Name: Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34+ cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Leer hoe je CD34-positieve cellen isoleert uit navelstrengbloed om megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjesvorming te bestuderen. Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor hematologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de steun van de Australische Health and Medical Research Council (project subsidie 1012409 gekoppeld aan BHC).

Dit protocol werd goedgekeurd door de zuid-oostelijke Sydney menselijke ethiek Commissie onderzoek en door de Commissie van de ethiek van het onderzoek van de Universiteit van New South Wales het menselijke geratificeerd. Navelstrengbloed verkregen van gezonde donoren werd verstrekt door de Sydney navelstrengbloed Bank (Sydney, NSW, Australië). Volumes van ongeveer 100 mL werden gebruikt voor deze procedure.
Let op: Brei in een klasse II bioveiligheid kabinet met behulp van aseptische techniek. Ontsmetten van de buitenkant van de koord bloed zak met 70% ethanol. Steriele instrumenten (schaar, pincet) gebruik voor deze procedure.
1. aansluitsnoer bloedcel voorbereiding en isolatie van CD34+ cellen
<ol>
	<li>Bereiden steriele scheiding buffer (SB) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,2 en met 0,5% boviene serum albumine en 2 mM EDTA.</li>
	<li>Breng in een conische tube van 50 mL (één tube per 10 mL bloed is vereist) 10 mL van SB. Met behulp van een G18 botte naald gemonteerd op een 10 mL spuit, 10 mL bloed trekken uit de zak en afzien in de 50 mL tubes met 10 mL SB.</li>
	<li>Voeg toe 15 mL lymfocyt scheiding media (Zie Tabel van materialen) naar de onderkant van de buis met het verdunde bloed, twee lagen maken. Opmerking: Afzien media langzaam aan de onderkant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de verschillende lagen.</li>
	<li>Centrifugeer buizen bij 1200 × g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) met geen pauze en geen versnelling.</li>
	<li>Overdracht van de laag in de buurt van het midden van de buis met mononucleaire cellen (ongeveer 5-10 mL uit elke buis) in een nieuwe tube van 50 mL, met behulp van een precisiepipet Pasteur. SB toevoegen aan elke buis tot een totaal volume van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 minuten op RT. Discard het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer cel pellets zorgvuldig met een pipet van Pasteur in 5-10 mL SB. combineren de zwevende cellen en brengen volume op 50 mL met SB.</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van Trypan blauw kleuring en een hemocytometer of geautomatiseerde cell counter (Zie Tabel van materialen). Om te bepalen van het percentage van de CD34+ cellen in het monster, resuspendeer 2,5 × 105 cellen in 100 µL van SB en vlek door het toevoegen van 10 µL van anti-CD34-PE antilichamen tegen 15-30 min bij 4 ° C. Analyseren met stroom cytometry (figuur 1A).</li>
	<li>Centrifuge buizen bij 400 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Vloeistof wordt weggeworpen. Opmerking: als niet onmiddellijk nodig, mononucleaire cellen kunnen worden bevroren in dit stadium.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 300 µL van SB per 108 cellen. Voeg 100 µL van FcR menselijke IgG (blokkeren reagens, Zie Tabel van materialen) en 100 µL van de magnetische kralen CD34 per 108 cellen. Meng voorzichtig en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30-40 min. Opmerking: Een enkele celsuspensie is vereist (indien nodig, de cellen al een 30 µm filter overgaan alvorens toe te voegen reagentia). Kunt u de volumes van de reagens hier beschreven voor 108 cellen of minder gebruiken. Voor meer dan 108 cellen, schaal omhoog de reagentia (SB, blokkeren van oplossing en CD34 magnetische kralen) dienovereenkomstig.</li>
	<li>Bereid de LS scheiding kolom tijdens de incubatieperiode door plaatsen van de LS-kolom in een magnetische houder en wassen met 3 mL SB. teruggooiverbod het effluent. Opmerking: LS scheiding kolommen kunnen worden geladen met maximaal 2 × 108 totaal aantal cellen. Kleinere en grotere kolommen zijn beschikbaar.</li>
	<li>5-10 mL SB toevoegen aan het mengsel van de cel en centrifuge op 400 × g voor 10 min. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1,5 mL SB en laden van de celsuspensie (1,5 mL) op de LS-kolom. Het verzamelen van de stroom door de met de labelloze cellen in een collectie-tube van 15 mL (negatieve fractie #1). Laat de vloeistof drain en was de kolom met 1,5 mL SB.</li>
