Name: Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Leer oppervlakte-decoratie van Mycobacterium bovis BCG met het avidine-biotinesysteem als snel alternatief voor genetische methoden. Deze techniek verbetert de immunogeniciteit en versnelt vaccinontwikkeling aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. R Stokes voor de BCG Pasteur stam en A. Talal voor technische ondersteuning. Wij danken GenScript voor hulp bij gene synthese.

Alle dieren werden onderhouden overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies aan de University of British Columbia. Experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies en uitgevoerd volgens de Canadese Raad op Animal Care Guidelines. Het dierlijke verzekering welzijn nummer is A11-0247.
1. generatie van monomere Avidin Fusion eiwitten uiting van plasmiden
<ol><li>Sub kloon monomere avidin reeks12 in pDEST17 plasmide tussen de "CTC" en "GAA" sites die correspondeert met 133-134bp. (dat wil zeggen, tussen de 6-histag en de pDEST17 Attr1 recombinatie site) te verkrijgen p17-Avi. Opmerking: De monomeer avidin DNA-sequentie is hieronder weergegeven. De drie mutaties in wild-type Avidin om de monomeer avidin geïntroduceerd worden in vette letters weergegeven. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac OOAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>Inleidingen geflankeerd met AttB1 en B2 Attsites die overeenkomt met de eicellen polypeptide757-1035 ontwerpen (ik-A-b- en H-2_Kb-beperkt epitopes) opeenvolging van DNA. Primer sequenties zijn: Attb1-eicellen GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT en Attb2-eicellen GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 en b2-sequenties van Attzijn vet).<ol>
<li>PCR-versterken eicellen polypeptide757-1035 DNA-sequentie met de inleidingen boven het pUC57-eicellen plasmide als sjabloon gebruiken.</li>
		<li>Het klonen van de PCR producten in pDONR-221 door een sitespecifieke in vitro recombinatie reactie (b.v., BP Clonase) pDONR-eicellen te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng het gen van belang in p17-Avi met behulp van de reactie van LR Clonase p17-Avi-eicellen te verkrijgen. Opmerking: Voor details van BP en LR recombinatie klonen, zie de handleiding van de fabrikant.</li>
</ol>2. de monomeer Avidin Fusion eiwit expressie, zuivering en uiteinde
<ol><li>Transformeren p17-Avi-eicellen plasmide in E. coli BL21 en veroorzaken 250 mL van E. coli cultuur van de BL21 met IPTG (0,1 M) gedurende 3 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>
Lysis van bacteriën en integratie instanties solubilisatie
	<ol>
<li>De 250 mL van geïnduceerde BL21 cultuur pellet door 30 min van centrifugeren op 4.000 x g en bij 4 ° C.</li>
		<li>Verzamelen van pellets in 10 mL lysisbuffermengsel (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M Guanidine-HCL, pH 1,5-2,5) en incubeer gedurende 15 min bij 95 ° C. Na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur op een rotator.</li>
		<li>Centrifuge 30 min op 15.000 x g en 4 ° C en verzamelen supernatant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zuiveren van Avi-eicellen van Supernatant (ontbindend opneming organen Fractie) met Ni-NTA kolommen.
	<ol>
<li>Verdun opneming organen 1:2 met lysis-buffermengsel.</li>
		<li>Gebruik 4 mL Ni-NTA hars per 250 mL cultuur afkomstige integratie-organen.</li>
		<li>3 x met 10 mL lysisbuffermengsel (pH 7.0) wassen.</li>
		<li>Elueer met 10 mL elutie buffer (lysis buffer pH 7.0 met 250 mM imidazol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Refold geëlueerd eiwit door geleidelijke verdunning (1:10) en snelle vortexing in Tris buffer (pH 7.5) met 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM, Tween 80, arginine 500 mM en 200 mM NaCl gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>-Zout en buffer uitwisseling refolded eiwit uit Tris buffer in PBS met eiwit concentrators volgens de protocollen van de fabrikant.</li>
	<li>Verwijderen van aggregaten door centrifugeren gedurende 30 minuten bij 3500 x g en bij 4 ° C, en op te slaan aliquots oplosbaar eiwit bij-20 ° C.</li>
</ol>3. Biotinylation van BCG celoppervlak
<ol><li>Groeien van BCG in Middlebrook 7H 9 bouillon met 10% OADC (oliezuur, albumine en dextrose oplossing) en 0.05% Tween 80 bij 37 ° C op een shaker platform op 50 rpm tot OD = 0,5-1. Opmerking: BCG is een ziekteverwekker van bioveiligheid niveau 2 en alle experimenten betreffende BCG moeten gebeuren in een kabinet met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bioveiligheid.</li>
	<li>Wassen 109 BCG 3 keer met 500 µL ijskoude endotoxine gratis PBS plus 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Schorten BCG pellet in steriele endotoxine gratis PBS.</li>
	<li>
Onmiddellijk vóór gebruik, bereiden 1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS Biotine in steriele gefilterd water.
	<ol>
<li>Incubeer bacteriën met 1 mL 0,5 mM van Sulfo-NHS SS Biotine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Wassen gelabelde bacteriën 3 keer met 500 µL van iced koude PBST verwijderen niet hebben gereageerd biotinylation reagens.
	<ol>
