Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem
December 28th, 2017
Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.
Het algemene doel van deze gemodificeerde roller tube-methode voor hersenslice-cultuur is om een gesloten kweeksysteem te bieden voor langetermijnslice-overleving. met de mogelijkheid voor repetitieve hoge resolutie fluorescend beeldvorming. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in neuronale ontwikkeling en neurodegeneratieve aandoeningen die observaties van dezelfde neuronen in de loop van de tijd vereisen, zoals het lokaliseren van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij synapsevorming of -verlies.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het volledig gesloten kweeksysteem dat veilig gebruik van virussen voor eiwitexpressie mogelijk maakt en het gebruik van geëtste deksels om dezelfde cellen voor beeldvorming te lokaliseren. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we slices op deksels in rollerbuizen aan het kweken waren, maar nodigden een betere manier om veranderingen in levende slices in de loop van de tijd te visualiseren. Het wijdverbreide gebruik van virale vectoren om transgenen en specifieke celpopulaties voor microscoopbeeldvorming tot expressie te brengen, dreef ons ertoe een gesloten systeem te ontwikkelen om gebruikers te beschermen en besmetting van microscoopobjectieven te elimineren.
De mogelijkheid om de identieke populatie cellen binnen hersenslices in de loop van de tijd te volgen, maakt studies mogelijk over de ontwikkeling van pathologische veranderingen en synapsveranderingen in knaagdiermodellen van menselijke neurologische aandoeningen. Om te beginnen bereidt u de rollerbuisrek voor en maakt u een jig om te helpen bij het boren van een gat in de rollerbuizen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Gebruik de jig om een platzijdige, een centimeter, kunststof kweekbuis in positie te houden, zodat de platte kant naar boven gericht is.
Boor vervolgens een gat van zes millimeter diameter met het middelpunt één centimeter van de bodem en gecentreerd tussen de zijden van de buis. Maak met het draaibare ontbramengereedschap de randen van het gat glad en maak vier groeven op de binnenrand van het gat om het draineren van het gat tijdens rotatie te vergemakkelijken. Spoel vervolgens de buizen met 70% ethanol en droog ze vervolgens in een biologisch veiligheidskabinet.
Steriliseer de buizen in enkele 12 millimeter geponste zelfklevende siliconenrubberschijven gedurende 40 minuten onder de UV-lamp. Na 20 minuten herpositioneert u de buizen en schijven zodat alle blootgestelde oppervlakken gesteriliseerd zijn. Schil vervolgens de witte achterkant van de zelfklevende schijf af, lijn de gaten uit en bevestig het siliconenrubber aan de buitenkant van de buis.
Zodra de slices zijn verkregen, plaatst u twee microliters kippenplasema in het midden van de geëtste zijde van een voorbereide deksel. Verspreid het plasma lichtjes om een vlek van drie tot vier millimeter diameter te verkrijgen. Gebruik vervolgens een steriele, smal-uitlopende spatel om een voorbereide hersenslice op te tillen.
Gebruik gesloten pincetten om de slice op het puntje van de spatel te houden terwijl u de slice optilt. Raak de spatel aan op de plasmavlek op het deksel en duw met gesloten pincetten de slice op het deksel. Voeg een dunne laag kippenplasema toe aan het deksel voordat u de slice plaatst en een minimale hoeveelheid trombine-behandeld plasma om de slice te bedekken.
Als de slice drijft, zal deze niet hechten wanneer de wolk wordt verwijderd. Meng vervolgens 2,5 microliter plasma en 2,5 microliter trombine in een aparte buis. Plaats snel 2,5 microliter van dit mengsel over en rond de slice en pipet op en neer om het voorzichtig te mengen.
Verwijder de heldere, plastic afdekking van de blootgestelde zijde van het zelfklevende siliconenrubber dat eerder op de rollerbuis was bevestigd. Plaats vervolgens het deksel met de hersenslice op de kleefstof en lijn de slice uit binnen het gat. Om hechting te garanderen, oefent u zachte, gelijkmatige druk uit op het deksel met de duim door het deksel gelijkmatig naar beneden te drukken en het ongeveer een minuut vast te houden terwijl u het naar het biologisch veiligheidskabinet overbrengt.
De druk op het deksel om het aan de buis te hechten zonder lekkage moet precies goed zijn en lang genoeg worden gehandhaafd om luchtkanalen in de salient te elimineren. Te veel druk zal het deksel barsten laten. Voeg in een biologisch veiligheidskabinet 0,8 milliliter compleet neurobasaal kweekmedium toe aan elke buis.
Leidt vervolgens een mengsel van 5% koolstofdioxide en 95% lucht door een steriele katoenen prop Pasteurpipet die stevig wordt vastgehouden door een klem. Gebruik dit om de rollerbuis met het gasmengsel te spoelen en de buis snel af te sluiten terwijl deze uit de buurt van de pipet wordt getrokken. Label vervolgens de buizen met het slicenummer en reknummer.
Plaats de buizen in een rollerrek; zorg ervoor dat ze geometrisch uitgebalanceerd zijn. Als er een oneven aantal buizen is, voegt u lege buizen toe om uit te balanceren. Plaats de rekken in een rolincubator van 35 graden Celsius, met rollen die het rollerrek met 10 tot 13 omwentelingen per uur draaien.