	<li>Laden van de verzamelde stroom door (3 mL) terug in de kolom en verzamel de stroom door in de dezelfde 15 mL collectie buis (negatieve fractie #1). Was de kolom van LS 3 keer met 3 mL SB. Opmerking: Indien nodig, kunnen de cellen in de negatieve fractie (12 mL) worden gekleurd met anti-CD34 antistof om na te gaan van de vangst van CD34+ cellen door de LS-kolom.</li>
	<li>Kolom verwijderen uit het magnetische scheidingsteken en spoel cellen langzaam met een zuiger van de spuit in een nieuwe tube van 15 mL met 2 mL SB.</li>
	<li>Plaats kolom terug op magnetische scheidingsteken en lading de 2 mL van cellen terug in de kolom. De stroom door verzamelen en wassen met 2 mL SB. Dit is de negatieve fractie #2 (4 mL).</li>
	<li>LS kolom verwijderen uit magnetische scheidingsteken en voeg 2 mL SB. Flush cellen gestaag en stevig met een zuiger van de spuit om te verzamelen van de CD34+ cel breuk. Met behulp van trypan blauw kleuring en een hemocytometer of teller van geautomatiseerde cel cellen te tellen.</li>
	<li>Centrifugebuis met de positieve breuk bij 400 × g gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in serumvrij media voor CD34+ cellen (SFM, Zie Tabel van materialen). Opmerking: als niet onmiddellijk nodig, cellen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof in dit stadium.</li>
</ol>
2. zuiverheid Check van geïsoleerde CD34+ cellen
<ol>
	<li>Vlekken van 2 x 104 cellen uit de positieve afvalfractie met 10 µL anti-CD34-PE antilichaam en 20 µL anti-CD45-PerCP antilichaam voor 15 min bij 4 ° C (gebruik een aparte buis voor isotype besturingselementen) (figuur 1B).</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 mL van SB te wassen. Centrifugeer bij 400 × g voor 10 min. resuspendeer pellet in 200 µL van SB.</li>
	<li>Stroom cytometrische analyses uit te voeren en de bevolking van de levende cel als u wilt uitsluiten van puin (figuur 1B) poort. De poort instellen voor PE en PerCP positieve populaties met de PE en PerCP isotype besturingselementen (figuur 1B) en het bepalen van het percentage van de CD34+/CD45+ cellen.</li>
</ol>
3. Megakaryocyt differentiatie
<ol>
	<li>Zaad 5 × 105 cellen/mL CD34+ cellen in 2 mL zuiver SFM aangevuld met 50 ng/mL recombinante menselijke thrombopoietin (rhTPO) per putje in een 12-well-plate. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde sfeer. Als cellen confluente worden voordat ze vereist voor analyse zijn, oogsten van de cellen en splitsen in meerdere putten met verse media en rhTPO. Opmerking: Twee of drie putten moeten bereid zijn specifiek te controleren van differentiatie op verschillende tijdstippen (bv, dagen 7, 9 en 10).</li>
	<li>Oogsten van cellen uit de putten die zijn gereserveerd voor het controleren van differentiatie zonder verstoring van de cellen in de andere putten.</li>
	<li>Vlek cellen met 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antilichaam en 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antilichaam in een eindvolume van 100 µL. tube een besturingselement instellen met behulp van de respectieve isotype controle antilichamen. Incubeer gedurende 15-30 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 mL van SB te wassen.</li></ol>Centrifugeer bij 400 × g voor 10 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet in 200-300 µL van SB. analyseren door stroom cytometry.
	<li>Voor elke fluorophore, de isotype-besturingselementen om te stellen de gating voor FITC en Alexa bloem 647 positieve populaties te analyseren. Analyseren van de gekleurde celsteekproeven om te bepalen van het percentage van CD41+/CD42a+ dubbele positieve cellen, die volwassen MK (Figuur 1 c vertegenwoordigen).</li>
	<li>Voor microscopische visualisatie van cel vlek oppervlakte markeringen cellen zoals beschreven in punt 3.3.<ol>
