Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Het algemene doel van deze procedure is om de extracellulaire matrix van het hart te verwerken tot een hydrogel, waardoor het mogelijk wordt om het effect van de matrix in verschillende op cellen gebaseerde assays te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het hartveld te beantwoorden, zoals hoe de extracellulaire matrix het celgedrag beïnvloedt. Het grote voordeel van deze techniek is dat het het gebruik van de extracellulaire matrix mogelijk maakt om grootschalige experimenten in vitro of in vivo uit te voeren.

De toepassingen van deze techniek kunnen worden uitgebreid tot een therapie voor myocardinfarct omdat de matrix essentiële overlevingssignalen kan bieden. Om het experiment te beginnen, gebruikt u een steriele scalpel met een bladnummer tien om vetweefsel van een eerder verkregen linkerventrikelmyocardium te verwijderen. Snijd het myocardium in blokjes van ongeveer 1 bij 1 bij 1 cm, met behulp van een scalpel.

Plaats vervolgens de blokjes in een steriele 50 mL buis. Bewaar de buizen met de blokjes bij 80 graden Celsius. Haal de buis met de voorbereide blokjes uit de vriezer en transporteer deze op ijs naar de cryostaat.

Stel de object- en kamertemperatuur van de cryostaat in op 15 graden Celsius. Koel lege 50 mL buizen en stempels in de kamer af. Voeg een laag cryosectiemedium toe aan de koude stempel en laat het bevriezen tot het wit en stevig is.

Voeg een tweede laag cryosectiemedium toe en plaats een myocardiumbuis in de tweede laag. Zorg ervoor dat het cryosectiemedium en myocardium volledig bevroren zijn. Plaats vervolgens de stempel met bevroren myocardium in de houder en draai alle schroeven vast.

Trim het oppervlak van het weefsel tot een gelijkmatige doorsnijdingsoppervlak is verkregen. Snijd het bevroren myocardium met automatische doorsneden om uniforme snijsecties te garanderen. Ongeveer 30 tot 40 secties kunnen van één blokje worden gesneden.

Plaats elke plak, na doorsnijden, losjes in een voorgekoelde 50 mL buis. Sluit de gevulde buizen en plaats ze op ijs. Breng de bevroren secties van alle 50 mL buizen over in één steriele beker.

Voeg 50 mL lyse-oplossing toe per 50 mL buis met myocardiumsnijsel. Schud vervolgens de myocardiumsnijsel in een steriele beker. Zeef de vloeistof met de weefselsnijsel door een grove zeef.

Breng vervolgens de weefselsnijsel met een stompe pincet over naar een nieuwe steriele beker. Voeg 50 mL 0,5%SDS in PBS toe per aanvankelijke 50 mL buis myocardiumsnijsel. Schud de beker continu gedurende zes uur bij 100-150 rpm bij kamertemperatuur.

Na het schudden, zeef de vloeistof met de weefselsnijsel door een grove zeef. Gebruik stompe pincet om de weefselsnijsel over te brengen naar een nieuwe steriele beker en was de snijsels drie keer met 50 mL PBS. Was vervolgens de snijsels een nacht lang in PBS, met 1%penicilline-streptomycine en 1%nystatine.

De volgende dag verwijdert u de wasoplossing en voegt u 25 mL FBS toe, voorverwarmd op 37 graden Celsius met 1%penicilline-streptomycine en 1%nystatine, aan de gedecellulariseerde snijsels per aanvankelijke 50 mL buis myocardiumsnijsel. Incubeer de snijsels gedurende drie uur bij 37 graden Celsius om alle resterende DNA uit de matrix te verwijderen. Breng vervolgens de snijsels over naar een nieuwe steriele beker en was ze drie keer met 50 mL PBS.

Plaats de ECM-snijsels losjes in een nieuwe steriele zes-well plate. Bevries de ECM bij 80 graden Celsius en lyofilisaat gedurende twee dagen in een lyofilisator. Gebruik voor het verpulveren van de ECM-snijsel molenbuizen met 1,4 mm keramische korrels.

Vul de buizen losjes met lyofilisaat ECM, met behulp van steriele, stompe pincet. Bevries de buizen snel in vloeibare stikstof. Plaats de bevroren buizen in de molen en verpulver de ECM.

Stel de duur in op 30 seconden, pas de maximale snelheid aan en start het apparaat. Na verpulvering, haal de buizen eruit en bevries ze opnieuw in vloeibare stikstof. Was de microdeeltjes uit de buizen door 1 mL ddH20 per buis toe te voegen en schudden voor volledige oplossing.

Zeef vervolgens de heterogene oplossing door 200 micrometer gaas, in een 50 mL buis. Bevries de buis in vloeibare stikstof. Vervang het standaard deksel van de buis door een 0,22 micrometer filter om te voorkomen dat het poeder uit de buis stroomt.

Plaats de buis in de lyofilisator en lyofilisaat opnieuw om het water uit de wasstap te verwijderen. Los het eerder bereide lyofilisaat humane ECM-poeder op in pepsine-oplossing, tot een eindconcentratie van 10 mg per mL. Breng de oplossing over in 2 mL buizen met een volume van 1 mL per buis.

Pipetteer de oplossing om grondig te mengen. Plaats vervolgens de buizen in de shaker en schud gedurende 48 uur bij 1200 rpm bij 27 graden Celsius. Haal de buizen uit de shaker en plaats ze op ijs of een voorgekoelde buishouder.

Meng 1/9 van het volume van de ECM-oplossing van koud 10X PBS, met 1/10 van een volume ECM-oplossing van koud 0,1 molair natriumhydroxide, in een voorgekoelde buis en plaats deze op ijs om de gedigeerde ECM-oplossing te neutraliseren en het pepsine te inactiveren. Voeg ten slotte de ECM-oplossing toe aan het neutralisatiemengsel en meng grondig door middel van pipetteren of vortexen. Kwantitatieve assays voor individuele ECM-componenten toonden een meer complete DNA-verwijdering en betere bewaring van totaal collageen, elastine en glycosaminoglycanen aan, vergeleken met decellularisatie door SDS, alleen.

RT-PCR werd gebruikt om de expressie van structurele cardiomyocyt-eiwitten, vroege en late cardiomyogene transcriptiefactoren en endothelecellenoppervlaktemarkeringsgenen te kwant