<li>Resuspendeer de pellet in 1 mL PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Om te beoordelen biotinylation efficiëntie, vlek 108 biotinyleerd BCG met daar-FITC (1:100, 25 µL) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
	<ol>
<li>Incubeer gebeitst bacteriën in 1 mL 2% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens niveaus van biotinylation te onderzoeken door stroom cytometry analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fenotype van biotinyleerd Mycobacteria: groei en overleving
<ol><li>
Groeien van BCG stammen in Middlebrook 7H 9 bouillon met 10% OADC (oliezuur, albumine en dextrose oplossing) en 0.05% Tween 80 bij 37 ° C op een shaker platform op 50 rpm.
	<ol>
<li>De optische dichtheid (OD600) van de bacteriecultuur opnemen over een periode van 8 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gebruiken BCG-Luc (eerder beschreven9) voor het detecteren van bacteriën overleven in macrofagen.
	<ol>
<li>RAW264.7 cellen met biotinyleerd BCG-Luc (MOI 10:1) infecteren of onbehandeld BCG-Luc (control) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende een 48u periode.</li>
		<li>Cel monolayers wassen en vervolgens lyse met 0,025% SDS om ingenomen bacteriën vrij te geven.</li>
		<li>Maatregel bioluminescentie productie met Luciferase assay systeem en luminometer. Opmerking: Luminescentie signaal is kenmerkend voor bacteriële levensvatbaarheid. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor meer informatie over luciferase assay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. de binding van de monomeer Avidin-fusieproteïne te biotinyleerd BCG oppervlak
<ol><li>Meng 5 x 108 biotinyleerd BCG met Avi-eiwit (10 μg/mL finale in PBS-T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op shaker platform.</li>
	<li>Wash bacteriën 3 keer met 500 µL van iced koude PBST en vlek met konijn anti-avidin antilichaam (Ab) (1:100 verdunning, eerder beschreven10) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens met FITC geconjugeerd geit anti-konijn IgG Ab onder dezelfde omstandigheden.</li>
	<li>Wassen van bacteriën 3 keer met PBST 500 µL en analyseren door stroom cytometry te evalueren in welke mate van oppervlakte decoratie.</li>
</ol>6. lyofilisatie van mycobacteriën
<ol><li>Biotinylate-bacteriën volgens stap 3.1-3.4 en jas biotinyleerd bacteriën met Avi-eicellen volgens stap 5.1.</li>
	<li>Aliquot biotinyleerd en gecoate bacteriën (108), wassen met PBS en resuspendeer in 0,5 mL lyofilisatie media (1,5%, 25% Sauton medium en 75% H2O nb-glutamaat).</li>
	<li>Bacteriën overbrengen in glazen flesjes en bevriezen in een vriezer-80 ° C's nachts.</li>
	<li>Lyophilize gevulde en bevroren glazen flesjes voor 24 h met gebruikmaking van een bevriezing van de droger.</li>
	<li>Opslaan van gedroogde monsters bij kamertemperatuur en reconstrueren in PBS wanneer nodig.</li>
	<li>Herhaal stap 3.5 biotinylation en oppervlakte coating stabiliteit te evalueren.</li>
</ol>7. fagocytose Assay
<ol><li>RAW 264.7 macrofaag cellen in 10 cm diameter cultuur gerechten in DMEM medium met 5% FCS, 1%, elke van L-glutamine, HEPES, niet-essentiële aminozuren, en penicilline en streptomycine groeien tot 70-80% confluentie.</li>
	<li>Zaad van 2 x 106 RAW 264.7 macrofaag cellen in een 6-well-plate. Cellen te houden 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2toestaan.</li>
	<li>Genereren van DsRed BCG (eerder beschreven9) versierd met Avi-eicellen (DsRed BCG-Avi-OVA) volgens stappen 3.1-3.4 en 5.1.</li>
	<li>Infecteren ruwe cellen met DsRed BCG-Avi-eicellen of onbehandeld DsRed BCG op MOI 20:1 gedurende 24 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Spoel de cellen driemaal en trypsinize met 1 mL van 0,25% trypsine bij 37 ° C gedurende 10 minuten te verwijderen van gedeeltelijk vrijstaande bacteriën.</li>
	<li>Positiebepaling in 2,5% PFA in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>3 x met PBS wassen en analyseren door stroom cytometry.</li>
</ol>8. intracellulaire handel in eicellen ingericht biotinyleerd BCG in macrofagen
<ol><li>
Fluorescentie microscopie
	<ol>
<li>Beënt, 3 x 105 RAW 264.7 macrofaag cellen op coverslips in een 24-well-plate. Cellen te houden 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2toestaan.</li>
		<li>Macrophage cellen met mycobacteriën (MOI 10:1) in onderhoud media zonder antibiotica bij 37 ° C en 5% CO2 voor 4 tot en met 24 h infecteren.</li>
		<li>Wassen van de cellen en trypsinize om te verwijderen van oppervlakte geschakelde, niet-ingenomen bacteriën zoals in stap 7.5.</li>
		<li>Fix geïnfecteerde cellen in 2,5% PFA in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door 3 wasbeurten met PBS.</li>
		<li>Permeabilize cellen in blokkeren/permeabilization buffer (0,1% Triton X-100, 3% BSA in PBS) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.<ol>
<li>Gebruik specifieke antilichaam van belang (bijvoorbeeldanti-avidin Ab konijn) bij 10 μg/mL in permeabilization buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door secundair antilichaam (bijvoorbeeldFITC-geit anti-konijn IgG) voor 20 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wash cellen 3 x met PBS, een keer met water, en mount op dia's in 10 μL van waterige montage medium om te minimaliseren van de fluorescentie photobleaching.</li>
