Multiplex Cytokine profilering van gestimuleerd muis Splenocytes met behulp van een kraal cytometrische gebaseerde Immunoassay Platform
9 november 2017
Dit protocol beschrijft de kwantificering van meerdere cytokine doelen tegelijkertijd in weefselkweek supernatant gestimuleerd muis splenocytes met behulp van multiplex kraal gebaseerde immunoassay platform en een stroom cytometer verkregen.
Het algemene doel van dit protocol is om meerdere cytokine-doelen gelijktijdig te kwantificeren in weefselkweeksupernaten die zijn verzameld van gestimuleerde muis splenocyten met behulp van een multiplex parelketting-gebaseerde immunoassay en een flowcytometer. Deze methode kan worden gebruikt om sleutelvragen te beantwoorden op het gebied van immunologie, zoals, wat zijn de unieke cytokineprofielen die de immuunrespons coördineren in de context van specifieke ziektetoestanden? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gelijktijdige kwantificering van meerdere anneliden kan worden uitgevoerd met gebruik van veel minder monstersvolumes dan traditionele ELISA-formaten, terwijl tegelijkertijd nonspecifieke binding wordt verminderd.
Nicholas Johnsen, een onderzoeksmedewerker van ons productontwikkelingsteam, zal de procedure demonstreren. Begin deze procedure met biologische monstervoorbereiding zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de voorgemengde antilichaam-geïmmobiliseerde parels voor te bereiden, soniceer de fles met voorgemengde parels gedurende één minuut in een sonicatorbad op kamertemperatuur.
Vervolgens vortex gedurende 30 seconden voor gebruik. Als er geen sonicatorbad beschikbaar is, verleng de vortextijd tot één minuut. Voor standaardvoorbereiding, voeg 250 microliter assaybuffer toe om de gelyofiliseerd muis Th Cytokine Standaardcocktail te reconstitueren.
Meng door kort te vortexen en laat de fles 10 minuten op kamertemperatuur staan. Breng de standaardcocktail over naar een polypropyleen microcentrifugebuisje gelabeld als C7. Dit zal worden gebruikt als de topstandaard. Label zes polypropyleen microcentrifugebuisjes als C1 tot en met C6. Voeg 75 microliter assaybuffer toe aan elk van deze buisjes.
Breng vervolgens 25 microliter van de topstandaard, C7, over naar de C6 buis en meng goed door te vortexen. Dit zal de C6 standaard zijn. Ga door met het uitvoeren van seriële een-op-vier verdunningen, door voor elke buis een nieuwe pipettetip te gebruiken om 25 microliter van de vorige standaard toe te voegen aan de 75 microliter assaybuffer in de volgende laagste standaardbuis.
Volg elke toevoeging door te vortexen. Gebruik assaybuffer als de nul picogram per milliliter standaard. Om de assay uit te voeren, laat alle reagentia op kamertemperatuur opwarmen voor gebruik.
Polypropyleen filterplaten worden gebruikt in deze demonstratie. Het is absoluut essentieel dat de plaat rechtop wordt gehouden tijdens de gehele assayprocedure, inclusief de wasstappen, om het verlies van de parels te voorkomen. Bevochtig het filterpapier door 100 microliter 1X wasbuffer toe te voegen aan elke put en laat de platen een minuut staan op kamertemperatuur.
Verwijder het buffervolume door de vacuümmanifold te gebruiken. Dep overtollig wasbuffer van de bodem van de plaat door de plaat op een stapel schone papieren handdoeken te drukken. Plaats de plaat vervolgens op de omgekeerde plaatdeksel.
Voor celkweeksupernaten, voeg 25 microliter assaybuffer toe aan alle putten. Voeg 25 microliter van elke standaard toe aan de standaardputten. Tot slot, voeg 25 microliter van elk monster toe aan de monsterputten.
Vortex de gemengde parels gedurende 30 seconden. Voeg vervolgens 25 microliter van de gemengde parels toe aan elke put, terwijl de fles met parels af en toe wordt geschud om neerslaan van de parels te voorkomen. Verzegel de plaat met een plaatverzegeling.
Eenmaal verzegeld, wikkel de hele plaat, inclusief het omgekeerde plaatdeksel, in aluminiumfolie. Plaats de plaat op een plaatshaker, zet deze vast en schud gedurende twee uur op kamertemperatuur bij ongeveer 500 RPM. Plaats de plaat zonder omdraaien op de vacuümmanifold en breng de vacuüm aan zoals eerder.
Voeg vervolgens 200 microliter 1X wasbuffer toe aan elke put. Verwijder de inhoud van de assayplaatputten door vacuümfiltratie. Dep overtollig wasbuffer van de bodem van de plaat met een absorberend pad of papieren handdoeken voordat u deze stap nog een keer herhaalt.
Voeg vervolgens 25 microliter detectieantilichamen toe aan elke put. Na het verzegelen van de plaat met een nieuwe plaatverzegeling, wikkel de hele plaat, inclusief het omgekeerde plaatdeksel, in aluminiumfolie. Plaats de plaat op een plaatshaker en schud gedurende één uur op kamertemperatuur bij ongeveer 500 RPM.