		<li>Voeg vervolgens 1 mL van SB te wassen. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 min. resuspendeer de pellet in 100 µL van SB en spin op een glasplaatje bij 1.000 x g gedurende 5 min. Fix cellen op de dia door dompelen in methanol voor 30 s. lucht droog, Voeg 20 µL van montage DAPI met media (Zie Tabel van materialen) , dek af met een dekglaasje aan, en visualiseren met behulp van een fluorescente microscoop (figuur 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voor visualisatie van intracellulaire antigenen, resuspendeer de cellen in PBS en monteren met paraformaldehyde (1% eindconcentratie) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Om de permeabilize van de cellen, voeg triton-X 100 (0,1%) en incubeer gedurende 15 min. Wash cellen met 2 mL PBS/0.1% triton-X 100. Resuspendeer in 100 µL PBS/0.1% triton-X 100, Voeg anti vWf en anti CD62p antilichamen (1:200 verdunning) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.<ol>
		<li>Wassen met 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 en centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 min, resuspendeer in 100 µL van de dezelfde buffer en anti-muis IgG-Alexa 594 en anti-konijn IgG-Alexa 488 (1:100) toevoegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, wassen met 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 resuspendeer in 100 µL van de dezelfde buffer en Voeg 20 µL van anti CD42b-APC. Vervolgens draaien de cellen op glas dia's zoals beschreven in stap 3.6.1 en monsters voorbereiden met microscopische visualisatie, zoals beschreven in stap 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voor bepaling van de ploïdie, oogst cellen dagen 12 of 13 van differentiatie. Voeg vervolgens 1 mL van SB te wassen. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 minuten en vlek met 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antilichaam in een eindvolume van 100 µL. Incubate bij 4 ° C gedurende 30 minuten.<ol>
		<li>Een keer wassen met 1 mL SB en resuspendeer de pellet in 300 µL van hypotone citraat buffer (1.25 mM Natriumcitraat, 2.5 mM natriumchloride, 3.5 mM dextrose) met 20 µg Mo/ml propidium jodide en 0.05% Triton-X 100. Incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C beschermd tegen licht.</li>
		<li>RNase toevoegen om een eindconcentratie van 20 µg/mL en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht. Het bepalen van de intensiteit van propidium jodide door stroom cytometry door het verzamelen van 30.000 tot 50.000 evenementen van de CD41-FITC+ -bevolking (figuur 2C).</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet tellen, bloedplaatjes opsomming en bloedplaatjes activering
<ol>
	<li>Oogsten van cellen (uit stap 3.1) dagen 8 of 9 van differentiatie en zaad bij 1 × 104 cellen/well in 48-Wells-platen in 200 µL van verse SFM aangevuld met 50 ng/mL rhTPO. Cultuur voor 5 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. Opmerking: Voor kwantificatie doeleinden wells zaad in drievoud. Deze lage dichtheid is vereist voor visualisatie en tellen van proplatelet-bevattende MK. Proplatelets meestal start verschijnen na 2 dagen van cultuur. De piek is tussen 4 en 5 dagen.</li>
	<li>Het aantal proplatelet-bevattende MK in de hele put op een omgekeerde licht microscope met behulp van 10 X of 20 X doelstellingen. Opmerking: Een verwarmd (37 ° C) Microscoop stadium verdient de voorkeur, aangezien de cellen houden bij kamertemperatuur gedurende langere perioden krimp van de proplatelet extensies veroorzaakt. Proplatelets worden waargenomen als lange extensies uit het lichaam MK. Elke MK wellicht verschillende proplatelet uitsteeksels. Aangezien proplatelets ontwikkelen, vermindert het lichaam voor de MK in grootte.</li>
	<li>Oogsten van cellen samen en centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vlek cellen met 20 µL anti-menselijke CD41-FITC antilichaam, zoals beschreven in stap 3.3 en 3.4. Bereken het percentage voor proplatelet-dragende MK (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet-bevattende MKs/goed) / (totale CD41+ cellen / well)] x 100</li>
	<li>Als u wilt tellen bloedplaatjes vrijkomen van het kweekmedium, zachtjes Meng de cellen met een pipet van Pasteur en 100 µL verzamelen op dagen 14 of 15 van de cultuur.<ol>
		<li>Vlek met 20 µL anti-menselijke CD41-FITC antilichaam voor 20-30 min bij 4 ° C. Instellen van een controle-buis met behulp van de respectieve isotype controle antilichaam.</li>
		<li>Voeg 150 µL van SB en 50 µL van het tellen van de kralen.</li>
		<li>Voor de analyse van de cytometrische van de stroom, stel de FSC en de SSC te melden van de schaal. Gebruik normaal menselijk bloed bloedplaatjes van platelet-rich plasma gekleurd met CD41-FITC zoals beschreven in paragraaf 4.4.1 instellen de gating voor bloedplaatjes (figuur 3A).</li>
