Stereotactically-geleide ablatie van de auditieve Cortex van de Rat en de lokalisatie van de laesie in de hersenen
11 oktober 2017
Beschrijven we een methode voor de stereotactically-geleide locatie, belichting en ablatie van de auditieve cortex in ratten. De lokalisatie van de ablatie wordt beoordeeld met behulp van een coördinaat kaart postmortale.
Het algemene doel van deze procedure is om de stereotactisch geleide ablatie van de auditieve cortex te beschrijven en het gebruik van een coördinaatkaart om de laesie te lokaliseren over een afbeelding van het oppervlak van de hersenen. Deze methode kan onderzoekers in de auditieve neurowetenschap helpen bij het aanpakken van de rol van corticale structuren in de pathway voor de perceptie van geluid. Evenals de mechanismen en de lineaire positionele plasticiteit.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de chirurgische blootstelling en ablatie van de auditieve cortex mogelijk maakt door gebruik te maken van basale methoden die door elke onderzoeker kunnen worden aangepast. Dus deze methode kan nuttig zijn in het veld van de auditieve neurowetenschap, het kan ook worden toegepast in andere systemen zoals het visuele en somatosensorische. Deze methode kan ook worden gebruikt om defecten te bestuderen die unilateraal ablatie van de auditieve cortex in andere corticale gebieden veroorzaakt.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de juiste identificatie en vertaling van de stereotactische coördinaten in het slaapbeen essentieel is om de auditieve cortex nauwkeurig te lokaliseren. Om deze procedure te starten, plaats de verdoofde rat op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te handhaven. Stabiliseer vervolgens het hoofd van het dier in een stereotactisch frame met behulp van twee oorstaven en een bekstaaf.
Scheer het hoofdhaar en desinfecteer het operatiegebied met povidon-jodium. Gebruik een scalpel om een incisie langs de middenlijn te maken om de schedel bloot te leggen en het periost dat het oppervlak van de schedel bedekt, terug te trekken. Gebruik vervolgens een steriele wattenstaafje om voorzichtig al het bloed dat het oppervlak van de schedel bedekt, te verwijderen.
Om Bregma, Lambda en de interaurallijn te visualiseren, maak een incisie in de temporale spier nabij zijn dorsale invoegpunt op de schedel met een scalpel. Trek vervolgens de spier uit met behulp van een naald en hechtmateriaal en bevestig het hechtmateriaal aan het stereotactisch frame om het slaapbeen bloot te leggen. Laat langzaam een steriele rechte naald zakken tot deze zich direct boven het oppervlak van de schedel bevindt, zodat de punt van de naald op interaural nul staat.
Stel dit punt als nul in. Daarna richt u zich op de AC met behulp van vier punten. Vervolgens laat u de naald zakken tot direct boven het slaapbeen om elk van deze vier punten te visualiseren.
Markeer de punten met een marker op het slaapbeen en verbind ze om een rechthoek te tekenen. De rechthoek zal dienen als gids om een venster in het bot te openen. Open in deze procedure het venster met behulp van een elektrische boor en een kleine boortje.
Boor de omtrek van de rechthoek bij 8.000 tpm tot het bot geeft. Koel het boorvlak af door het met koud steriel zoutrouw te spoelen om schade aan subcorticale structuren te voorkomen. Wanneer het bot geeft, wees voorzichtig dat u niet in de hersenen boort.
Wanneer de randen los zitten, trekt u het bedekkende bot omhoog met een fijne pincet en bewaart u het in koud steriel zoutrouw. Gebruik een chirurgisch microscoop om de hersenvliezen voorzichtig te snijden met een microchirurgisch mes en verwijder ze met behulp van twee fijne puntige pincetten. Als er bloeding optreedt, spoel het operatiegebied dan met koud steriel zoutrouw.
Aspibeer vervolgens voorzichtig de AC met behulp van een chirurgisch zuigapparaat gekoppeld aan een steriele 20-gauge stompe naald. Aspibeer alleen de zes corticale lagen en niet de onderliggende witte stof. Dit punt is cruciaal en moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd.
Wanneer de aspiratie is voltooid, bedekt u het operatiegebied met het verwijderde bot en brengt u een absorberende hemostatische gaas aan. Laat de temporale spier zijn oorspronkelijke positie herstellen en naai vervolgens de huid met wondclips. Breng daarna antibioticumzalf aan op de wond.
