passen, breng individueel een plaat over naar een orbitaal shaker en laat de shaker gedurende vijf seconden draaien met 150 tpm. Vervolgens, na de gewenste tijd, zuig de buffer af en zet de plaat onmiddellijk op ijs. Voeg onmiddellijk 100 microliter monsterbuffer met protease en fosfataseremmers toe en schraap de cellen af.Verzamel het lysate in 1,5 milliliter buisjes en verwarm ze onmiddellijk gedurende 10 minuten op 95 graden Celsius. Ga door met het analyseren van het lysate of breng ze over naar min 20 graden Celsius voor opslag. Na het maken van suspensies van vegetatieve of aggregatie-competente cellen, laad ongeveer 600 microliter in de microfluïdische kamerschaal.De inlaten moeten volledig worden gevuld, dus vul ze zo nodig met buffer aan. Laat de cellen 10 minuten hechten. Verbind een invoerlijn voor het apparaat met een elektronische pomp met een reservoir van 15 milliliter.Gebruik softwarecontrole voor de pomp, sluit de klep en vul vervolgens het reservoir met DB. Zet nu de druk op 50 mbar en zet de pomp aan. Vul en spoel de leiding met DB door op de klep te klikken om deze te openen. Na ongeveer 30 seconden spoelen, zet de druk terug op nul en sluit de klep.Verbind vervolgens de leiding met een van de drie inlaten aan één kant van de schaal. Vang geen luchtbellen op en zodra de verbinding is gemaakt, bedek de andere twee inlaten aan die kant van de schaal. Voltooi nu de installatie door de leiding van de afvoer naar de enkele uitlaat aan de andere kant van de schaal te verbinden.Bekijk vervolgens de kanaal met een 20X luchtobjectief onder een lichtveld- of faseverlichting op een fluorescentiemicroscoop en spoel het kanaal. Zet vervolgens de druk op ongeveer 50 mbar en open de klep. Zodra de vloeistof uit de afvoer komt, zet de externe druk terug op nul, wacht ongeveer 30 seconden en sluit de klep.Schakel vervolgens over naar het 40X oliënobjectief, focus op het breedste deel van het kanaal en bereid de software voor om elke drie seconden afbeeldingen te verzamelen met RFP- of GFP-verlichting. Met de klep gesloten, zet de druk op de gewenste waarde. Verzamel vervolgens vijf pre-stimulatie-afbeeldingen met tussenpozen van drie seconden.Open vervolgens kort de klep om de stimulus te leveren. Verzamel nu ten minste 15 meer frames van gegevens gedurende 45 seconden. Kwantificeer de respons zoals beschreven in het tekstprotocol.Laad eerst een microfluïdische schaal met Dictyostelium zoals beschreven in de vorige sectie. Bereid voor dit experiment twee invoerlijnen voor. Gebruik een fysieke klem op de lijn die de behandelingsoplossing transporteert en de softwaregestuurde klep om de lijn die de DB-oplossing met voertuig transporteert te sluiten.Vul nu de twee lijnen met de juiste

assessment-dictyostelium-discoideum-response-to-acute-mechanical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Toepassing van elektrofysiologie toegankelijke synapsen biedt een kwantificeerbare maat van synaptische activiteit, nuttig bij het analyseren van synaptische mutanten. Dit artikel beschrijft een dissectie methode die wordt gebruikt om de neuromusculaire verbindingen (NMJ) van...

Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

Infectie van de prostaat kan een bijdragende factor in het bemiddelen bekken pijn bij chronische prostatitis zijn. We beschrijven de procedure voor het bereiden van gestandaardiseerde bacterieel inoculum, instillatie van bacteriën in de urethra van mannelijke muizen en methode voor het meten tactiele allodynie bij muizen in de tijd.

Meting van Tactiele allodynie in een muizenmodel van bacteriële prostatitis

Een protocol wordt beschreven dat gebruikt anoxie / uithongering C. elegans model ischemie / reperfusie. Functionele resultaten omvatten een verhoogde mortaliteit, zichtbare afwijkingen in GFP-gelabelde neuronale processen, en verminderde gedragsreacties die neuronale functie nodig hebt.

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; C. elegans</em

Deze video toont een protocol voor het uitvoeren van elektrofysiologische opnames van enkele vezels op een in vitro muis colorectum-zenuwpreparaat.

In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings

Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

Abnormale sensorische functie ten grondslag ligt aan viscerale pijn en andere symptomen van functionele en inflammatoire darmziekten. Een protocol voor het elektrofysiologische opname van de Colon afferent zenuwen in een ex vivo -voorbereiding van het rat-colorectum wordt hier gepresenteerd.

In Vitro Karakterisering van de elektrofysiologische eigenschappen van Colon Afferent vezels in ratten

Nieuwe hulpmiddelen voor het mechanobiology onderzoek nodig zijn om te begrijpen hoe mechanische spanning activeert biochemische paden en lokt biologische reacties. Hier presenteren we een nieuwe methode voor selectief mechanische stimulatie van geïmmobiliseerdet dieren met een val van de microfluidic waardoor hoge resolutie beeldvorming van cellulaire reacties.

Met behulp van een Microfluidics apparaat voor mechanische stimulatie en hoge resolutie Imaging van C. elegans

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe een verbeterde test voor mechanische nociceptie in Drosophila-larven kan worden uitgevoerd. We gebruiken de test hier om aan te tonen dat mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) bestaat in Drosophila-larven.

Een verbeterde test en tools voor het meten van mechanische nociceptie in Drosophila-larven

Verken de reactie van Dictyostelium discoideum op acute mechanische stimulatie met behulp van microscopische biosensorlokalisatie en eiwitactivering. Deze methode isoleert de initiële cellulaire respons zonder verstoring door mobiliteit.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Meer video's verkennen