		<li>Onderzoeken van de dia's door digitale confocale microscopie met behulp van een Microscoop van de epifluorescence uitgerust met 63 x / 1.4 Plan-Apochromat doel. Record beelden met behulp van een digitale camera gekoppeld aan de Microscoop software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunogold kleuring en elektronenmicroscopie
	<ol>
<li>Zaad van 2 x 106 RAW 264.7 macrofaag cellen in 6-Wells-platen.</li>
		<li>Herstellen van BCG geïnfecteerde macrofagen met 4% PFA gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Wassen monsters tweemaal met PBS.</li>
		<li>Monsters in 4% lage smeltpunt agarose insluiten en uitdrogen in 70% ethanol.</li>
		<li>Monsters overbrengen in acryl hars en polymeriseren bij 50 ° C.</li>
		<li>60 nm secties met microtome uitgesneden en verzamelen van secties op nikkel rasters.</li>
		<li>Label monsters met 10 μg/mL avidin antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C's nachts in incubatie oplossing (PBS en 0,1% BSA) en daarna wassen met incubatie oplossing goud-geconjugeerde F(ab')2 van ultra-kleine geit-anti-konijn IgG (1/20) gedurende 1 uur op de kamer temperatuur in incubatie oplossing.</li>
		<li>Secties in gedistilleerd water wassen, vlekken in 2% Glutaaraldehyde wassen opnieuw, droge lucht en onderzoek met de elektronenmicroscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. dierlijke immunisering en orgel Processing
Opmerking: Alle stappen moeten worden gedaan in een kabinet bioveiligheid.
<ol><li>Pass biotinyleerd en eiwit gecoat bacteriën via 271/2G naald 10 keer om één celsuspensie.</li>
	<li>
Neem 1 x 106 bacteriën in 100 μl van endotoxinen-vrije PBS en immuniseren een vrouwelijke C57BL/6 muizen (-A,b, H - 2 Kb, 5-6 week oud) subcutaan in het nekvel van de nek.
	<ol>
<li>Injecteren controle muizen met 100 μl van PBS alleen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Euthanaseren geïmmuniseerde muizen 20 dagen na immunisatie bij CO2 inademing gevolgd door cervicale dislocatie.
	<ol>
<li>Isoleren van de milt en breng het in RPMI media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pureer de milt door een zeef van de cel 70 µm met een zuiger van de spuit 5 mL.
	<ol>
<li>Wassen met 5 mL RPMI. Centrifuge (800 x g, 3 min) te isoleren van de schorsing van een enkele cel.</li>
		<li>RBC met muis Biotine positieve selectie kit met biotine-Ter119/Erythroid cellen Ab afbreken.</li>
		<li>Centrifuge en resuspendeer de cellen in 10 mL van de volledige RPMI (10% FCS, 1% L-glutamine, penicilline van 1%, 1% streptomycine en 50 μM 2-ME).</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. ik-Ab tetrameer kleuring te bepalen de frequenties van antigeen-specifieke CD4+ T-cellen en intracellulaire Cytokine vlekken te bepalen frequenties van antigeen-specifieke T cellen vrijgeven van Cytokines in geïmmuniseerd dieren
<ol><li>
Tetrameer kleuring
	<ol>
<li>Vlekken van splenocytes van controle en geïmmuniseerde muizen (~ 20 x 106 cellen) met PE-geconjugeerde ik-A-b-eicellen323-339 tetramers (in de verdunning 1/12,5) gedurende 1 uur bij 37 ° C in bindende buffer (PBS met 2% FCS en 0,1% NaN3).</li>
		<li>AF647 CD4 Ab (1:25) en 7-AAD (te sporen dode cellen) toevoegen aan splenocytes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Het analyseren van monsters met stroom cytometry.</li>
		<li>Verwerven van 500.000 gebeurtenissen in de CD4-positieve regio om te bepalen van de frequentie van tetrameer positieve gebeurtenissen. Opmerking: Totale splenocytes worden gedefinieerd door de wetenschappelijke stuurgroep/FSC dot blot, levende cellen door uitsluiting van de 7-AAD positieve gebeurtenissen en CD4 deelverzamelingen door gating AF647 positieve gebeurtenissen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Frequentie van antigeen specifieke intracellulaire Cytokine vrijgeven van T cellen
	<ol>
<li>Overdracht ongeveer 1 × 107 splenocytes in 4 mL voor volledige RPMI medium in zes-Wells-platen met of zonder recombinante eicellen (10 µg/mL) en incubeer gedurende 16 h.</li>
		<li>Cellen met Brefeldin A (1:1, 000) voor een extra 5 h behandelen.</li>
		<li>Wassen met PBS en onder voorbehoud van intracellulaire cytokine kleuring als volgt:<ol>
<li>Vlek celsteekproeven met PE-CD8 of PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 in bindende buffer) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
			<li>Vast in 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.</li>
			<li>Permeabilize met behulp van de permeabilization oplossing, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
			<li>Wassen cellen en label met AF647-geconjugeerde IFN-γ Ab (1:50) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Wassen van de cellen en onderworpen aan stroom cytometry analyse zoals hierboven beschreven.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Horwitz, M. A., Harth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vaccine+against+tuberculosis+affords+greater+survival+after+challenge+than+the+current+vaccine+in+the+guinea+pig+model+of+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.</a> Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).</li>