Injecteer vervolgens Buprenorfine subcutaan in de rug van de rat als analgeticum, één uur en acht uur na het einde van de operatie. Houd het dier op het verwarmingskussen totdat het wakker wordt en breng het terug naar zijn kooicage voor herstel. Wanneer het onderzoek met de AC-ablateerde rat is voltooid, anesthesieert u het terminaal door intraperitoneale injectie van 0,1 milliliter natriumpentobarbital.
Na het uitvoeren van een intracardiale infusie van Ringer-oplossing en formaldehyde, verwijdert u de huid en het spierweefsel van het hoofd om de schedel bloot te leggen. Gebruik Spencer-schaar om een transversale snede in het orbitale bot te maken. Verwijder vervolgens de achterkant van de schedel en gebruik rongeurs om langs de bovenranden van de schedel te snijden om de hersenen bloot te leggen.
Wees voorzichtig om de hersenen niet te beschadigen. Zodra de hersenen zijn blootgelegd, verwijdert u voorzichtig het hersenvlies met behulp van fijne puntige pincetten. Gebruik een vinger om voorzichtig onder en boven de hersenen te schuiven.
Til vervolgens de hersenen op en snijd de zenuwen door totdat ze los zijn. Dompel vervolgens de hersenen in formaldehyde-oplossing en bewaar ze 24 uur bij vier graden Celsius. Na post-fixatie plaatst u de hersenen voorzichtig in een sagittale rattenhersenmatrix, waarbij de laterale oppervlakte van de hersenen wordt blootgelegd.
Plaats een camera 21 centimeter boven het cortexoppervlak met behulp van een camerahouder. Selecteer vervolgens de super-macro-opnamemodus en maak een foto van het oppervlak van de hersenen. Gebruik vervolgens een beeldbewerkingsprogramma om de afbeeldingen te openen en ze 50% te verkleinen. Identificeer de Bregma, Lambda en interaural nulreferenties en markeer hun positie in de foto's.
Teken de contour van de ablatie over de laterale foto van de hersenen. Importeer de coördinaatkaart waar de primaire en secundaire gebieden van de auditieve cortex zich bevinden, naar het bestand van het bewerkingsprogramma. Klik vervolgens op de kaart en sleep deze om deze boven de laterale foto van de afgeblateerde hersenen te plaatsen.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor de stereotactisch geleide ablatie van de auditieve cortex bij ratten. De techniek maakt een nauwkeurige lokalisatie van de laesie mogelijk met behulp van een coördinaatkaart, die postmortem wordt beoordeeld.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Auditieve verwerking
- Chirurgische technieken
Achtergrond
- De auditieve cortex speelt een cruciale rol bij de geluidsperceptie.
- Inzicht in corticale functies kan bijdragen aan onderzoek in de auditieve neurowetenschappen.
- Unilaterale ablatie kan andere corticale gebieden beïnvloeden.
- Een visuele demonstratie van de methode is essentieel voor een nauwkeurige uitvoering.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor de ablatie van de auditieve cortex.
- Om onderzoek naar de corticale rollen bij geluidsperceptie te vergemakkelijken.
- Om aanpassing van de methode voor andere sensorische systemen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Stabilisatie van de kop van de rat in een stereotaxisch frame.
- Incisie en blootlegging van de schedel voor gerichte ablatie.
- Gebruik van een coördinatenkaart voor precieze lokalisatie van de auditieve cortex.
- Postmortale beoordeling van de laesie met behulp van beeldvormingstechnieken.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een succesvolle ablatie van de auditieve cortex mogelijk.
- Postmortale analyse bevestigt de nauwkeurige lokalisatie van de laesies.
- Aangetoonde potentie voor het bestuderen van effecten op andere corticale gebieden.
- Het protocol kan worden aangepast voor andere sensorische systemen.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor onderzoek naar de auditieve cortex.
- Het biedt een basis voor verdere studies naar corticale functies.
