Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo
October 16th, 2017
Een protocol voor de structurele analyse van polysacchariden door elektroforese van het gel (PACE), met behulp van mannan als voorbeeld is beschreven.
Het algemene doel van dit experiment is het karakteriseren van polysachariden in de plantencelwand. Deze methode kan ons helpen antwoorden te geven op belangrijke vragen in het veld van de plantencelwandbiologie, inclusief de structuur en hoeveelheid glucomannaan. Het grote voordeel van deze techniek is dat er geen gespecialiseerde training of dure apparatuur nodig is.
Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de interpretatie van de gels, dus de opname en het begrijpen van alle beschreven controles is cruciaal. Het alcohol en oplosbaar residu, of AIR, wordt eerder bereid uit geoogst plantmateriaal zoals beschreven in het tekstprotocol. Weeg zes milligram AIR in een 15-milliliter centrifugebuis en voeg water toe tot een uiteindelijke concentratie van twee milligram per milliliter.
Vortex om een gelijkmatige suspensie te bereiken. Pipetteer 500 microgram in microfugebuisjes. Droog de aliquots met behulp van een vacuümcentrifuge bij 30 graden Celsius een nacht.
Behandel de AIR inclusief een aliquot voor een enzymvrije AIR controle met één molair natriumhydroxide gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg na één uur 200 microliter water en 20 microliter één molair zoutzuur toe aan elke buis om het natriumhydroxide te neutraliseren. Test of de pH ongeveer zes tot zeven is door één microliter te verwijderen en het op de papieren pH-indicatorstroken te druppelen.
Voeg 50 microliter één molair ammoniumacetaatbuffer pH 6,0 toe, en voeg water toe tot een totaal volume van 500 microliter aan elke buis. Om deze procedure te beginnen, voegt u een vooraf bepaalde hoeveelheid mannanasen toe aan de AIR-aliquots en buffer. Neem passende negatieve controles mee, evenals een positieve controle.
Vortex en draai vervolgens kort om de reactiemixture in de bodem van de buis te verzamelen. Incubeer bij 37 graden Celsius met zachte agitatie gedurende de nacht. Op de volgende dag stopt u de reactie door 20 minuten te incuberen bij 95 graden Celsius.
Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 10 minuten. Bewaar de supernatant en suspendeer elke pellet opnieuw in 250 microliter water. Centrifugeer opnieuw en bewaar de supernatant.
Combineer beide supernatanten en droog in een vacuümcentrifuge bij 30 graden Celsius gedurende ongeveer drie uur. Voorafgaand aan de derivatisatieprocedure, bereidt u de benodigde reagentia voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwarm de stockoplossing van 0,2 molair ANTS tot 60 graden Celsius om de vaste stof volledig op te lossen.
Voeg aan elk monster vijf microliter ANTS, vijf microliter twee-picoline-boraan en 10 microliter derivatisatiebuffer toe. Draai kort om in de bodem van de buis te verzamelen, vortex grondig en draai vervolgens weer kort. Incubeer de monsters gedurende de nacht bij 37 graden Celsius beschermd tegen licht.
Op de volgende dag droogt u de monsters in een vacuümcentrifuge bij 30 graden Celsius gedurende ongeveer twee uur. Suspendeer elk monster opnieuw in oligosaccharidestandaard en 100 microliter drie molair ureum. Bewaar bij min 20 graden Celsius beschermd tegen licht tot het nodig is.
De montage van de gelgietapparatuur hangt af van het merk. Voor de apparatuur die in deze demonstratie wordt gebruikt, komt één gel overeen met 50 milliliter. In een 50-milliliter centrifugebuis, meng 20,2 milliliter water, vijf milliliter 10x PACE buffer, 24,6 milliliter 40% acrylamide/Bis-acrylamide, 200 microliter APS en 20 microliter TEMED.