Zonder te vacuümen, voeg 25 microliter streptavidin-fycoerytrinereagens rechtstreeks toe aan elke put. Verzegel en wikkel de plaat zoals eerder. Plaats de plaat vervolgens op een plaatshaker en schud gedurende 30 minuten op kamertemperatuur bij ongeveer 500 RPM.
Na twee keer het vacuümfiltratiestap herhalen, voeg 200 microliter 1X wasbuffer toe aan elke put. Re-suspendeer de parels op een plaatshaker gedurende één minuut. Gebruik een multikanaals pipet om de monsters van de filterplaat over te brengen naar FACS-buisjes om de monsters op een flowcytometer te lezen.
Start de flowcytometer en acquisitiesoftware op volgens de instructies van de fabrikant die bij het instrument worden geleverd. Maak een stipplot met voorwaartse verstrooiing op de X-as en zijwaartse verstrooiing voor de Y-as. Stel voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing in op lineaire modus.
Vortex de fles met ruwe parels die in het kit zijn opgenomen gedurende 30 seconden om de parels opnieuw te suspenderen. Breng 400 microliter van de ruwe parels over naar een nieuw FACS-buisje. Stel de flowcytometer stroomsnelheid in op laag.
Laat de ruwe parels lopen en pas voorzichtig de versterking en spanning voor voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing aan zodat beide groottepopulaties van deze parels zichtbaar gescheiden zijn en gemakkelijk te gat. Pas de voorwaartse verstrooiingsdrempel aan om ongewenste gebeurtenissen uit te sluiten. In de voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing plot, teken een poort die alle parelpopulaties omvat.
Geef de poortbevolking van de parels weer vanuit de voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing plot op de tweede stipplot met PE op de X-as en APC voor
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het kwantificeren van meerdere cytokine-doelen gelijktijdig in weefselkweeksupernaten van gestimuleerde muis splenocyten met behulp van een multiplex parelketting-gebaseerde immunoassay en flowcytometrie. Deze techniek maakt de analyse van unieke cytokine-profielen mogelijk die cruciaal zijn voor het begrijpen van immuunresponsen in verschillende ziektecontexten.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Cytokine-profilering
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Cytokines spelen een essentiële rol in de immuunrespons.
- Traditionele ELISA-methoden vereisen grotere monstervolumes en kunnen leiden tot nonspecifieke binding.
- Multiplex-assays maken gelijktijdige meting van meerdere doelen mogelijk.
- Deze methode verbetert de efficiëntie en vermindert monsterverspilling.
Doel van het onderzoek
- Om meerdere cytokinen in een enkele assay te kwantificeren.
- Om cytokine-profielen te identificeren die geassocieerd zijn met specifieke immuunresponsen.
- Om de nauwkeurigheid en efficiëntie van cytokinemeting te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van antilichaam-geïmmobiliseerde parels en standaarden.
- Gebruik van polypropyleen filterplaten voor uitvoering van de assay.
- Flowcytometrie voor dataverwerving en analyse.
- Seriematige verdunning voor standaardvoorbereiding om nauwkeurigheid te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van meerdere cytokinen uit muis splenocytensupernaten.
- Demonstratie van verminderde monstervolumevereisten vergeleken met ELISA.
- Duidelijke cytokine-profielen voor gestimuleerde immuunresponsen geleverd.
- De effectiviteit van de methode gevalideerd door flowcytometrische analyse.
Conclusies
- De multiplex parelketting-gebaseerde immunoassay is een betrouwbare methode voor cytokinekwantificering.
- Deze benadering kan onderzoek in de immunologie en aanverwante gebieden faciliteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen het bestuderen van cytokine-profielen in verschillende ziektetoestanden omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Multiplex bead-based immunoassays enable simultaneous quantification of multiple cytokines from minimal sample volumes, supporting high-content immune profiling in early discovery. This platform enhances predictive confidence in immune pathway interrogation and accelerates target validation for immunology-focused portfolios. The approach reduces sample consumption and increases throughput, directly impacting decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive cytokine profiling to clarify immune pathway activation under diverse stimulatory conditions.
- Supports functional target validation by quantifying multiple immune mediators in parallel.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing differential cytokine signatures linked to disease-relevant immune responses.
- Improves predictive confidence for advancing immunomodulatory targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed assay systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible cytokine measurements essential for assay standardization.
- Enables high-throughput screening readiness with reduced sample input requirements.
- Supports platform reuse across multiple immune targets and conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cytokine profiling outputs with disease-relevant immune biomarkers for translational continuity.
- Provides data continuity from in vitro discovery through preclinical immune response validation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking cytokine signatures to functional immune outcomes.
- Enhances predictive de-risking for immunology-focused therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplex immunoassay platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical immune response validation, supporting iterative hypothesis testing and data-driven triage.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing and pathway clarification via simultaneous cytokine quantification.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for reliable compound evaluation and assay scalability.
- Analytics: Generates multiplexed readouts and standard curves for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity from in vitro to preclinical models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse immune profiling applications across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable multiplexed assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing sample and reagent use.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, gating, and data analysis.
- Needs access to flow cytometers and compatible analytical software for multiplex bead detection.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay setup and data interpretation.
- Adaptable to various immune cell models and stimulation conditions with appropriate validation.
- Dependent on consistent standard curve generation and careful sample handling to ensure data quality.