<li>Pym, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).</li>
<li>Grode, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vaccine+efficacy+against+tuberculosis+of+recombinant+Mycobacterium+bovis+bacille+Calmette-Guerin+mutants+that+secrete+listeriolysin%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.</a> The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).</li>
<li>Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).</li>
<li>Mederle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmidic+versus+insertional+cloning+of+heterologous+genes+in+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+impact+on+in+vivo+antigen+persistence+and+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses.</a> Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).</li>
<li>Singh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity+A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity.</a> Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).</li>
<li>Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+requirements+for+enhanced+antigen+cross-presentation+to+CD8+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes.</a> J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).</li>
<li>Sharif-Paghaleh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination+by+early+detection+of+%2899m%29+Tc-HMPAO-labelled+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells.</a> Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).</li>
<li>Laitinen, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+an+active+avidin+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rational design of an active avidin monomer.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).</li>
<li>Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+immunogenicity+of+the+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccine+by+non-genetic+bacterial+surface+decoration+using+the+avidin-biotin+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li>
<li>Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin-biotin+technology+in+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Avidin-biotin technology in targeted therapy.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).</li>
<li>Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+of+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy of brain tumor.</a> Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).</li>
<li>Cummings, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+plant-produced+recombinant+monomer+hemagglutinin-based+influenza+vaccine+derived+from+influenza+A+%28H1N1%29pdm09+virus%3A+a+Phase+1+dose-escalation+study+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults.</a> Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).</li>
<li>Kolotilin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+solutions+for+veterinary+immunotherapeutics+and+prophylactics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics.</a> Vet Res. 45, 114-117 (2014).</li>
<li>Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+streptavidin+monomer+with+a+reduced+biotin+dissociation+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate.</a> Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).</li>
<li>Deghmane, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoamide+dehydrogenase+mediates+retention+of+coronin-1+on+BCG+vacuoles%2C+leading+to+arrest+in+phagosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation.</a> J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).</li>
<li>Soualhine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+bovis+bacillus+Calmette-Guerin+secreting+active+cathepsin+S+stimulates+expression+of+mature+MHC+class+II+molecules+and+antigen+presentation+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages.</a> J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).</li>
<li>Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antibodies+to+avidin+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22ImmunolLett%22%5BJournal%5D)">Natural antibodies to avidin in human serum.</a> ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).</li>
<li>Petronzelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+avidin+is+not+hampered+by+antiavidin+antibodies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biother+Radiopharm%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans.</a> Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Bigini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+of+avidin-nucleic+acid+nanoassemblies+as+multifunctional+diagnostic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools.</a> ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie meldden wij een niet-genetische aanpak voor snelle en effectieve weergave van exogene eiwitten op BCG oppervlak om toe te voegen specifieke antigenen of specifieke functionele eigenschappen verwacht om efficiënt de immunogeniciteit van de bacterie. We toonden aan dat het celoppervlak BCG biotinyleerd voor ogenblikkelijke oppervlakte decoratie met avidin fusion eiwitten gemakkelijk zou kunnen zijn. De totale procedure kan worden uitgevoerd binnen de 2 uur, terwijl genetische transformatie en selectie van po...

