Een methode voor de bepaling en simulatie van permeabiliteit en verspreiding in een Model van 3D weefsel in een membraan invoegen systeem voor multi goed platen
23 februari 2018
Een methode voor de bepaling van de permeabiliteit in een membraan invoegen systeem voor multi goed platen en in silico parameter optimalisatie voor de berekening van diffusie coëfficiënten met behulp van de simulatie worden gepresenteerd.
Het algemene doel van dit protocol is om de permeabiliteit en diffusiecoefficienten van 3D-huidmodellen in een klein membraaninsertaatsysteem te bepalen. Deze zaken kunnen helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over 3D-huidweefselengineering voor farmaceutische en cosmetische toepassingen waarbij de permeabiliteit en diffusiecoefficient essentiële kwaliteitsfactoren zijn. Het grote voordeel van deze techniek is dat het directe meting van deze coëfficiënten mogelijk maakt binnen een kleine multi-well insetaat.
Het kleine membraaninsertaatsysteem in de simulatie kan verder worden aangepast voor gebruik in organen op scheepsapparaten en andere toepassingen die membraaninsertaatsystemen gebruiken. Om een agarosegel voor te bereiden, brengt u eerst 28,6 microliter vers bereide 80 graden Celsius vloeibare agarosegel aan op elke membraan van een 96-well membraaninsertaatsysteem. Na 10 minuten is de gel gestold en kan deze worden gebruikt voor een permeabiliteitstest.
Om een collageencelmodel voor te bereiden, mengt u eerst 125 microliter HBSS en een milliliter collageen R-oplossing op ijs, gevolgd door neutralisatie met natriumhydroxide. Voeg vervolgens 125 microliter primaire fibroblasten opgehangen in compleet medium toe aan het mengsel. Voeg 28,6 microliter van de resulterende celoplossing toe aan elke put van een nieuw 96-well membraaninsertaatsysteem.
Na 30 minuten in een cellenkweekincubator, voegt u 75 microliter compleet medium toe aan het oppervlak van de gel en 300 microliter compleet medium aan de bodem van elke put voor een nachtelijke incubatie in de cellenkweekincubator. De volgende dag vervangt u het medium door 75 microliter humane volwassen laag-calcium, hoge temperatuur keratinocyten voor elk collageencelmodel en plaatst u de plaat weer in de cellenkweekincubator voor nog drie dagen. Op de vierde dag, zuigt u het medium van het oppervlak van het celmodel af en plaatst u de plaat weer in de incubator voor nog zeven dagen.
Om een permeabiliteitstest uit te voeren, doseert u 75 microliter donorsubstantie in een klein-well insetaatmodelsysteem van belang en voegt u 300 microliter acceptorsubstantie toe aan de bodem van elke put. Plaats de plaat op een schudder bij 37 graden Celsius, 95 procent vochtigheid, en ongeveer 480 RPM gedurende vijf uur, en brengt u het membraaninsertaatsysteem eenmaal per uur over naar een lege 96-well plaat en meet u de gediffuseerde fluorescentie in de bodemputten van de experimentele plaat op een plaatlezer. Aan het einde van het permeabiliteitsexperiment, opent u de juiste modelsoftware en start u een nieuw model.
Selecteer Model Wizard en 3D-model. Voeg Transport van Verdunde Soorten toe en klik op studie. Selecteer vervolgens Tijdsafhankelijk en klik op klaar.
Onder Globale Definities, klikt u met de rechtermuisknop om parameters toe te voegen en voert u de geometrische en fysische parameters in de raster in. Stel de geometrie van het membraaninsertaatsysteem in vanuit de experimenten, en klik met de rechtermuisknop op Definities om twee domeinpeilingen toe te voegen, waarbij u één peiling als acceptordomein selecteert en de andere als donordomein. Stel beide domeinen in om te gemiddel met een expressie C en eenheid van mol per meter kubiek.
En stel de diffusiecoefficient in onder transporteigenschappen een en transport van verdunde soorten. Klik met de rechtermuisknop op transport van verdunde soorten om een tweede transporteigenschap twee toe te voegen en selecteer de tweede barrière in de domeinselectie. Onder transport van verdunde soorten, voor initiële waarden een, definieert u de concentratie als nul.
Klik met de rechtermuisknop op transport van verdunde soorten om een tweede initiële waarden twee toe te voegen en selecteer de donor als de derde domein. Stel de concentratie in als de initiële concentratie van de fluorescerende donorsubstantie. Klik met de rechtermuisknop op transport van verdunde soorten om symmetrie een toe te voegen en selecteer alle oppervlakken van de grensselectie die de volledige geometrie spiegelen.
Klik met de rechtermuisknop op mesh om twee vrije tetraëders toe te voegen en stel de tweede barrière in als domein. Klik met de rechtermuisknop op vrije tetraëder een om de grootte van het vooraf gedefinieerde mesh toe te voegen tot extra-fijn. In de tweede vrije tetraëder, stel de acceptor en donor in als domeinen en de vooraf gedefinieerde mesh tot fijner.
Vervolgens klikt u onder studie een op berekenen om de simulatie te starten. Om de diffusiecoefficient aan te passen aan de gegevens gegenereerd door de diffusiesimulatie, opent u het menu add psychic en selecteert u wiskunde. Zoek optimalisatie en gevoeligheid.
