De Transwell-migratietest

De transwell-migratietest is een klassieke techniek waarmee wetenschappers celbeweging kunnen kwantificeren. Migratie verwijst naar het vermogen van een cel om zich afzonderlijk of in clusters te verplaatsen. Celbewegingen worden mogelijk gemaakt door nauwkeurige herstructurering van hun cytoskelet en migratie vindt meestal plaats als reactie op stimuli die als signalen fungeren.

Vandaag bespreken we de transwell-migratietest, die een eenvoudige kameropstelling gebruikt om migratie te beoordelen als reactie op aantrekkende signalen.

We beginnen met wat achtergrondinformatie over de transwell-kamer.

Het apparaat werd voor het eerst ontworpen door Dr. Stephen Boyden in 1961, die het gebruikte om leukocytenmigratie te bestuderen. Daarom staat deze methode ook bekend als de Boyden-kamertest.

In een eenvoudige Boyden-kamer is de buitenwand van de putten, zoals die van een 96-wells plaat. In elke put wordt een transwell geplaatst, een cilindrische inzet. De inzet heeft een polycarbonaatmembraan met een gedefinieerde poriegrootte. Wanneer geplaatst in de put, verdeelt het de kamer in twee compartimenten. Het bovenste compartiment is waar cellen waarvan het migratiegedrag bestudeerd wordt, worden gezaaid, en het onderste reservoir is waar de oplossing van chemoattractant wordt geplaatst. Per definitie is een chemoattractant een molecuul dat het vermogen heeft om celbeweeglijkheid te bevorderen door "cellen aan te trekken."

Vanwege deze aantrekkelijke krachten migreren cellen in het bovenste compartiment door de poriën naar het onderste reservoir. Als de cellen adhesie-eigenschappen hebben, zoals sommige melanoomcellen, zullen ze na de beweging "vastzitten" aan de onderkant van het membraan. In dit geval kan het membraan worden gefixeerd, gekleurd en kunnen cellen onder de microscoop worden geteld. Aan de andere kant zullen niet-aderente cellen, zoals sperma, migreren naar het onderste reservoir. In dit geval kunnen cellen in de reservoiroplossing worden geteld met behulp van een hemocytometer.

Hoewel de opstelling voor deze test eenvoudig is, zijn er verschillende dingen waarmee u rekening moet houden voorafgaand aan het experiment. Laten we er een paar bekijken.

Te beginnen met de zaaidoplossing, moet u ervoor zorgen dat de dichtheid is geoptimaliseerd om celmigratie te observeren. Te weinig cellen kunnen resulteren in niet-detecteerbare migratie, en grotere dichtheden zullen de membraan overbevolken, waardoor het moeilijk wordt om migratie te tellen. De tweede overweging is de poriegrootte van de inzet. Deze moet zorgvuldig worden gekozen afhankelijk van het celtype. Als de poriegrootte te klein is, kunnen cellen er niet doorheen passeren.

Alternatief, als de poriegrootte te groot is, vallen cellen er gewoon door, wat geen migratie is. Ten slotte moet men op de concentratie van de chemoattractant letten en de incubatietijd die voor migratie is toegestaan, omdat deze onderling afhankelijk zijn. Optimale concentratie met een geschikte incubatietijd waarin het concentratiegradiënt tussen de compartimenten wordt gehandhaafd, induceert celmigratie door chemo-aantractie. Omgekeerd kunnen langdurige incubaties gepaard gaan met een evenwicht van chemoattractant door de kamer heen, wat leidt tot het verlies van chemisch gradiënt, wat de analyse van de verkregen resultaten kan verwarren.

Met deze overwegingen in gedachten, laten we een protocol bespreken dat wordt gebruikt om migratie van aderente cellen te meten.

Cellen die moeten worden getest, worden bereid in een protease-vrij medium, aangezien proteasen belangrijke membraanreceptoren kunnen denatureren en uiteindelijk de migratie beïnvloeden. Nadat de cellen zijn voorbereid, moet de suspensie worden verdund tot een optimale zaaidensiteit. Om de kamer voor te bereiden, worden transwells in putten op een multiwells plaat geplaatst. Celsuspensie moet worden gepipetteerd in de transwell zonder het membraan aan te raken of luchtbellen te introduceren.

Chemoattractantoplossing wordt gepipetteerd in het onderste reservoir, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de oplossing het membraan van de inzet raakt. De incubatietijd voor de migratie hangt af van de experimentele overwegingen. Na incubatie worden de membranen gefixeerd door de inzet in 70% ethanol te dompelen. Nadat de inzet is gedroogd, wordt celkleuroplossing toegevoegd.

Vervolgens worden cellen gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na incubatie worden de inzetjes gewassen met behulp van wasbuffer. Ten slotte kan het membraan worden uitgesneden en op een microscoopglaasje worden geplaatst. Cellen aan de onderkant van het membraan vertegenwoordigen het aantal cellen dat is gemigreerd in aanwezigheid en afwezigheid van chemoattractanten.

Nu u een idee hebt van het protocol, laten we een korte blik werpen op hoe onderzoekers deze methode gebruiken in hun exploraties.

Een van de meest voorkomende toepassingen van deze test is om de chemoattractanteigenschappen van onbekende verbindingen te evalueren. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het onderzoeken van zwempaden van kikkersperma in aanwezigheid van allurin, een stof die wordt uitgescheiden door amfibieëneieren. Om dit te doen, pipeteerd ze eerst actieve kikkersperma naar de bovenkant van de transwell-inzetjes. Onderaan voegden ze allurin toe. Nadat ze de cellen hadden laten migreren, telden ze het sperma in de reservoiroplossing onder een microscoop. Met behulp van deze techniek konden ze een concentratie-responscurve genereren die het effect van allurin-concentratie op spermamigratie weergeeft.

Wanneer een cel wordt aangevallen door pathogenen, stuurt het chemoattractanten uit om immuuncellen te rekruteren die migreren, zich hechten en vervolgens de infectie oplossen. Om dit fenomeen te testen, kweekten deze wetenschappers epitheelcellen op de onderkant van de inzetjes. Vervolgens infecteerden ze deze cellen met verschillende stammen van bacteriën. Ten slotte introduceerden ze immuuncellen in de bovenste kamer. Het is bekend dat de geïnfecteerde cellen verschillende chemoattractanten produceren die immuuncelmigratie induce