Diverse strategieën zijn voorgesteld ter vervanging van het huidige TB-vaccin BCG, met inbegrip van eiwit adjuvans systemen, virale vectored technologieën, verzwakte levende stammen van de M.tb en genetisch gemodificeerde stammen van de BCG, ofwel invoering van genen over het uitdrukken van BCG-antigenen die niet voldoende blijk tijdens de infectie1 of Mtb gegeven-specifieke antigenen niet aanwezig in de BCG2. Genetische manipulatie, echter geconfronteerd met vele belemmeringen met inbegrip van de onzekere niveau van veiligheid, het tijdrovende proces en het lage rendement van4,5van de vectoren van de expressie. Met betrekking tot de verbetering van de BCG, is een alternatieve aanpak nodig ter verbetering van de immunogeniciteit zonder de noodzaak voor onzekere genetische afwisseling.
In deze studie introduceren wij een nieuwe strategie voor de weergave van recombinante eiwitten van de rente over het celoppervlak BCG, dat is gebaseerd op de interactie van de bekende avidin van hoge-affiniteit met biotine. Deze benadering biedt snelle en reproduceerbare gehechtheid van recombinante avidin fusion eiwitten op het oppervlak van biotinyleerd BCG, dat brede manipulaties van BCG vergemakkelijkt op een maximale verbetering van zijn werkzaamheid met behoud van haar uitstekende veiligheid opnemen, die gedurende tientallen jaren van gebruik.
Avidin affiniteit voor Biotine is extreem hoog (K,d = 1015 M) en eenmaal gevormd, het Biotine-avidin-complex is zeer stabiel en slechts onder voorwaarden6denaturering kan worden verstoord. Echter, voor dit soort interactie om te dienen als een gen alternatief voor de methode van de overdracht, op lange termijn maar omkeerbare weergave van recombinante eiwitten is vereist. Zo introduceerden we hier een lage affiniteit monomeer avidin (K,d = 10−7 M) dat leidt tot de omkeerbare release van eiwit van het oppervlak versierd BCG eenmaal ingenomen binnen antigeen presentatie van cellen. We getest om te voorzien van een proof of concept, deze methode met behulp van een monomeer avidin chimeer eiwit overeenkomt met een surrogaat-antigeen afgeleid van ovoalbumine (OVA)7,8. De resultaten toonden aan dat het celoppervlak BCG kan gemakkelijk en snel met worden verfraaid monomere avidin fusion eiwitten en dat deze binding aan de oppervlakte van de BCG stabiel en reproduceerbare zonder waarneembare veranderingen in de bacteriële groei en overleving is. Ook vonden we dat BCG versierd met monomere avidin gefuseerd met eicellen (AviOVA) kan veroorzaken een immuunrespons die vergelijkbaar is met die geïnduceerd door BCG genetisch uiting te geven aan het zelfde antigeen zowel in vitro als in vivo. Deze technologie van omkeerbare display van eiwitten van de rente over het bacteriële oppervlak is daarom een doeltreffende vervanging van traditionele gene transfer benaderingen en kan een platform bieden voor brede manipulaties van BCG en verdere toepassingen in vaccin ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>Endotoxin-free RPMI 1640</td><td>StemCell Technologies&nbsp;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS biotin</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer&nbsp;</td><td>MBL International&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON polyhistidine-Tag purification resin&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>557681</td><td></td></tr><tr><td>AF647 rat anti-mouse IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>557735</td><td></td></tr><tr><td>AF647 rat anti-mouse I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>562367</td><td></td></tr><tr><td>PeCy7 rat anti-mouse CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>552775</td><td></td></tr><tr><td>PE rat anti-mouse CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>561095</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 rat anti-mouse H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated goat anti rabbit antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 rat anti-mouse CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>557681</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 murine macrophage cell lines</td><td>American Type Culture Collection</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDEST17 plasmid&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-OVA plasmid&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP clonase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR clonase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>pDONR221 plasmid</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA columns&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Pierce protein concentrators&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II epifluorescence microscope</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD digital camera&nbsp;</td><td>Retiga EX, QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV electron microscope&nbsp;</td><td>FEI Company</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu;m Falcon cell strainer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>EasyStep mouse biotin positive selection kit&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm kit&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase assay system</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem luminometer&nbsp;</td><td>Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6 microtome</td><td>&nbsp;Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500 freeze dryer</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton boroscilicate glass vials</td><td>Wheaton</td><td>&nbsp;VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