- Visuele en procedurele duidelijkheid bevordert de reproduceerbaarheid in het onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Dit protocol maakt precieze stereotactische ablatie en postmortale lesion mapping van de auditieve cortex van de rat mogelijk, ter ondersteuning van mechanistische studies naar corticale functies in sensorische verwerkingspaden. De methode biedt een reproduceerbaar preklinisch model voor het onderzoeken van target engagement en downstream neurale effecten na corticale perturbatie, wat relevant is voor het verminderen van risico's bij hypothesen voor CNS target validatie. Door chirurgische interventie te combineren met coördinaatgebaseerde bevestiging van de laesie, wordt de interpreteerbaarheid van gegevens verbeterd en de ambiguïteit bij het koppelen van corticale ablatie aan fenotypische uitkomsten verminderd.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de functie van de auditieve cortex in geluidsperceptiepaden om mechanistische hypothesen over corticale doelen te valideren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde stereotactische coördinaten om consistente targeting over experimenten heen te waarborgen, waardoor variabiliteit in de plaatsing van laesies wordt verminderd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert models met gedefinieerde laesies die geschikt zijn voor het screenen van compensatoire veranderingen in verbonden sensorische systemen, zoals contralaterale corticale of subcorticale kernen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van basisneurochirurgische instrumenten (boor, zuiger, pincet) die toegankelijk zijn voor de meeste academische en industriële onderzoekslaboratoria, wat een brede adoptie ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert het onderzoek naar de effecten van unilaterale ablatie van de auditieve cortex op de genexpressie in perifere systemen zoals het slakkenhuis, wat mechanistische risicoanalyse op verschillende niveaus mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Bevat postmortem validatie via coördinaatmapping en immunovleking om de omvang van de laesie en de integriteit van de witte stof te bevestigen, wat de betrouwbaarheid van het model verbetert.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fase van discovery biology, waarbij gerichte corticale ablatie hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden ondersteunt voordat men overgaat naar leadidentificatie of fenotypische screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt functionele ondervraging van corticale targets door nauwkeurige ablatie en postmortale bevestiging van de lokalisatie van de laesie mogelijk te maken.
- Screening: Bereidt gevalideerde laesiomodellen voor voor downstreambeoordeling van moleculaire of fysiologische readouts in onderling verbonden neurale circuits.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking van moleculaire markers (bijv. GluA2/GluA3 expressie) tussen geablateerde en controleweefsels mogelijk met behulp van qPCR of immunokleuring.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt centrale corticale manipulatie met veranderingen in perifere biomarkers, wat de translationele continuïteit van het CZS naar de sensorische periferie ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Aanpasbaar aan andere sensorische systemen (visueel, somatosensorisch), waardoor het chirurgische en mapping-kader kan worden hergebruikt in verschillende discovery-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de locatie en omvang van de laesie te bevestigen, waardoor het vertrouwen in de relaties tussen target en fenotype toeneemt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van reproduceerbare stereotactische stappen en coördinaatgebaseerde validatie, wat de consistentie tussen laboratoria verbetert.
- Strategische waarde: Onderbouwt go/no-go-beslissingen door te onthullen of modulatie van het corticale target de verwachte downstream-effecten produceert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functionele validatie in ziekte-relevante neurale circuits.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stereotactische neurochirurgie en microsurgische technieken om beschadiging van subcorticale structuren tijdens het boren in het bot en het verwijderen van de meninges te voorkomen.
- Is afhankelijk van steriele instrumenten, een stereotaxisch frame, een chirurgische microscoop en een imaging-opstelling voor postmortale visualisatie van de hersenen.
- Maakt standaardisatie van de procedures voor coördinaatmapping noodzakelijk om een nauwkeurige lokalisatie van laesies tussen verschillende operators en sessies te garanderen.
- Moet zorgvuldig worden aangepast bij toepassing op andere sensorische systemen vanwege verschillen in de corticale anatomie en stereotactische coördinaten.
- Beperkt tot acute of subchronische studies vanwege restricties met betrekking tot de postoperatieve overleving; chronische effecten vereisen aanvullende herstel- en monitoringsprotocollen.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Location of the AC in the Temporal Bone of the Rat
3:04
Surgical Exposure and Ablation of the AC
5:07
Tissue Collection
6:18
Localization of the AC Lesions
7:56
Results: Changes in mRNA Levels of AMPA Receptor Subunits GluA2 and GluA3 After Unilateral AC Ablation 7 Days Post-Lesion
8:38
Conclusion