Selecteer optimalisatie en klik op toevoegen aan component. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op definities om variabelen toe te voegen en voer handmatig de variabelen uit tabel drie in. Klik vervolgens onder het componentkoppelmenu met de rechtermuisknop op definities, voeg gemiddelde een toe gevolgd door de handmatige toevoeging van de acceptor als de operatornaam en selecteer domein een.
Exporteer de experimentele gegevens naar een nieuw tekstdocument. Gebruik een puntkomma om de gegevens in kolommen te scheiden en een regeleinde om de gegevens in rijen te scheiden. Klik met de rechtermuisknop op optimalisatie om het globale kleinste kwadraten objectief toe te voegen en voeg het tekstdocument toe aan de experimentele gegevens.
Klik op globale kleinste kwadraten objectief om de eerste kolom te definiëren als tijdkolom een en de tweede kolom als waardekolom een. Voer in de expressie van de waardekolom de variabele C in. Klik met de rechtermuisknop op optimalisatie om globale controlevariabelen een toe te voegen. En verklaar D underscore search als een variabele met een initiële waarde van een, een ondergrens van nul en een bovengrens van 1.000.
Klik met de rechtermuisknop op studie een om optimalisatie toe te voegen. En selecteer SNOPT als een optimalisatieoplossermethode. Stel de optimaliteitstolerantie in op een tot de macht van min acht.
Stel vervolgens de diffusiecoefficient op de barrière in op D.Stel de simulatietijd in onder studie instelling in van nul seconden to
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het bepalen van de permeabiliteit en diffusiecoefficienten van 3D-huidmodellen met behulp van een klein membraaninsert-systeem. Deze techniek is cruciaal voor het bevorderen van 3D-huidweefseltechniek in farmaceutische en cosmetische toepassingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Weefseltechniek
Achtergrond
- Het begrijpen van permeabiliteit en diffusiecoefficienten is essentieel voor het evalueren van huidmodellen.
- 3D-huidweefseltechniek is van vitaal belang voor farmaceutische en cosmetische toepassingen.
- Het kleine membraaninsert-systeem maakt directe meting van deze coefficienten mogelijk.
- Deze methode kan worden aangepast voor organ-on-a-chip-apparaten.
Doel van het onderzoek
- Om permeabiliteit en diffusiecoefficienten in 3D-huidmodellen te meten.
- Om parameters voor diffusiesimulaties te optimaliseren.
- Om de kwaliteit van huidweefseltechniektoepassingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van agarosegel en collageencelmodellen in een 96-well membraaninsert-systeem.
- Uitvoeren van permeabiliteitstesten met donor- en acceptorstoffen.
- Gebruik van modelleringssoftware voor simulatie en parameteroptimalisatie.
- Histologische analyse om de integriteit van het celmodel te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van diffusiecoefficienten in de 3D-huidmodellen.
- Verificatie van de invloed van molecuulgrootte op permeabiliteit.
- Optimalisatie van parameters voor nauwkeurige diffusiesimulaties.
- Histolologische analyse toonde geschikte celmodelkenmerken.
Conclusies
- Het membraaninsert-systeem is effectief voor permeabiliteitstesten.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende toepassingen in weefseltechniek.
- Verdere optimalisatie kan de nauwkeurigheid van diffusiecoefficientberekeningen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct measurement of permeability and diffusion coefficients in 3D skin models using a small membrane insert system, addressing a key bottleneck in early-stage substance screening. By providing quantitative, reproducible data in a multi-well format, it supports target validation and assay development for topical and systemic drug candidates. The integrated simulation capability reduces experimental burden while enhancing predictive confidence in permeation behavior across molecular sizes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying substance permeation through skin-equivalent models.
- Operational Value: Provides functional validation of barrier properties in 3D tissue models without requiring large-scale Franz diffusion cells.
- Predictive Value: Supports lead identification by ranking compounds based on permeability coefficients derived from empirical data.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, quantitative permeability outputs suitable for high-throughput screening in 96-well formats.
- Reproducibility: Ensures consistent diffusion measurements through controlled boundary conditions and normalized acceptor/donor domain probing.
- Scalability: Adaptable to different insert diameters (4.26 mm and 12.2 mm) and extensible to organ-on-a-chip configurations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses collagen-cell models with fibroblasts and keratinocytes to mimic human skin architecture for mechanistic de-risking.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by simulating long-term permeation profiles from short-term assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables permeability-based go/no-go criteria prior to in vivo testing, reducing late-stage attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early biological screening to lead optimization, particularly for dermal and transdermal drug delivery programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on barrier function and molecular transport in engineered tissues.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible fluorescence-based quantification in acceptor chambers.
- Analytics: Generates time-resolved concentration data for diffusion coefficient optimization via global least squares fitting.
- Translational Research: Connects short-term permeability measurements to predictive modeling of long-term substance retention.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable simulation-experimental workflow applicable across multiple permeation devices and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in permeation pathways by correlating molecular size with diffusion behavior.
- Operational Value: Standardizes permeability testing across laboratories via defined gel preparation, incubation, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent use and instrument time through simulation-guided experimentation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of topical formulations based on validated permeability thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, fluorescence-based assays, and computational modeling (e.g., COMSOL).
- Depends on plate readers, shakers with precise RPM control, and membrane insert systems compatible with 96-well formats.
- Necessitates cross-team standardization of substance concentration, temperature, humidity, and incubation timing.
- Involves adaptation considerations when extending to complex models such as organ-on-a-chip or multi-layered tissues.
- Limited by simulation accuracy for substances exceeding 14 x 10^-10 m Stokes radius, as noted in divergence between model and experimental data.