expressie van exogene antigenen in de mycobacterium bovis -bcg-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem avidin-biotine

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculose (TB) is een ernstige besmettelijke ziekte en de enige beschikbare vaccin M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) is veilig en effectief voor de bescherming tegen kinderen ernstige TB meningitis en sommige vormen van gedissemineerde TB, maar er niet in slaagt om te beschermen tegen pulmonaire TB, die de meest voorkomende vorm van de ziekte is. Veelbelovende strategieën ter verbetering van BCG momenteel rekenen op haar transformatie met genen coderend voor immunodominante M. tuberculosis (Mtb)-specifieke antigenen en/of complementeren met genen coderend voor cofactoren die antigeen zou stimuleren presentatie van cellen. Belangrijke beperkingen van deze benaderingen zijn lage efficiëntie, lage stabiliteit en het onzekere veiligheidsniveau van expressievectoren. In deze studie presenteren wij een alternatieve aanpak van vaccin verbetering, die bestaat uit BCG complementeren met exogene proteïnen van belang op het oppervlak van bacteriën, in plaats van transformatie met plasmiden codering van de bijbehorende genen. Eerst, eiwitten van belang worden uitgedrukt in fusie met monomere avidin in standaard E. coli expressiesystemen en vervolgens gebruikt voor het decoreren van het oppervlak van biotinyleerd BCG. Dierproeven met behulp van BCG oppervlak versierd met surrogaat ovoalbumine antigeen aantonen dat het gewijzigde bacterie is volledig immunogeen en specifieke T cel reacties teweeg kunnen. Over het geheel genomen ondersteunen de hier gepresenteerde sterk gegevens een roman en efficiënte methode voor het omvormen van de huidige BCG-vaccin dat de moeizame conventionele benadering van complementatie vervangen door exogene nucleïnezuren.