Keer voorzichtig om te mengen, zorg ervoor dat u geen luchtbellen introduceert. Gebruik een serologische of andere grote-volumepipet om de resolutiegel te gieten tot ongeveer vier centimeter onder de bovenkant van de glazen platen. Bedek de gel voorzichtig met isopropylalcohol.
Laat de gel 20 tot 30 minuten polymeriseren. Giet de bovenste laag af. Droog eventueel overtollig vocht af met blottingpapier.
Maak vervolgens de stackinggel. In een 15-milliliter centrifugebuis, meng 6,8 milliliter water, één milliliter 10x PACE buffer, 2,8 milliliter acrylamide/Bis-acrylamide, 80 microliter APS en acht microliter TEMED. Keer om om te mengen, en plaats het bovenop de gepolymeriseerde resolutiegel.
Plaats voorzichtig de kam in om luchtbellen onder de kamtanden te voorkomen. Nadat de gel is gepolymeriseerd, wikkel deze in vochtig weefsel en vervolgens in plasticfolie en bewaar deze bij vier graden Celsius tot het nodig is. Om het volgend van de laadvolgorde bij te houden en om te identificeren waar de putjes zijn zodra de kam is verwijderd, gebruik een permanente marker om de putposities op het glas te labelen.
Verwijder de kam. Vul de putjes met één-X PACE buffer. Gebruik een 10-microliter microsyringe om twee microliter standaarden en monsters in de putjes te laden.
Vermijd het gebruik van de buitenste banen die de neiging hebben om monsters slecht te draaien en laat een lege baan tussen monsters. Monteer de bovenste kamer van de gel-loopapparatuur en plaats de gel in een gekoelde looptank met één-X PACE buffer. Vul de bovenste kamer met één-X PACE buffer.
Schakel de stroom in en laat de gel draaien bij 200 volt gedurende 30 minuten. Na 30 minuten, verhoog het voltage naar 1.000 volt gedurende één uur en 40 minuten. Bescherm de gel tegen licht.
Begin door het gelbeeldsysteem af te vegen met vochtig, pluisvrij weefsel om ervoor te zorgen dat het stofvrij is. Verwijder de gel uit de PACE-tank en bekijk kort terwijl de gel nog in de glazen platen zit om te bepalen of de kleurfront nog op de gel staat. Gebruik een wiggereedschap om de gel te openen en terwijl de gel nog op één glazen plaat ligt, gebruik een pizzames om zowel de stackinggel als de bodem van de gel te verwijderen als het kleurfront nog op de gel staat.
Spuug ongeveer vijf milliliter water op het oppervlak van de transilluminator en breng de gel vervolgens direct aan op de transilluminator. Stel met behulp van de software de filter in op UV 605 en schakel de langgolf UV-trans
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor de structurele analyse van polysacchariden met behulp van gelelektroforese (PACE), met een focus op mannan. De methode beoogt het begrip van polysacchariden in de plantencelwand en hun kenmerken te verbeteren.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantenbiologie
- Polysaccharidenanalyse
- Gelelektroforesetechnieken
Achtergrond
- Plantencellenwanden zijn samengesteld uit verschillende polysacchariden.
- Begrip van de polysaccharidenstructuur is cruciaal voor plantenbiologie.
- Glucomannan is een belangrijke component van plantencellenwanden.
- Traditionele methoden kunnen gespecialiseerde training en apparatuur vereisen.
Doel van het onderzoek
- Om de structuur en hoeveelheid van polysacchariden in de plantencellenwand te karakteriseren.
- Om een eenvoudige methode voor onderzoekers te bieden om polysacchariden te analyseren.
- Om het onderzoek van glucomannan in de plantenbiologie te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van alcohol-onoplosbaar residu (AIR) uit plantaardig materiaal.
- Derivatisering van monsters met behulp van ANTS voor gelelektroforese.
- Bereiding en uitvoering van gel met PACE-methodologie.
- Beeldvastlegging en analyse van gelresultaten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle karakterisering van mannan-gehalte in plantenmonsters.