		<li>De gekleurde bloedplaatjes met kralen tellen door stroom cytometry analyseren. Het verzamelen van 1000 gebeurtenissen tellen kralen met behulp van de FSC versus SSC scatterplot (figuur 3A). Bereken het aantal bloedplaatjes op basis van CD41-FITC positieve gebeurtenissen (figuur 3B) met behulp van de formule: Bloedplaatjes per µL = [(aantal CD41-FITC positieve gebeurtenissen)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/monster volume)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voor het analyseren van de activering van de bloedplaatjes, zachtjes Meng de cellen met een pipet van Pasteur en 100 µL verzamelen op dagen 14 of 15 van de cultuur. Voeg 1 mL Tyrode de buffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM nb2HPO4,3NaHCO 12 mM, 5.5 mM D-glucose, pH 6,5) en centrifuge bij 200 x g gedurende 5 min naar pellet cellen.<ol>
		<li>De bovendrijvende vloeistof en centrifuge bij 800 x g gedurende 10 minuten naar de pellet van bloedplaatjes en middelgrote deeltjes verzamelen.</li>
		<li>Verwijder supernatant en resuspendeer in 100 µL Tyrode de buffer. 20 µL van PAC1-FITC antilichaam en adenosinedifosfaat (ADP) toevoegen om een eindconcentratie van 20 µM. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten analyseren door stroom cytometry om te bepalen van het percentage van FITC positieve gebeurtenissen. Gebruik verse menselijke bloedplaatjes behandeld op dezelfde wijze als positieve controle (Figuur 3 c).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li>
<li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+%28TPO%29+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li>
<li>Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis%3A+State+of+the+Art%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li>
<li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li>
<li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation%2C+transcriptional+activity+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li>
<li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34%2BCD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells%3A+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li>
<li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+thrombocytopenia%3A+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li>
<li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia%3A+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li>
<li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol.+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li>
<li>Lu, S. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li>
<li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208(2016).</li>
<li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells%3A+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li>
<li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+population+of+CD34%2B+cells+in+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).</li>
<li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+proplatelet+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).</li>
<li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).</li>
<li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li>
<li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34%2B-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li>
<li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation%2C+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1%2FS+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li>
<li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23714310">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li>
<li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+thrombocytopenic+purpura%3A+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hier beschreven is geschikt voor de constante productie van MK en bloedplaatjes in de cultuur van navelstrengbloed. Deze cellen kunnen worden gebruikt om verschillende processen zoals het effect van geneesmiddelen of biologische activiteiten op MK proliferatie, differentiatie, proplatelet formatie en bloedplaatjes productie te bestuderen.
Een verscheidenheid van cultuurmedia en cytokine combinaties zijn aangebracht in de literatuur. Toevoeging van cytokinen zoals stamcel factor, F...