De algemene procedures beschreven, werd de haalbaarheid van BCG oppervlakte biotinylation en decoratie met surrogaat antigeen eicellen onderzocht. De immunogeniciteit van de gemodificeerde BCG destijds getest in vivo. De bacteriële oppervlak was gemakkelijk gelabeld met biotine voor snelle weergave van de chimeer antigenen avidin zonder enige detecteerbare veranderingen in bacteriële fenotypen. De resulterende gewijzigde BCG efficiënt wordt ingenomen door antigeen presentatie cel...

Een nieuwe techniek voor snelle antigeen weergave op een bacteriële oppervlak wordt gepresenteerd, waarbij het oppervlak biotinylation gevolgd door blootstelling aan proteïnen van belang in fusie met monomere avidin. Laden van BCG met geselecteerde antigenen met succes verbetert de immunogeniciteit, suggereren dat oppervlakte decoratie traditionele genetische benaderingen kan vervangen.

Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Het algemene doel van deze procedure is om oppervlakte-eiwitten op mycobacteriën tot expressie te brengen door middel van oppervlaktedecoratie met recombinante eiwitten als alternatief voor traditionele, genetisch gebaseerde benaderingen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke onderzoeksvragen op het gebied van mycobacteriologie, vooral op het gebied van ziekenhuisinteracties en vaccinontwikkelingen. Deze techniek kan worden gebruikt om te screenen op mogelijke interferentiefactoren of antigeenkandidaten.Het kan snel en eenvoudig worden vergeleken met veeleisende en tijdrovende traditionele genetisch gebaseerde benaderingen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Amina Talal, een onderzoeksassistent in mijn lab. Dit gedeelte van het protocol begint met het transformeren van P17 Aviden OVA-plasmide in E.Coli BL21.Om dit te doen, induceer je 250 milliliter E.Coli BL21-cultuur met IPTG gedurende drie uur bij 37 graden Celsius. Na drie uur lyseer je de bacteriën om de inclusielichamen op te lossen door eerst de geïnduceerde BL21-cultuur te bezinken en het supernatant weg te gooien. Vervolgens wordt het bezinksel opnieuw gesuspendeerd in 10 milliliter lyseringsbuffer en laat je de cellen 15 minuten lyseren.Ga vervolgens verder met de incubatie bij kamertemperatuur met behulp van een roterende shaker voor agitatie en laat het een nacht doorgaan. In de ochtend centrifugeer je het mengsel een half uur. Verzamel vervolgens het supernatant dat de opgeloste inclusielichamen bevat.Zuiver vervolgens de Aviden OVA-eiwitten met behulp van een nikkel NTA-kolom. Verdun eerst het supernatant een op twee in lyseringsbuffer en schat het volume. Bereid vervolgens een kolom voor met vier milliliter nikkel NTA-hars per 250 milliliter verdund supernatant en laad de verdunning op de kolom.Was vervolgens de kolom drie keer met 10 milliliter lyseringsbuffer met een pH van zeven per wasbeurt. Om het recombinante eiwit te verzamelen, was je de kolom met lysisbuffer die imidazool bevat en verzamel het eluaat. Als je recombinante eiwit vrij is van inclusielichamen, is de volgende procedure geschikt voor veel eiwitten in ons lab.Stel eerst de pH van de hervouwingsoplossing in op één eenheid boven of onder het iso-elektrisch punt van het eiwit. Vervolgens vervorm je geleidelijk en verdun je het eiwit tot een verdunning van 1 op 10 in hervouwingsoplossing. Laat vervolgens het eiwit 30 minuten op een magnetische roerder incuberen bij kamertemperatuur om het hervouwingsproces te voltooien.Ontzilt vervolgens en wissel het buffer van de hervouwde eiwitten uit naar PBS met behulp van een eiwitconcentrator. Volg dit door de kolom te centrifugeren en aliquots van oplosbaar eiwit te bewaren bij 20 graden Celsius. Werk in een bioveiligheidskabinet met persoonlijke beschermingsmiddelen omdat BCG een niveau 2-pathogeen is.Om het oppervlak van BCG-cellen te biotinyleren, kweek je de cellen eerst op een schuddende platform tot de juiste dichtheid. Verzamel ongeveer een miljard cellen en was ze drie keer met 500 microliter ijskoud, endotoxine-vrij PBST. Draai vervolgens de cellen naar beneden en suspendeer ze in steriele, endotoxine-vrije PBS.Bereid vervolgens vers 10 millimolar sulfo-NHSSS-biotine in sterieel gefilterd water. Incubeer vervolgens de bacteriën in één milliliter bouillon met 0,5 millimolar sulfo-NHSSS-biotine. Voer de incubatie uit bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Was vervolgens de nu gelabelde bacteriën drie keer met 500 microliter ijskoud PBST, zoals eerder, om het niet-gereageerde reagens te verwijderen. Suspendeer vervolgens het bezinksel in één milliliter PBST. Om de biotinyleringseffizienz te evalueren, kleur je een aliquot van 100 miljoen biotinyleerde BCG met 25 microliter Strepravidin-FITC.Incubeer vervolgens de gekleurde bacteriën kort in para-formaldehyd en meet vervolgens het niveau van biotinylering met behulp van flowcytometrie. Na het beoordelen van de groei en overleving van de biotinyleerde mycobacteriën, ga je verder met het binden van het Aviden-fusie-eiwit eraan. Meng eerst 500 miljoen biotinyleerde BCG's met Aviden-fusie-eiwit voor een eindconcentratie van 10 microgram eiwit per milliliter.Laat deze reactie een uur incuberen bij kamertemperatuur op een shaker. Was vervolgens de bacteriën drie keer met 500 microliter ijskoud PBST. Kleur vervolgens de bacteriën met konijn anti-Aviden-antilichaam gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Na 20 minuten voer je een wasstap uit met 500 microliter ijskoud PBST. Kleur vervolgens de bacteriën met FITC-geconjugeerd geiten-anti-konijn IGG-antilichaam. Was vervolgens de bacteriën met 500 microliter ijskoud PBST en analyseer de bacteriën door flowcytometrie om de oppervlaktedecoratie te evalueren.Nadat het beschreven protocol is gevolgd, toont de cytologie dat er minimale niveaus van OVA-binding waren aan niet-biotinyleerde bacteriën en significante niveaus van OVA-binding aan biotinyleerde bacteriën. Belangrijk is dat de niveaus van Aviden OVA op het bacteriële oppervlak stabiel en detecteerbaar bleven één maand na lyofilisatie en opslag bij kamertemperatuur. Vervolgens werden RAW-cellen en dsRed-bacteriën gebruikt om een fagocytose-assay uit te voeren.Bemoedigend genoeg was er geen remming in het macrofaagfenotype. Om het lot van Aviden OVA gedecoreerde BCG's binnen macrofagen te onderzoeken, werden adherante RAW-cellen geïnfecteerd en onderzocht door middel van fluorescentiemicroscopie. Aviden OVA was niet alleen aanwezig op het bacteriële oppervlak, maar werd ook losgemaakt en verplaatst naar het cytoplasma ver van de bacteriën.Een immuno-goudkleuringsexperiment toonde aan dat Aviden OVA-antigenen zich kunnen losmaken van het BCG-oppervlak, de fagosomale membraan kunnen passeren en naar het cytosol kunnen reizen. Macrofagen die waren geïnfecteerd met Aviden OVA BCG vertoonden co-lokalisatie van Avi OVA met IA-moleculen. Dit suggereert dat Aviden-fusie-