- Demonstratie van de effectiviteit van de PACE-methode.
- Verschaffing van een duidelijk protocol voor onderzoekers die nieuw zijn in polysaccharidenanalyse.
- Visuele weergave van resultaten door middel van gelbeeldvorming.
Conclusies
- De PACE-methode is toegankelijk en effectief voor polysaccharidenanalyse.
- Begrip van de polysaccharidenstructuur kan de onderzoeksvoortgang in de plantenbiologie bevorderen.
- Opname van controles is cruciaal voor een nauwkeurige interpretatie van resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Structural characterization of plant cell wall polysaccharides like mannan supports target validation in agrochemical and bio-based material development by enabling mechanistic de-risking of enzyme-substrate interactions. The PACE method provides a low-barrier, reproducible approach for generating quantitative oligosaccharide fingerprints, facilitating assay development and lead identification in enzyme engineering pipelines. Its reliance on defined glycosyl hydrolases and fluorescent detection allows for scalable, cross-functional use in early discovery workflows where predictive confidence in polysaccharide modification is required.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycosyl hydrolase specificity and activity on defined polysaccharide substrates, supporting target validation through direct structural readouts.
- Operational Value: Reduces dependency on specialized equipment and expert training, lowering technical barriers for high-throughput screening of enzyme libraries.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolvable oligosaccharide profiles that distinguish linkage and branching patterns, enabling quantitative comparison of enzyme variants.
- Operational Value: Uses standard gel electrophoresis and fluorescent labeling, allowing integration into existing analytical platforms with minimal revalidation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery to preclinical by providing transferable methods for analyzing polysaccharide modifications in disease-relevant systems such as plant-pathogen interactions or biofilm models.
- Operational Value: Enables cross-lab reproducibility through standardized controls and replicable fingerprinting, supporting technology transfer and collaborative projects.
Pipeline & Workflow Integration
The PACE method fits within the discovery continuum from target engagement to lead optimization, particularly in workflows requiring functional validation of carbohydrate-active enzymes or modulation of polysaccharide biosynthesis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enzyme function by resolving product profiles from polysaccharide hydrolysis, clarifying mechanism of action.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs via fluorescent oligosaccharide separation, enabling hit-to-lead progression in enzyme engineering campaigns.
- Analytics: Provides measurable dependent variables (oligosaccharide migration and intensity) that allow statistical comparison across conditions and replicates.
- Translational Research: Connects enzyme characterization to phenotypic outcomes in systems where polysaccharide structure impacts virulence, immunity, or material properties.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform applicable to any polysaccharide with characterized hydrolases, maximizing reagent and protocol investment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in enzyme specificity and reduces false positives through direct structural verification of hydrolysis products.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via internal controls (no-enzyme, positive, negative) and replicable gel-based quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in enzyme development by linking biochemical activity to defined structural outcomes, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of enzyme candidates based on quantitative polysaccharide modification profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate biochemistry and enzymatic hydrolysis to select appropriate glycosyl hydrolases and interpret oligosaccharide patterns.
- Depends on access to gel electrophoresis equipment capable of resolving small oligosaccharides and a fluorescent imaging system compatible with ANTS labeling.
- Necessitates standardization of AIR preparation, enzyme units, and incubation conditions across users to ensure inter-lab comparability.
- Adaptation to novel polysaccharides requires validation of hydrolase specificity and optimization of hydrolysis and derivatization steps.
- Practical limitations include lower throughput compared to HPLC or MS-based methods and reliance on gel image analysis for quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Aliquoting and Pre-treatment of Alcohol Insoluble Residue (AIR)
2:11
Hydrolysis of AIR with Glycosyl Hydrolases
3:20
Derivitization of Oligosaccharides
4:29
Preparation of PACE Gels
6:33
Running a PACE Gel
7:51
Visualizing a PACE Gel
9:07
Results: Characterization of Plant Cell Wall Glucomannam Structure
10:30
Conclusion