Isolatie van een voldoende aantal primaire menselijke megakaryocytes (MK) voor regelmatige laboratoriumgebruik is niet haalbaar vanwege hun lage frequentie in het beenmerg, waar ze goed voor ~0.01% voor genucleëerde cellen1. Een handig alternatief is de ex vivo uitbreiding en differentiatie van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen in de aanwezigheid van bepaalde groeifactoren. Een aantal cytokines waaronder stamcel factor (SCF; c-kit ligand) en Interleukine (IL) -3 en IL-11 geweest is werkzaam in cultuur systemen te produceren MKs. Thrombopoietin (TPO) de meest effectieve groei en differentiatie factor voor megakaryocytic culturen en is effectief, alleen of samen met andere cytokines, zoals SCF en IL-32. TPO kan optreden op de populaties van de cel van de stam leiden tot zowel de proliferatie en de rijping van MKs2.
MK producten bloedplaatjes van cytoplasmatische uitsteeksels genaamd proplatelets en, in vivo, ongeveer 1 x 1011 bloedplaatjes worden is gevormd dagelijks om bloedplaatjes graven van 150-400 x 109muurkast bloedplaatjes productie in vitro tot 1000 -Vouw lager dan de in vivo 3 schat, en dit heeft aanleiding gegeven tot talrijke kweekomstandigheden met behulp van CD34+ hematopoïetische voorlopercellen te verbeteren MK en bloedplaatjes productie in vitro. De eerste bron van CD34+ cellen die worden gebruikt voor MK differentiatie was perifere bloed4. Andere mobiele bronnen omvatten beenmerg5,6, embryonale stamcellen/geïnduceerde pluripotente stamcellen (ESC/iPSC)7en navelstreng bloed (UCB)8,9,10 . Menselijke beenmerg CD34+ 11 en muis lineage negatieve beenmerg cellen5 produceren MK en bloedplaatjes in vitro; echter het gebrek aan beschikbaarheid van menselijke beenmerg beperkt het gebruik ervan als een bron van CD34+ cellen. In tegenstelling, vertegenwoordigen ESC en iPSC een onbeperkte bron van cellen voor in vitro bloedplaatjes productie. Bloedplaatjes productie van deze cellen vereist feeder cellen zoals lymfkliertest OP9 cellen en langere cultuur. Bloedplaatjes afgeleid in feeder-vrij voorwaarden lijken minder functionele12. iPSC afkomstige bloedplaatjes dreigen te worden voor gebruik in klinische instellingen aangezien zij kunnen worden uitgebreid tot een grote schaal. Dit proces vereist lentivirale-gemedieerde transductie van transcriptiefactoren en op lange termijn cel cultuur13.
UCB is een toegankelijke bron van CD34+ cellen die gemakkelijk kunnen worden gebruikt in onderzoek instellingen. Alleen TPO kan bevorderen differentiatie van koord bloed afkomstige CD34+ cellen en dit leidt tot zeer zuivere, volwassen MKs zonder de noodzaak van serum suppletie of co cultuur met feeder cellen. Andere cytokines zoals SCF kan afnemen differentiatie van UCB CD34+ cellen, terwijl Flt-3 ligand en IL-11 de productie van onrijpe megakaryocytes14 bevorderen. Dit protocol beschrijft de productie van zeer zuivere MK culturen uit navelstrengbloed CD34+ cellen in serumvrij voorwaarden.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Serum-vrij media voor CD34+ cellen</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>CD34 Isolatiereiagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead kit ultrapuur</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Deze kit bevat de FcR humane IgG blokkeringsreagens en CD34 microbeads. Deze kralen bevatten het anti-CD34 antilichaam klonen QBEND/10. Gebruik een ander anti-CD34 klonen voor zuiverheidscontrole (bijv. klon 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Lymfocyt scheidingsmedium (dichtheid 1.077 g/mL)</td></tr><tr><td>Steriele scheidingsbuffer (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Deze buffer bevat fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.2 bevattend 0,5% bovijn serumalbumine en 2 mM EDTA. Het kan worden bereid met steriele, celkweekkwaliteitscomponenten. Ontgas voor gebruik omdat luchtbellen de kolom kunnen blokkeren.</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Flow Cytometrie en Celkleuring Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Muis anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Klon 8G12. Dit kan worden gebruikt voor CD34 zuiverheidscontrole. Eind antilichaam concentratie 1:10 verdunning.</td></tr><tr><td>PerCP muis anti-mens CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>1:10 verdunning</td></tr><tr><td>PerCP isotype controle</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>1:10 verdunning</td></tr><tr><td>FITC Muis anti-Human CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Eind antilichaam concentratie 1:5 verdunning.</td></tr><tr><td>APC Muis anti-Human CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>Dit antilichaam kan ook worden gebruikt om volwassen MK te detecteren (het percentage van de positieve cellen is meestal lager dan met anti CD42a). Eind antilichaam concentratie 1:10 verdunning.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Muis anti-Human CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Momenteel gedistribueerd door Bio-Rad. Eind antilichaam concentratie 1:10 verdunning.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Muis Negatieve Controle</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Momenteel gedistribueerd door Bio-Rad. Isotype controle antilichaam</td></tr><tr><td>Anti von Willebrand factor konijn polyklonaal</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>V450 muis anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1: 20 verdunning</td></tr><tr><td>V450 isotype controle</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>1:20 verdunning</td></tr><tr><td>PAC1-FITC antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 verdunning</td></tr><tr><td>Anti CD62p muis monoklonaal</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti konijn IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 verdunning</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 geit anti muis IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 verdunning</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Isotype controle antilichaam</td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Tellingkralen</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Kleinere en grotere kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator magneet</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL ronde bodem polypropyleen FACS buizen, met Snap Cap, sterieel</td><td>In Vitro technologieën</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dia's</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Bevestigingsmedium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Antifade bevestigingsmedium met DAPI</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd microscoop</td><td>Leica</td><td>DMIRB omgekeerde microscoop</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Celanalysator</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celanalysator software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Single cell analyse software</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop software</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blauwe editie</td><td></td></tr></tbody></table>

megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige cd34+ cellen

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Bloedplaatjes productie komt voornamelijk in het beenmerg in een proces dat bekend staat als thrombopoiesis. Tijdens thrombopoiesis onderscheid hematopoïetische voorlopercellen naar vorm bloedplaatjes precursoren genaamd megakaryocytes, die terminaal differentiëren om bloedplaatjes van lang cytoplasmatische processen genoemd proplatelets vrij te geven. Megakaryocytes zijn zeldzame cellen beperkt tot het beenmerg en zijn daarom moeilijk om te oogsten in voldoende aantallen voor laboratoriumgebruik. Efficiënte productie van menselijke megakaryocytes kan worden bereikt in vitro door het kweken van CD34+ cellen onder adequate omstandigheden. Het protocol hier gedetailleerde beschrijving Isolatievan CD34+ cellen door magnetische cel sorteren van bloedmonsters van de navelstreng. De nodige maatregelen om het produceren van zeer zuivere, volwassen megakaryocytes onder serumvrij voorwaarden worden beschreven. Details van fenotypische analyse van differentiatie van de Megakaryocyt en bepaling van de proplatelet formatie en bloedplaatjes productie zijn ook aanwezig. Effectoren die van invloed zijn Megakaryocyt differentiatie en/of de vorming van de proplatelet, zoals anti-bloedplaatjes antilichamen of thrombopoietin mimetics, kunnen worden toegevoegd aan gekweekte cellen te bestuderen van de biologische functie.

Dit protocol staat toe de voorbereiding van zeer MK reinculturen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Het percentage van de CD34+ cellen in koord bloed is ongeveer 1,3%15 (figuur 1A) en het totale aantal mononucleaire cellen (stap 1.8) varieert van 90-300 x 106 per UCB eenheid. De zuiverheid van CD34 +/ CD45 + cellen na isolatie varieert van 90 tot 99% (figuur 1B). MK (...

Een zeer zuivere bevolking van megakaryocytes kan worden verkregen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Een methode voor CD34+ celdifferentiatie isolatie en Megakaryocyt is hier beschreven.

Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34+ cellen

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke navelstrengbloedmonsters te gebruiken om pure CD34-positieve cellen te isoleren om de effecten van specifieke geneesmiddelen van belang te bestuderen op megakaryocytdifferentiatie, proplatetvorming en trombocytproductie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van megakaryocyten en bloedplaatjes te beantwoorden, zoals wat de effecten zijn van specifieke behandelingen op megakaryocytdifferentiatie en trombocytproductie en -functie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een methode biedt voor de consistente isolatie van levensvatbare CD34-positieve cellen uit vers navelstrengbloed.Door deze methode kan inzicht worden verkregen in megakaryopoëse, ook andere celtypen zoals lymfocyten, erythrocyten en macrofagen kunnen worden bestudeerd. Begin met het toevoegen van 10 milliliter scheidingsbuffer in een 150 milliliter conische buis per 10 milliliter navelstrengbloed. Gebruik een 18 gauge stompe naald gemonteerd op een 10 milliliter spuit om 10 milliliter bloed in elke buis over te brengen, gevolgd door de toevoeging van 15 milliliter lymfocytenscheidingsmedium op de bodem van elke buis.Schei de ce

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een 3D cultuur voor hematopoiesis beschreven met menselijke navelstrengbloed en leukemische beenmergcellen. De methode is gebaseerd op het gebruik van een poreuze kunststof polyurethaan scaffold bekleed met extracellulaire matrix. Deze steiger is aanpasbaar aan een groot aantal cellen te passen.

Ex vivo Mimicry van normale en abnormale Human Haematopoiese

This video demonstrates a technique for the differentiation of megakaryocytes and the formation of platelets. Hematopoietic stem progenitor cells — isolated from human umbilical cord blood — differentiate into mature megakaryocytes in the presence of thrombopoietin. The mature megakaryocytes produce cytoplasmic extensions termed proplatelets, which give rise to individual platelets.

An In Vitro Method for the Differentiation of Megakaryocytes and Platelet Formation

Hier presenteren we menselijke pluripotente de protocollen van de cultuur van het cel van de stam (hPSC), gebruikt om te onderscheiden van hPSCs in CD34+ hematopoietische progenitorcellen. Deze methode maakt gebruik van fase-specifieke manipulatie van canonieke WNT signalering cellen uitsluitend naar ofwel het definitieve of primitieve hematopoietische programma opgeven.

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol voor immunophenotypic karakterisering en cytokine geïnduceerde differentiatie van snoer bloed afgeleide CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde lijn. De toepassingen van dit protocol omvatten onderzoeken naar het effect van myeloïde ziekte mutaties of kleine moleculen op myeloïde differentiatie van de CD34+ cellen.

Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Dit protocol beschrijft in detail alle stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van leukofilter-afgeleide CD34 + hematopoietische voorlopers en hun in vitro differentiatie en rijping tot proplatelet-dragende megakaryocyten die in staat zijn om bloedplaatjes in het kweekmedium vrij te geven. Deze procedure is nuttig voor diepgaande analyse van cellulaire en moleculaire mechanismen die megakaryopoiese beheersen.

Leukodepletiefilters-afgeleide CD34 + -cellen als een celbron om megakaryocytendifferentiatie en bloedplaatjesvorming te bestuderen

Hier presenteren we een immunofenotyping-strategie voor de karakterisering van megakaryocytdifferentiatie en laten we zien hoe die strategie het sorteren van megakaryocyten in verschillende stadia mogelijk maakt met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder. De methodologie kan worden toegepast op menselijke primaire weefsels, maar ook op megakaryocyten gegenereerd in kweek in vitro.

Immunofenotypering en celsortering van menselijke MKs uit menselijke primaire bronnen of gedifferentieerde in vitro van hematopoëtische voorlopers

Het modelleren van erytropoëse biedt een waardevolle kans om de biologische betekenis van actoren in dit proces te begrijpen en om nieuwe therapeutische benaderingen te evalueren die differentiatiedefecten kunnen verlichten. Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode om CD34+ hematopoëtische stam- en voorlopercellen ex vivo efficiënt te differentiëren.

Een uitgebreide pijplijn om de efficiëntie van menselijke erytropoëse in vitro en ex vivo te beoordelen

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

T cellen die een CD19-antigen specifieke chimere receptor (CAR) worden toegediend als onderzoek behandeling van B-cel maligniteiten in de eerste-in-humane gentherapie trials. We beschrijven genetische modificatie van T cellen met behulp van...

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

Leer hoe je CD34-positieve cellen isoleert uit navelstrengbloed om megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjesvorming te bestuderen. Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor hematologisch onderzoek.

Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34⁺ cellen

Meer video's verkennen