expression-exogenous-antigens-mycobacterium-bovis-bcg-vaccine-via-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een alternatieve benadering voor de opsomming van...

Een functioneel geheel Bloed Test van de levensvatbaarheid van Mycobacteriën Meet, met behulp van Reporter-Gene Tagged BCG of M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

This video demonstrates the induction of systemic inflammation in an anesthetized mouse. The injection of mycobacterial antigen-adjuvant depots triggers cytokine release and localized inflammation. Lymphatic vessels open, enabling immune cell entry into lymph nodes and activation of T cells, which release pro-inflammatory cytokines, leading to widespread inflammation.

Subcutaneous Injection of Bacterial Antigen to Induce Systemic Inflammation in a Murine Model

This video demonstrates the preparation and quantification of Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux inoculum using bioluminescence assay and the enumeration of colony-forming units. The prepared inoculum can be used for infection studies.

Preparation and Quantification of Mycobacterium bovis BCG lux Inoculum for Infection

This video demonstrates a method to generate multivalent-displaying outer membrane vesicle (OMV) vaccines. Mammalian cells are transfected to express and secrete viral antigens fused to a SpyTag and a polyhistidine tag. These antigens are then purified using a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column. The purified antigen is mixed with outer membrane vesicles expressing surface-bound SpyCatcher (SC) protein. Multiple antigens covalently attach to SpyCatchers via their SpyTags (ST),...

Generating a Multivalent-Displaying Outer Membrane Vesicle Vaccine

The video demonstrates a technique for loading antigens on Mycobacterium bovis BCG to improve its immunogenic properties. The method uses the avidin-biotin system to coat the bacterial surface with exogenous antigens.

An Avidin-Biotin Conjugation Technique for Presenting Target Antigens on Mycobacterium bovis BCG

Lange-termijn gekweekte interferon-γ enzymgebonden immunospot assay wordt gebruikt als maat voor centraal geheugen responsen en correleert met beschermende anti-mycobacteriële vaccinresponsen. Met deze assay worden perifeer bloed mononucléaire cellen gestimuleerd met mycobacteriële antigenen en interleukine-2 voor 14 dagen, waardoor differentiatie en expansie van centrale geheugen T-cellen.

Toepassing van Lange-termijn gekweekte interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay voor het beoordelen van effector en geheugen T cel responsen in Vee

Wij beschrijven hierin de methodologie die we hanteerden om de beschermende werkzaamheid en longimmuunrespons te vergelijken die werd geïnduceerd door intranasale en subcutane immunisatie met BCG in een muismodel. Onze resultaten tonen de voordelen van longvaccinatie aan en suggereren een rol voor IL17-gemedieerde respons in vaccin-geïnduceerde bescherming.

Beschermende werkzaamheid en Pulmonale immuunrespons na subcutane en intranasale BCG Administration in Muizen

Het huidige protocol beschrijft de bio-engineering van buitenmembraanblaasjes als een "Plug-and-Display" vaccinplatform, inclusief productie, zuivering, bioconjugatie en karakterisering.

Een "Plug-And-Display" nanodeeltjesvaccinplatform op basis van buitenmembraanblaasjes met SARS-CoV-2-receptorbindend domein

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV's) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV's kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV's die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Hier presenteren we een alternatief protocol om actief experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren bij C57BL / 6-muizen, met behulp van het immunogene epitoop myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35-55 gesuspendeerd in onvolledig Freund's adjuvans met de hitte-gedode Mycobacterium avium ondersoort paratuberculosis.

Adjuvante activiteit van mycobacterium paratuberculosis bij het verbeteren van de immunogeniciteit van autoantigenen tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis

De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.

Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose

Leer oppervlakte-decoratie van Mycobacterium bovis BCG met het avidine-biotinesysteem als snel alternatief voor genetische methoden. Deze techniek verbetert de immunogeniciteit en versnelt vaccinontwikkeling aanzienlijk.

Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine (Video) | JoVE Journal

Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine

Meer video's verkennen