Kantel de incubator ongeveer 5 graden naar achteren door het voorste deel op een bord te heffen. Breng een buis met een slice-cultuur over naar een op maat gemaakte buishouder zoals hier getoond. Plaats vervolgens de buishouder in de stageadapter om het deksel tijdens het beeldvormen loodrecht op het objectief te houden.
Duwt vervolgens de schuif op de stageadapter strak tegen de buis om de buis in positie te houden. Gebruik een viervoudig objectief onder helder veld trans-verlichting om te focussen op de geëtste rasterperiode onder de slice. Voor de eerste beeldvormingssessie, scant u snel rond de slice om de locatie en het aantal te registreren voor de verschillende regio's waar hogere vergrotingsbeeldvorming gewenst is.
Zodra de gebieden van belang zijn geïdentificeerd, beweegt u de stage naar het eerste rastervierkant dat een gebied van belang bevat. Schakel vervolgens over naar het 20-sterkte
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een gemodificeerde rollerbuismethode voor het kweken en beeldvorming van hersensneden van knaagdieren over langere perioden. De techniek handhaaft de levensvatbaarheid van neuronen terwijl het intermittente beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maakt, waardoor onderzoek naar neuronale ontwikkeling en neurodegeneratieve stoornissen wordt vergemakkelijkt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neurodegeneratieve stoornissen
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Langdurige overleving van hersensneden is cruciaal voor het bestuderen van neuronaal gedrag.
- Traditionele methoden hebben niet de mogelijkheid voor herhaalde beeldvorming van dezelfde neuronen in de loop van de tijd.
- Huidige benaderingen stellen sneden vaak bloot aan risico's van contaminatie en gecompromitteerd beeld.
- Deze gemodificeerde methode wil deze uitdagingen aanpakken.
Doel van de studie
- Om een volledig gesloten kweeksysteem te ontwikkelen voor veilig virologisch gebruik.
- Om hoge resolutie beeldvorming van dezelfde neuronpopulaties in de loop van de tijd mogelijk te maken.
- Om onderzoek naar eiwitlokalisatie gerelateerd aan synapsvorming te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Het primaire platform is een gesloten rollerbuissysteem voor hersensnedekweek.
- Het biologische model omvat hersensneden van knaagdieren voor het bestuderen van neuronale dynamica.
- Er worden geen multiomics workflows genoemd.
- Kritieke stappen omvatten het voorbereiden van buizen, het steriliseren van materialen en het waarborgen van goede hechting van sneden.
- Het systeem is ontworpen voor continue rotatie-incubatie bij een gecontroleerde temperatuur.
Belangrijkste resultaten
- De methode behoudt neuronale morfologie en levensvatbaarheid tijdens langdurige kweek.
- Het maakt herhaalde beeldvorming van dezelfde neuronpopulaties mogelijk om veranderingen in de loop van de tijd te volgen.
- Maakt lokalisatie van sleutelproteinen geassocieerd met synaptische veranderingen mogelijk.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een nieuwe techniek voor langdurige observatie van neurongedrag.
- Het gesloten systeem beschermt tegen contaminatie terwijl het de precisie van beeldvorming verbetert.
- De implicaties voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische veranderingen en neurodegeneratie zijn significant.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Long-term, repetitive high-resolution imaging of live brain slices is critical for mechanistic studies in neurodegeneration and synaptic biology. This modified roller tube method enables precise, longitudinal observation of neuronal populations in a fully enclosed system, supporting predictive confidence in target validation and pathway interrogation. The approach enhances portfolio decision-making by enabling robust, contamination-free studies of protein localization and cellular dynamics over time.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables longitudinal tracking of neuronal and glial changes relevant to disease mechanisms.
- Supports functional validation of targets through repeated imaging of the same cells after genetic or pharmacological manipulation.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct observation of synaptic and pathological protein dynamics.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, standardized platform for evaluating effects of candidate molecules on neuronal structure and viability.
- Allows for quantitative, high-resolution imaging outputs suitable for downstream analysis and comparison.
- Supports assay scalability and reuse by enabling precise repositioning and repeated imaging of defined regions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling studies of neurodegenerative pathology in rodent brain slices.
- Maintains translational continuity by supporting viral-mediated expression of disease-associated proteins and reporters.
- Enables risk-adjusted advancement by providing robust, longitudinal data on cellular responses to interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven, longitudinal studies of neuronal function and pathology in an enclosed, contamination-controlled system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on synaptic formation, loss, and protein localization in live tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides high-content, time-resolved imaging data for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Facilitates modeling of neurodegenerative processes and biomarker dynamics in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse neuronal and glial research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and safety in long-term culture and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling robust, longitudinal data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurobiological targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in brain slice preparation, viral handling, and advanced fluorescence imaging.
- Demands access to enclosed culture systems, photoetched coverslips, and high-resolution microscopy infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible imaging and data analysis.
- Adaptable to various rodent models and genetic backgrounds with appropriate protocol adjustments.
- Careful handling is essential to avoid slice damage and ensure consistent adhesion and imaging quality.
